1. Metoda fotodynamiczna w zastosowaniu do
diagnozy i terapii chorób nowotworowych.
Perspektywy i ograniczenia.
Alfreda Padzik-Graczyk
Instytut Optoelektroniki WAT,
Pracownia Biochemii
Kaliskiego 2 00-908 Warszawa
2. HISTORY
1900 - first observation of the photodynamic effect by C. RAAB
1924 - enhanced accumulation of endogenic dyes in cancer
tissue
- A. POLICARD
1960 - first application of the HPD dye for diagnostic
purposes - R.B. LIPSON
1975 - first observation of cancer tissue inactivation using the
HPD dye and light - T.D. DOUGHERTY
1978 - 1980 first clinical application.
By the end of 1986 - 3000 patients treated by this method.
Evaluated number of treatments (PDT applications) -
3. Photodynamic Therapy - General „Statements"
Photodynamic therapy (PDT) is a new cancer treatment modality, which can be
used both for diagnostic and therapeutic purposes.
PDT selectively destroys cancer cells and tissues by an interaction of absorbed
visible light with a photosensitizer retained in tumors.
PDT reąuires 3 components:
* photosensitizer (dye, e.g. HpD, P II) selectively accumulated in
tumor;
* molecular oxygen;
* yisible light low power density with appropriate wavelength.
PDT is a very selective, low invasive method: side-effects arę low and
efficiency is high (esp. for early stages).
Coutaneous photosensitivity is the only one known side- and late-effect of
PDT.
The same dyes and light sources (lamps & lasers) can be used for early
cancer detection: fluorescence „reddish hue" decorates the neoplastic tissue.
4.
5. SENSITIZER
Light
* SENSITIZER
Type l Type 2
SubstrateRADICALS
{Oxy-products} {Oxy-products}
1. Peroxides
2. Epoxides
3. Diols, di-ketones
4. Organosulfide oxides
5. Phenols
1. Peroxides
2. Epoxides
3. Diols, di-ketones
4. Organosulfide oxides
5. Phenols
Two types of photooxidation reactions involving the excitation
of a sensitizer molecule by light
* JAMES B. MITCHELL, JOHN A. COOK AND ANGELO RUSSO
3
O2
1
O2
6. BIOLOGICAL BASIS FOR PHOTOTHERAPY
Figure 4b Dlagraoimatic repretcmation of a mamma!ran ccii and hę tubccllular componcnis
-*'hich hsvc bccn rcporicd (o bc damagcd by PDT. inscn of mitochondrion was kindly contributcd by Drt
R. Hilfand
shows thc Iocationof3 mitochondrial cnzymcs(cytochromecoxidasc, succinatc
dchydrcg,-nasc(
F0
F; syntłmc) ihai havc bccn shown io bc inhibitcd following PDT.
12. AMINOACID DERIVATIVES OF PROTOPORPHYRIN -
PP(dAA) : NEW CLASS OF DYES FOR PDT
Why these compounds?
• there is a selective mechanism of interaction of different
aminoacid residues of PP(dAA) with cellular receptors of
various tissues;
• aminoacid side-chains mąkę the sensitizer penetration
into malignant cells much morę effective;
• aminoacid derivatives of protoporphyrine are very efficient
photosensitizers both In vitro and In vivo: similarly to the
protoporphyrin ring they retain high quantum yield of fluorescence
(diagnosis) and reveal high efficiency of singlet oxygen
generation (therapy);
• aminoacid derivatives of protoporphyrin also contain double
arginine side-chains - this mąkę them perfectly water-soluble
(they can be stored in a dried form - this has its potential
for clinical applications).
15. Efficiency of destruction (%) of neoplastic cells sensitized
by selected PP(dAA)2
Arg2
derivatives (light dose of 150
J/cm2
, λ= 360-400 nm).
PP(Asp)2
Arg2
PP(Met)2
Arg2
PP(Phe)2
Arg2
PP(Ser)2
Arg2
PP(Ala)2
Arg2
HpDArg2
Compound
SoTNB2aBT5cMew-132DETAMCFL1M45MTC/c1GRMT/F6
HBT-
39w
KBHep-2HelaT-47D
--99791009955,1307552845362356
-------9275929510095905
---9797,198,899,5-50891007989154
95,281,482,59995,698,51006388781007585813
88,280,699,89999,510099,58810089889795752
99,799,899,328,398916083671001008582751
Cell linesNo
1. T-47D -Effusion human
2. Hela - Cervix carcinoma, human
3. Hep-2 - Epidermoid carcinoma larynx, human
4. KB - Epidermoid carcinoma orał, hunian
5. HBT-39w - Breast tumor
6. GRMT/F6 - Mammary tumor from GR mouse
7. M45MT/c1 - Mammary tumor from C3H mouse
8. L1- Sarcoma L1, mouse
9. MCF - Mammary carcinoma female
10. DETA - Colon carcinoma, human
11. Mew-132 - Melanoma, human
12. BT5c - Glioma cells, rats
13. NB2
a - Neuroblastoma, mouse
14. SoT - Bladder carcinoma, human.
Celi lines were obtained from : Cancer Center, Warsaw (Poland), Cancer Institute, Wena (Austria), FIBIGER
Laboratory (Denmark).
16. Fot. l - 4.
Hodowla komórek nowotworowych linii HeLa eksponowanych na protoporfirynę PP(Arg)2
w stężeniu l O"3
mola/L
przez okres l min, 15 min, 30 min i 45 min. Fluorescencję przedstawiono w umownym czerwonym kolorze.
Powiększenie 600 x.
17. Fluorcscencja w komórkach
nowotworowych EJ-138 po stosowaniu
PP(Ala)2(Arg)2 w stężeniu 1x10-4
mola/L przez 24 godziny in vitro.
Powiększenie 600x.
Fluoresccncja w komórkach
nowotworowych EJ-138 po stosowaniu
PP(Ala)2(Arg)2
w stężeniu 1x10-3
mola/L
przez 24 godziny in vitro. Powiększenie
600x.
21. Change of luminescence intensity in tissue with
PP(Ala)2
Arg2
(Xexc=380-390 nm, emission 630-690 nm)
22. Fluorescence images of
superficial tumors after
injection of PP(Ala)2Arg2
a, b - MERKEL,
c - MELANOMA,
d - CARCINOMA MAMMAE
(λexc=390 nm,
2 mW/cm2
,
emission band 600-680 nm)
23. Raport z badań klinicznych wykonanych w okresie 1996 - 2003
Diagnostyka w rakach krtani
i płuc
Diagnostyka śródoperacyjna,
leczenie skojarzone z
chirurgią, leczenie stanów
nieoperacyjnych
Mezothelioma, rak
drobnokomórkowy, rak
wielkokomórkowy, ziarnicze
nacieki w śródpiersiu
ALA
Sensyphiryna
przetoczenia dożylne
220
62
Klinika Terakochirurgii Kierownik prof.
dr hab. n. med. Stanisław Jabłonka
Akademia Medyczna w Lublinie
Ca planoepitelialae nosogardła,
gardła
Choandriosarcoma
Ca spinocellulare
ALA
Sensyphiryna
18
Klinika Otolaryngologii Wydział
Stomatologii Akademii Medycznej
Kierownik
prof. dr hab. n. med. Andrzej Kukwa
Warszawa
Diagnostyka wczesnych
zmian oraz stanów
przednowotworowych
Diagnostyka zmian
wieloogniskowych
124 pacjentki -rak szyjki macicy
29 pacjentek -rak sromu
ALA
153
Katedra i Klinika Położnictwa i
Ginekologii II Wydział Lekarski
Akademii Medycznej Kierownik
prof. dr hab. n. med. Jerzy Stelmachów
Warszawa
Niemelanotyczne choroby
nowotworowe skóry i stanów
je poprzedzających np.
rogowacenie słoneczne, choroba
Bowena, rak podstawno
komórkowy i
kolczystokomórkowy oraz
rogowiak kolczystokomórkowy
ALA
210
Klinika Dermatologii Kierownik
prof. dr hab. Stanisław Zabielski
Wojskowy Instytut Medyczny Warszawa
Nowotwory Merkla, czerniaki,
nowotwory sutka, nowotwory
jajnika, jelita grubego, prącia,
przerzutu do skóry
PP(Ala):
Arg2
Sensyphiryna
50
Klinika Chirurgii Ogólnej i
Onkologicznej
Kierownik
prof. dr hab. n. med. Edward Stanowski
Wojskowy Instytut Medyczny Warszawa
UwagiRodzaj nowotworuFotouczulaczIlość pacjentówNieoczekiwany koniec formuły
W pięciu Klinikach w latach 1996-2003 stosowano metodę fotodynamiczną - 700 razy:
1. do diagnostyki ~370przypadków
2. w 70 przypadkach do diagnostyki śródoperacyjnej skojarzonej z leczeniem
3. do diagnostyki i leczenia -220 przypadkach - leczenie stosowano do niemelanotycznych nowotworów skóry
oraz do różnego rodzaju nowotworów z przerzutem do skóry jako leczenie paliatywne, lub jako leczenie
ostateczne w skutek niemożności zastosowania innych technik leczenia (nieoperacyjna mezothelioma).
24. Wpływ PDT na układ immunologiczny
Efekt leczniczy uzyskany w wyniku reakcji fotodynamicznej
powstaje w skutek niszczenia komórek rakowych w
procesie stresu oksydacyjnego oraz szeregu reakcji
wtórnych, które również prowadzą do śmierci komórki.
Do tych wtórnych należą:
zniszczenie naczyń krwionośnych w guzie i podścielisku
guza oraz reakcja układu immunologicznego pacjenta.
25. • Substancje naczynioaktywne,
• Składniki dopełniacza,
• Kaskada krzepnięcia,
• Białka fazy ostrej,
• oraz proteinazy, peroksydazy, substancje
chemotaktyczne leukocytów, cytokiny,
czynniki wzrostu i inne immunoregulatory.
Proces zapalny wywołany reakcją PDT związany
jest z uwolnieniem szeregu mediatorów takich
jak:
26. Antynowotworowa reakcja komórek zapalnych
• Reakcja immunologiczna na PDT, wywołana
częściowym uszkodzeniem komórek w procesie
naświetlania,
• Zmiany wywołane w membranach organelli wewnątrz
komórkowych, które powstają w czasie reakcji PDT, z
użyciem większości fotosensybilizatorów, są przyczyną
szeregu reakcji mogących doprowadzić do śmierci
komórki po pewnym czasie po zakończeniu
naświetlania.
27. Występowanie klonów zaktywowanych
komórek nie jest ograniczone tylko do miejsca
gdzie nastąpiła reakcja PDT ale może
obejmować również rozsiane przerzutowe
ogniska tego samego nowotworu.
Tak więc chociaż leczenie za pomocą PDT jest
ograniczone do guza, to jego działanie wywołuje
efekty ogólnoustrojowe związane z rozwojem
reakcji immunologicznej.
28. Aktywacja różnych podgrup limfocytów
dotyczy również tych zlokalizowanych w innych
tkankach takich jak śledziona, czy gruczoły
limfatyczne i działa przez pewien czas po
zakończeniu naświetlania.
Te zaktywowane przez PDT podgrupy
limfocytów posiadają pewien „rodzaj pamięci"
PDT. W przeciwieństwie do innych terapii
antyrakowych może to wywoływać odporność
nawet przeciw mniej immunogennym
nowotworom.
29. Najważniejszą zasadą współczesnych metod
stosowanych w leczeniu guzów jest dążenie do
zniszczenia całej populacji komórek nowotworowych
tzw. „ total cell kill”.
Żadna jednak ze stosowanych metod nie spełnia tego
zadania. Jeśli zniszczymy masę nowotworową nawet
w 99,9 % to przy całkowitej masie guza równej 1 g,
pozostaje jeszcze około 106
żyjących komórek
nowotworowych.
30. 1. Szybkość podziału komórek nowotworowych.
2. Zdolność komórek do życia w warunkach braku
kontaktu z innymi komórkami.
3. Odporność na leki.
4. Selekcja klonalna.
5. Nagromadzenie mutacji
6. Oddziaływanie komórek z macierzą międzykomórkową.
7. Oddziaływanie komórka zdrowa - komórka uszkodzona
o charakterze uszkodzenia postępującego.
Efekt końcowy terapii zależy od wielu
czynników takich jak:
31. W eksperymentach in vitro wykazano
występowanie oddziaływania między komórką
nieuszkodzoną i uszkodzoną wskutek działania np.
efektu termicznego lub fotodynamicznego.
Jest to tzw. efekt „przygodnego widza" lub „efekt
towarzyszący„ (bystander effect).
32. Model propagacji uszkodzenia zakłada możliwość
przekazywania uszkodzenia od komórek uszkodzonych
działaniem efektu fotodynamicznego do komórek
zdrowych, które ulegają uszkodzeniu, a następnie
przekazują to uszkodzenie do następnych komórek.
W badaniach Dahle i wsp (1997, 2000, 2001) wykazano, że
efekt ten nie jest specyficzny i występuje roznie w różnych
liniach komórkowych. Wykazano, że dla fotouczulaczy
rozpuszczalnych w wodzie „przenoszenie uszkodzenia"
związane jest z obecnością fotouczulacza w cytoplazmie
i zależne jest od połączeń typu GjIC (Gap junction).
GjIC - połączenie międzykomórkowe typu Gj
33.
34. RECEPTORY to wyspecjalizowane
białka odbierające informacje ze środowiska
zewnątrzkomórkowego i przekazujące je do
odpowiednich elementów efektorowych
komórki.
Naturalne substancje sygnałowe posiadające taką
budowę, że mogą się wiązać z receptorem
nazywamy LIGANDAMI.
35. Ligandy
Wiązanie się naturalnych ligandów ma
charakter kowalencyjny, odwracalny.
Niektóre syntetyczne ligandy wiążą się w
sposób nieodwracalny.
W wyniku wiązania się liganda może dojść
do pobudzenia lub blokowania receptora.
36. Pobudzenie - blokowanie
Pobudzenie następuje wówczas, gdy dojdzie
do zmiany konformacyjnej białka
receptorowego w efekcie której dojdzie do
zmiany procesów metabolicznych komórki,
zmiany potencjału błonowego lub ekspresji
odpowiednich genów.
AGONIŚCI
37. Pobudzenie - blokowanie
Blokada następuje wówczas, gdy ligand
przyłączając się do receptora nie zmienia
jego konformacji oraz uniemożliwia
naturalnym substancjom sygnałowym
połączenie z receptorem i jego pobudzenie.
ANTAGONIŚCI
38. Klasyfikacja receptorów
Receptory bezpośrednio związane z kanałem
jonowym, jonotropowe.
Receptory związane z układem efektorowym
poprzez białko G, metabotropowe.
Receptory związane z enzymem
Receptory wewnątrzkomórkowe
39. Receptor benzodiazepinowy
PBR - Peripherial Benzodiazepine Receptor-wystepuje w
różnych narządach: płuca, wątroba, nerki, obwodowy
układ nerwowy.
Bierze udział w steroidogenezie, immunomodulacji,
transporcie porfiryn, biosyntezie hemu, administruje
aldosteronem, dexametazonem
CBR - Central Benzodiazepine Receptor -występuje w
centralnym układzie nerwowym (CNS)
40. PBR
PBR to proteina o c.cz. 18 kD zawierająca 169
aminokwasów, posiada własności hydrofobowe i jest
bogata w tryptofan. Posiada ładunek dodatni o pI=9,6.
PBR klonowany dla różnych gatunków w 80% jest
podobny składem do białka ludzkiego.
Białko to posiada 5 helis α ułożonych warstwowo tworząc
lipidowe biwarstwy.
PBR może tworzyć trimeryczny kompleks z 32kD kanałem
jonowym (VDAC) oraz z 30 kD nukleotydem
adeninowym.
PBR oddziałuje również z innymi proteinami jak 10 kD
PRAX-1, oraz proteiną o 240 kD, która bierze udział w
oddziaływaniu proteina-proteina.
41. Czynniki wpływające na ekspresję PBR
Catecholaminy regulują gęstość PBR w szyszynce, lecz
nie w mięśniu sercowym
Zarówno hypo- jak i hypertyroidyzm wpływa na ekspresję
PBR w sercu, nerkach, wątrobie i jądrach
Również interleukiny, dopamina, serotonina i
norepinerfina są modulatorami PBR i wpływają na jego
ekspresję
stany neuropatologiczne takie jak stres, padaczka,
encefalopatia Wernicka, choroba Alzheimera, choroba
Huntingtona, urazy, wpływają na zmianę ekspresji PBR
42. Rola PBR w komórkach nowotworowych
Gęstość receptora PBR można modulować poprzez leki
(furosemid zwiększa gęstość PBR).
Największą gęstość receptorów PBR mają komórki tkanek
nowotworowych. Nowotwory jajnika, wątroby, jelita,
gruczolakoraki oraz glejaki wykazują wzrost gęstości PBR
proporcjonalnie do zaawansowania choroby.
W wielu wypadkach ekspresja PBR jest skorelowana ze
złośliwością nowotworu i pozwala mówić o możliwości i
szybkości proliferacji. Odnosi się to w szczególności do
nowotworów sutka, jajnika i wszystkich nowotworów
hormonozależnych.
PBR bierze udział w proliferacji komórek w postaci
kompleksów z ligandami: PK 11195 i Ro5-4864 oraz
porfirynami
PK 11195-karboksyamidoizocholina
43. PBR w PDT
Białka biorące udział w powstawaniu przepuszczalności
błonowej:
PT(pore) -permeability transition pore, kinaza kreatynowa,
transfaktor nukleotydu adeninowego (ANT), cyklofilina D,
obwodowy receptor benzodiazepinowy PBR i kanał
jonowy napięciowo-zależny (VDAC).
PDT uszkadzając heksokinazę może inhibitować fosforylację
glukozy, hamując proces glikolizy, uposledzając główny
szlak metaboliczny w komórce.
Fotosensybilizator musi być związany z heksokinazą, zaś ta
musi być związana z PBR w PT(pore)
44. PBR w PDT
PBR jest wrażliwy na PDT ponieważ transportuje cholesterol
do matrycy mitochondrialnej, gdzie jest zużywany do
syntezy steroidów, a pochodne porfirynowe łatwo się z
nimi wiążą. Verma wykazał, że komórki zawierające
zwiększone stężenie PBR są bardziej wrażliwe na PDT niż
komórki zdrowe.
45. Wpływ ligandów PBR na komórki nowotworowe
indukcja apoptozy poprzez otwieranie PT(pore)
zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie G1
zwiększają efektywność cytostatyków
inhibitują białko Bcl-2, HA 14-1
niektóre ligandy powodują aktywację kaspazy 9 i
produkcję ROS, tłumienie aktywności białka Bcl-2 i
translokację Bax do mitochondriów
uwalnianie z mitochondriów cytochromu C. Przy
aktywacji kaspazy 9 nie obserwuje się obniżenia
potencjału błony mitochondrialnej
47. Reasumujac mozna powiedziec, że w swietle
dostepnych badan na dzien dzisiejszy terapia
fotodynamiczna nie dziala tylko miejscowo w
miejscu stymulacji swietlnej ale ma
skomplikowane dzialanie ogólnoustrojowe.
48. LITERATURA
1 N. L. Oleiniek, R. L. Morris, I. Belichenko „The role of apoptosis in response to photodynamic therapy,
what, where, why, and how”.; Photochemical and Photobiological Sciences 2002 vol1 nr 1 s 1-21 (rev)
2 Mladen Korbelik, Jinghai Seen, Ivana Cecik „Photodynamic therapy- induced cell surface expression and
release of heat shock proteins: Relevance for tumor response.; Cancer Res. 2005 (3) nr 1018-1026
3 Z. Tong, G. Singh, K. Valeric, A. J. Rinbow „Activation of the stress- activated INK and p38 MAP
kinases in human cells by Photofrin - mediated photodynamic therapy” J. Photochem. Photobiol. Ser Biol
2003, 71, 77-85
4 S. Herman, J. Klaechman, U. Gafter, B. Sredni, Z. Malik „Photofrin II induces cytokine secretion by
mouse spleen cells and human peripheral mononuclear cells” Immunolopharmacology 1996, 31, 195-204
5 A Verma, J. S. Nyc, S. H Smyder „ Porphyrins are endogenous ligands for mitochondrial (peripheral-
type)benzodiazepine receptor” Proc. Natl. Acad. Sci. 1987, 88, 2256-60
6 M. Mesenhöller, E. K. Matthews „A key role for the mitochondrial benzodiazepine receptor in cellular
photosensitisation with 5-aminolevulinic acid” European Journal of Parmocology 2000, 406, 171-180
7 K,. Frei, H.M. Bonel, H. Frick, H. Walt, R. A. Steiner „Photodynamic detection of diseased axillary
sentinel lymph mode after oral application of aminolevulinic acid in patients with breast cancer” Brit.
Journ. Of Cancer 2004, 90, 805-809
8 M. Kwitniewski, D. Kunikowska, B. Dera-Tomaszewska, E. Tokarska-Pietrzak, H. Dziaduszko,
A. Graczyk, R. Głośnicka „ Influence of diamino acid derivatives of porphyrin IX on mouse
immunological system: Preliminary results” J. Photochem. Photobiol. Ser Biol 2005 81 129-135
