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- 1. WHITE BIOTECHNOLOGY “Strategie per batteri in cerca di occupazione” Nuove strategie di risanamento Anna Rosa Sprocati
- 2. BIORISANAMENTO Unica tecnologia in grado di trasformare completamente i contaminanti reimmettendo gli elementi nei cicli biogeochimici • NON SEMPRE POSSIBILE • Richiede STUDI DI FATTIBILITA’ Albero decisionale per uno studio di fattibilità di bonifica biologica Campionamenti di suolo dal sito contaminato CAMPO Caratterizzazione chimica ed ecotossicologica.. Rilevamento delle specie botaniche eventualmente presenti nel sito Test di vitalità della flora microbica. Test sulla presenza di attività metabolica, costitutiva o inducibile, per la trasformazione dei contaminanti presenti negativo Determinazione del potenziale di trasformazione dei contaminanti presenti Aggiunta di microorganismi capaci di trasformare i metalli LABORATORIO Aggiunta di specie botaniche accumulatrici di metalli Determinazione dei fattori limitanti (es:, biodisponibilità dei metalli mediante la misura della loro mobilità.) negativo Necessità di supporto per l'incremento dell'attività microbica (es: pretrattamenti, crescita della biomassa microbica in bioreattori di laboratori) oppure Necessità di impiegare metodi alternativi negativo Ottimizzazione delle condizioni ambientali (es: T, pH, fattori di crescita, concentrazione dei contaminanti,) negativo Test ecotossicologici per la valutazione della tossicità finale Esperimenti in condizioni reali su scala di microcosmi con diverse condizioni sperimentali Test in condizioni reali su piccola scala CAMPO Applicazione pratica
- 3. Possible ways to activate the natural bioremediation potentials Experimental activity
- 4. RATIONAL • Microbial processes - responsible for the biodegradation of organic contaminants and for the transformation and detoxification of inorganic contaminants - are the driving forces behind natural attenuation. • Nevertheless the accumulation in the environment of highly toxic pollutants emphasises the fact that m.o., by themselves, are insufficient to protect the biosphere from the flux of the anthropogenic pollution.
- 5. • They can be harnessed in “enhanced bioremediation technologies”. • Harnessing the natural degradation potentials present in the environmental matrices is the current challenge to be addressed by bioremediation research.
- 6. • "niche adjustment", by the inoculation of competent microorganisms into these systems (bioaugmentation) Possible ways to activate these potentials • changing physico-chemical parameters: pH, T, oxygen, electron donors or acceptors, nutrients, etc. (biostimulation, bioventing etc) Offers a way to provide specific microbes in sufficient numbers to complete the biodegradation
- 7. • Natural attenuation • Biostimulation • Bioaugmentation Peculiarity of “bioremediation” is to restore an environmental matrix (e.g. soil, sediment, water) preserving its quality and thus its functions. restore while preserving
- 8. 8 Lines of evidence recommended to demonstrate that bioremediation of a contaminated system has taken place : • reduction in contaminant mass or concentration with time; • indirect evidence of transformation provided by changes in hydrogeologic or geochemical data (soil and groundwaters); • direct evidence of biodegradation provided by in situ or mesocosms or microcosm studies; • evidence of drop in ecotoxicity
- 9. Biostimulation/Bioaugmentation controversy Critical points: • Biostimulation introduces supplementar nutrients in the environment Addition of nutrients to a soil containing aged contaminations might negatively affect the indigenous microbial population adapted to low nutrient conditions (Margesin and Schinner, 1999 World J. Microbiol. Biotechnol. 15, 615–622) • Bioaugmentation has to face problems of RAPID DECLINE/SURVIVAL of introduced microorganisms(microbiostasis)and DISPERSION Hence Detailed site specific characterization studies are needed prior to deciding on the proper bioremediation method.
- 10. “Black-box approach” single key criterion: degradation ability of strains TO “knowledge-based approach” relative spatial and temporal abundance of potential source populations and their ability to tolerate the prevailing conditions in target habitats FROM
- 11. Bioaugmentation controversy Benefit & Failure • Apparent semplicity • Failures (Goldstein, 1985, Stephenson and Stephenson 1992, Bouchez 2000, Vogel and Walter 2001, Wagner- Dobler 2003) • The interpretation of the results often suffers from a lack of ecological data about the fate and activity of the inoculated m.o. and about the relation of the indigenous microbial communities • The ecological background constitutes a major barrier in the successful of bioremedition performance • This is especially true for complex biotopes Most degradation potentials are ubiquitous but competent indigenous microbes are usually present in very small numbers
- 12. FACTORS associated with Bioaugmentation • Pollutants characteristics • (concentration, bioavailability,toxicity ) • Physico-chemical environmental characteristics • Reducing the microbial activity: temperature, humidity, ionic strength • Restricting the mass transfer of the contaminants to m.o.: clay and organic matter content. • Microbial Ecology • energy flux, indigenous activity, predators, competitors • Microbiology • co-substrates, genetics of relevant m.o., enzyme stability and activity • Methodology • Strains selection, concentration and methods of the inoculation , inoculum etherogeneity Vogel T.M., Current Opinion in Biotechnology, Volume 7, Issue 3, June 1996, Pages 311-316
- 13. Bioaugmentation= Increase of microbial diversity Increasing the metabolic capabilities of the microbiota present within an environmental matrix for a better removal of pollutants How to interpret this biodiversity ?
- 14. WHAT AND HOW ? • Ecological studies should attempt to delineate the main energy fluxes and which group(s) of species plays quantitative key roles in the system. (Pareto's law, i.e. 20% of the species govern 80% of the energy flux of the ecosystem) • Bioaugmentation should aim at the rearrangement of the group(s) of organisms dominantly involved in the overall energy flux so that specific catabolic traits necessary for the clean up of pollutants are part of that active group Winnie Dejonghe et al., 2001. Environmental Microbiology 3, 10: 649-657
- 15. It is time to initiate more comprehensive approaches to find common rationales in bioremediation
- 16. PROPOSED APPROACHES TO ENHANCE PROCESS EFFICIENCY 1. Terry J. Gentry 2004 Crit. Rev. in Environ. Science and Tech., 34, 447-494 • Bioaugmentation with cells encapsulated in a carrier such as alginate; or naturally occurring capsules from earthworm eggs • Rhizosphere bioaugmentation • Phytoaugmentation 2. Singer A.C. et al., 2005. Trends in Biotechnology 23, 2: 74-77 • Coordinated research efforts on the exploitation of Heirloom species • In rhizo-directed strain selection • Priming 3. U. Welander, Soil and Sediment Contamination, 2005, 14: 281-291 • Cold adapted m.o might be adapted to other conditions prevalent at low temperature: low nutrient availability, low water activity 4. S. Wuertz et al. 2004. Water Science & Technology Vol 49 No 11-12 pp 327–336 • Biofilm architecture: if certain spatial structures can be forced metabolic processes may be enhanced 5. S. Venkata Mohan et al., Rev. Environm. Sci. Biotech 2006 5:347-374 ) • Bacteria chemotaxis The molecular basis of this phenomenon is a fertile and useful area for future research, particularly in regard to soil contaminated with PAHs. 6. Ian P. Thompson et al., Environmental Microbiology 7, 7: 909-915 • Inoculation of strains containing mobile genetic elements (MGE) might provide a mechanism for the introduction of specific traits into microbial communities • .
- 17. • Saïd El Fantroussi, Spiros N Agathos (2005). Current Opinion in Microbiology 8,3 : 268-275 • Looking for microorganisms from the same ecological niche as the polluted environmental matrix. • The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with the relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards rational selection of effective inocula for bioremediation applications. • Watanabe K, et al., Environ Microbiol 2002,4:577-583.(activated sludge) • van der Gast CJ et al., Environ Microbiol 2004, 6:254-263(waste metal-working fluid) • Gentry TJ, Biodegradation 2004, 15:67-75 (activated soil) • Da Silva MLB, , Alvarez PJJ, Appl Environ Microbiol 2004, 70:4720-4726. (BTEX biodegradation following introduction of methanogenic consortia). • Lendvay JM, Environ Sci. Technol 2003, 37:1422-1431.(a chloroethene-contaminated aquifer) Saïd El Fantroussi, Spiros N Agathos (2005). Current Opinion in Microbiology 8( 3) : 268-275.
- 18. EXPERIMENTAL
- 19. • Isolation of microbial communities native to co- contaminated matrices and selection of strains resistant to heavy metals • Test for active (or inducible ) metabolism towards organic pollutants • Tailored Microbial Formula: Use of the strains in form of consortium for degradation of organic pollutants in the presence of heavy metals Use of PGP in association with plants Target Selected strategy • Co-contamination Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals • Heavy metals serious limiting factor in bioremediation technology
- 20. Based on the use of comparatively ‘high-throughput’ methods for molecular and physiological profiling • at community level • at single component- system level • Polyphase approach Classical Microbiology Molecular Biology ( r-DNA16S and 18S) Molecular Ecology (DGGE, t-RFLP) Globale Phenotype Analysis (BIOLOG TM system ) • Experimental systems for the Scale-up Biometers Microcosms Lysimeters METHODOLOGY
- 21. Proactive Development of Tailored Microbial Formula for Strengthening Natural Bioremediation Capabilities
- 22. 22 Bagnoli (Napoli): Disused metallurgic site Heavy Metals (mg/kg) OSS AGL LAM Cr 240 210 215 Ni 54 29 80 Zn 214 353 177 Co 5,4 5,9 4,1 Cu 65 129 117 As 34 118 41 Cd 1 2 1 Pb 249 345 227 Hg 0,6 0,6 0,3 Total heavy metals 825,7 1192,5 899,7 Organics (mg/kg) PCBs 1,703 0,067 1,241 PAHs 1,270 0,382 5,167 Total hydrocarbons (mg/kg) 4080 30 358 S.P. A.E. E.O. 0 1000 OSS TOXICUNIT MATRICES S.P. A.E. E.O. 0 10 90 100 AGL TOXICUNIT MATRICES S.P. A.E. E.O. 0 5 10 LAM TOXICUNIT MATRICES Attività respiratoria microbica -20 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 250 300 tempo (ore) Ossigenoconsumatomg/L OSS AGL LAM 0 200 400 600 800 1000 1200 0 48 96 144 192 240 288 336 384 time(hs) OpticalDensity590nm OSS AGL LAM 0 200 400 600 800 1000 1200 0 48 96 144 192 240 288 336 384 time(hs) OpticalDensity590nm OSS AGL LAM Microbial Community physiological profile ( Biolog ECO-plates)
- 23. 23 BACTERIAL STRAINS ISOLATED FROM THE SITE OF BAGNOLI identified by r-DNA 16S full gene sequencing Strain ID Strain ID Strain ID AGL1 Stenotrophomonas sp. LAM1 Pseudomonas jessenii OSS1 Bacillus licheniformis AGL2 Pseudomonas lutea LAM9 Pseudomonas resinovorans OSS2 Streptomyces sp. AGL3 Agrobacterium tumefaciens LAM11 Arthrobacter sp. OSS3 Promicrospora sukumoe AGL5 Arthrobacter sp. LAM18 Rhodococcus erythropolis OSS4 Bacillus megaterium AGL6 Agrobacterium tumefaciens LAM19 Arthrobacter sp. OSS5 Bacillus subtilis AGL7 Stenotrophomonas sp. LAM21 Acinetobacter calcoaceticus OSS8 Bacillus sp. AGL9 Pseudomonas sp. LAM22 Arthrobacter sp. OSS19 Bacillus sp. AGL10 Leucobacter komagatae LAM23 Exiguobacterium sp. OSS22 Bacillus megaterium AGL12 Microbacterium sp. LAM29 Delftia tsuruhatensis OSS24 Bacillus simplex AGL13 Pseudomonas putida LAM30 Bacillus cereus OSS25 Bacillus circulans AGL14 Pseudomonas putida LAM33 Pseudomonas fluorescens OSS26 Rhodococcus sp. AGL17 Acinetobacter calcoaceticus OSS27 Microbacterium sp. OSS28 Rhodococcus sp. OSS31 Paenibacillus polymixa OSS32 Paenibacillus sp. OSS33 Promicrospora sukumoe OSS34 Streptomyces heteromorphus OSS35 Bacillus sp. OSS42 Bacillus subtilis OSS45 Streptomyces levis OSS47 Streptomyces ghanaensis OF1 Gordonia polyisoprenivorans
- 24. 24 MIC Pb 0 1 2 3 4 5 6 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] MIC Cu 0 1 2 3 4 5 6 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] MIC Cd 0 1 2 3 4 5 6 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] MIC Ni 0 2 4 6 8 10 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] MIC Zn 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] MIC Co 0 2 4 6 8 10 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] Minimal Inhibition Concentration (MIC) MIC Cr 0 0,5 1 1,5 2 CH34 E.coli AGL1 AGL2 AGL3 AGL4 AGL5 AGL6 AGL7 AGL8 AGL9 AGL10 AGL11 AGL12 AGL13 AGL14 AGL15 AGL16 AGL17 AGL18 LAM1 LAM2 LAM3 LAM4 LAM5 LAM6 LAM8T LAM8F LAM9 LAM10 LAM11 LAM12 LAM13 LAM14 LAM15 LAM17 LAM18 LAM20 LAM21 LAM22 LAM23 LAM24 LAM26 LAM27 LAM28 LAM29 LAM30 LAM31 LAM32 LAM33 LAM34 OSS1 OSS2 OSS3 OSS4 OSS5 OSS7 OSS8 OSS14 OSS15 OSS17 OSS19 OSS22 OSS23 OSS24 OSS25 OSS26 OSS27 OSS28 OSS30 OSS31 OSS32 OSS33 OSS34 OSS35 OSS36 OSS39bis OSS40 OSS42 OSS43 OSS45 OSS46 OSS47 OSS48 OSS49 isolati [mM] Ralstonia metalidurans Escherichia coli Pb Cu Cd Co Zn Cr Ni
- 25. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Pb Cu Cd Ni Zn Cr Co AGL LAM OSS Heavy metals Resistances distribution Sprocati et al. in: Modern Multidisciplinary Applied Microbiology exploiting microbes and their interactions, Wiley-VCH: 488-493 (2006). Heavy metals distribution 0 50 100 150 200 250 300 350 400 mg/Kg Pb Cu Cd Ni Zn Cr Co AGL LAM OSS • The distribution of heavy metals resistances among the native strains corresponds in large part to the distribution of heavy metals in the soil, mostly for Cr and Pb; • Cr and Pb resistances are not frequent in nature These data suggest that : • this microbial population is the result of the selective pressure fostered by the heavy metals • it should be thus a stable population • this characteristic is a prerequisite to be a good candidate as inoculants for bioaugmentation
- 26. Biodegradation • Selection of strains able to degrade PHAs, diesel, crude-oil • Biosurfactants producers Heavy metals resistances (Pb, Cr,Cd, Zn, Mn, Co, Cu) • 19 strains multiple resistances • 50 strains show resistance (MIC ) similar to Ralstonia m. CH34 • 33 strains show resistance (MIC ) higher than Ralstonia m. CH34 ENEA-OSS 3 Microbial Communities (AGL-LAM -OSS) Different Tailor-made Microbial Formula
- 28. SOIL BIOREMEDIATION FEASIBILITY DIESEL 1% (w/v) and heavy metals (mg/Kg) Pseudomonas jessenii LAM1 Pseudomonas resinovorans LAM9 Arthrobacter sp.A3Z-18 LAM11 Rhodococcus sp. LAM18 Arthrobacter sp.A3Z-18LAM19 Arthrobacter sp. JCM 13 LAM22 Exiguobacterium sp. LAM23 Delftia sp. LFJ11-1, LAM29 Bacillus sp.AH 540 LAM30 Pseudomonas sp LAM33 ENEA-LAM Degradation 75% 42 days Mn Zn Cr As Pb Cd Cu 1044 115 12 20 48 0,12 13,90 Abiotic control: soil+ m.o.+diesel+HgCl2 Biotic control :soil +m.o. Treated:soil+m.o.+diesel
- 29. 29 0 20 40 60 80 100 C 12 C 13 C 14 C 15 C 16 C 17 C 18 C 19 C 20 i-C 15 i-C 16 i-C 17 i-C 18 pristane phytane phenantrene removalefficiency(%) abiotic control 42 days treated 15 days treated 42 days
- 30. Biotic control Spiked soil Time (days) N° of fragments Total area (FUx103) N° of fragments Total area (FU x103) T0 21 360 21 360 T15 14 191 17 190 T42 10 180 31 277 T-RFLP data : raise in diversity of bacterial species • Most of the inoculated strains have survived • The partial DO biodegradation and the subsequent availability of intermediate metabolic compounds allowed the development of a succession of the native microbial strains which played a role in the biodegradation of DO and phenantrene
- 31. ENEA-OSS Bacillus, Rhodococcus, Gordonia, Microbacterium, Paenibacillus, Promicromonospora, Streptomyces ENEA-OSS Control RT: 8,00 - 55,00 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 22000000 24000000 26000000 28000000 30000000 32000000 34000000 36000000 38000000 40000000 42000000 I n t e n s i t y fitano pristano C14 C15 C16 C18 C17 NL: 4,25E7 TIC MS ICIS greggio T0 RT: 8,00 - 55,00 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Tim e (min) 0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000 9000000 10000000 11000000 12000000 13000000 14000000 15000000 16000000 17000000 18000000 19000000 20000000 21000000 22000000 I n t e n s i t y fitano pristano NL: 2,26E7 TIC MS ICIS greggio Tm ezzi 3 weeks Iranian crude-oil 2%(w/v) in sea water 70% degradation
- 33. TERRESTRIAL INTACT SOIL CORE MICROCOSM ASTM E1197-87(2004) 33 Seems fit to represent the soil ecosystem at both microbiological and biochemical scale since it preserves : • The structural and functional integrity of the native ecosystem • The spatial heterogeneity of biotic, physical and chemical factors of the native ecosystem
- 34. Bioaugmentation: Microbial Formula ENEA-LAM/OSS LAM1 Pseudomonas jessenii LAM9 Pseudomonas resinovorans LAM33 Pseudomonas sp. LAM18 Rhodococcus sp. LAM11 Arthrobacter sp. LAM19 Arthrobacter sp. LAM22 Arthrobacter sp. LAM23 Exiguobacterium sp. LAM29 Delftia sp. LAM30 Bacillus sp. OSS31 Paenibacillus polymixa OSS42 Bacillus subtilis Experimental design Over time 104 days Treated: soil + MF+ DO+ HM Controls: soil soil + MF soil + DO HM soil + DO + MF Experimental design Start 14th of July 2008 End 28th of October 2008 Contamination: Diesel: 1% w/v Metals: Pb (500 mg/Kg ) and Zn (1000 mg/Kg)
- 36. AIM : Evaluation of the consortium ENEA-LAM as bioaugmentation agent for co-contaminated soils • extent of Diesel-HC degradation • capacity to degrade Diesel-HC in the presence of heavy metals • effect of M.O. on the mobility of heavy metals • effect on the ecotoxicity
- 37. PARAMETERS Chemical , Geochemical and Physical characterisation • pH, T, • C and N content • Soil granulometry and composition • Diesel-HC Gas-mass analysis • Heavy metals content and mobility Microbiological characterisation • Molecular (PCR-DGGE) and Physiological (Biolog system) profiling at community level • l Microbial Load • Isolation and identification of the culturable fraction • Lipase activity Ecotoxicology • In progress
- 38. 0-10 10-20 0-55 60 Deep total -C % (w/w) organic- C % (w/w) total -N % (w/w) ORI 0-10 cm 2,42 1,96 0,2 ORI 10-20 cm 1,59 1,24 0,14 ORI 0-55 cm 2,01 1,67 0,19 ORI 60 cm 0,72 0,57 0,06 Zn Pb Ni Cu Cr Mn Mg Ca Fe Na K mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg mg/Kg % w/w % w/w % w/w % w/w % w/w % w/w ORI 0-10 144 28 27 44 55 1189 0,22 1,14 3,25 1,01 2,51 ORI 10-20 125 26 24 43 52 1240 0,19 1,03 3,23 1,05 2,37 ORI 10-55 114 18 21 31 45 1159 0,15 0,46 3,02 1,06 2,52 ORI 60 124 30 25 45 54 1247 0,22 1,14 3,23 1,08 2,56 Values lim. 150 100 120 120 150 CRM TILL 1 117 dl 38 49 80 1424 1,11 1,72 4,66 2,08 1,52 Cerified value 98 22 24 47 65 1420 1,29 1,94 5,30 2,01 1,84 ORIGINAL SOIL CHARACTERISATION ORIGINAL SOIL depht cm 0-10 20-30 0-55 60 ng/g d.w. ng/g d.w. ng/g d.w. ng/g d.w. PCBs 9,7 7,9 5,0 4,8 PHA naftalene 2,8 3,7 3,2 2,3 acenaftilene 2,1 1,8 0,1 0,1 acenaftene 0,8 0,1 0,1 0,1 fluorene 1,9 0,1 0,1 0,1 fenantrene 6,9 5,9 6,3 2,8 antracene 0,8 0,5 0,4 0,1 fluorantene 9,2 12,6 7,7 0,8 pirene 7,7 10,8 6,7 0,5 B(a)antracene 4,7 5,7 3,3 0,4 Crisene 9,7 10,3 7,5 0,1 B(b+kj+k)fluorantene 22,3 23,7 18,9 1,1 B(a)pirene 9,8 11,4 8,4 0,3 Indenopirene 10,2 9,6 8,5 0,4 Db(ah)antracene 2,2 2,1 1,4 0,1 B(ghi)perilene 10,1 9,8 8,4 0,5 total PHAs 101,2 108,0 80,8 9,2 cm
- 39. L Streptomyces aurantiacogriseus A1 Streptomyces sp. A6 Streptomyces peucetius A7 Streptomyces sp. H Streptomyces sp. A8 Streptomyces setonensis F Streptomyces phaeochromogenes E Micromonospora sp. SL3 Nocardioides sp. A5 Aeromicrobium erythtreum K Mycobacterium sp. G Nocardia sp. X Gordonia sp. SL2 Rhodococcus erythropolis LAM18 Rhodococcus erythropolis LAM19 Arhtrobacter sp. LAM22 Arhtrobacter sp. U Microbacterium sp. W Microbacterium oxydans A Brevibacillus brevis B Brevibacillus brevis Y Paenibacillus sp. SL8 Bacillus licheniformis D Bacillus megaterium N Bacillus mycoides Q Bacillus cereus OSS31 Paenibacillus polymixa LAM23 Exiguobacterium sp. OSS42 Bacillus subtilis LAM30 Bacillus cereus T Porphyrobacter donghaensis S Massilia sp. SL5 Duganella nigrescens LAM29 Delftia tsuruhatensis A2 Stenotrophomonas sp. A4 Pseudomonas sp. LAM9 Pseudomonas resinovorans LAM33 Pseudomonas fluorescens LAM1 Pseudomonas jessenii Z Flavobacteriales bacterium 0.05 Actinobacteria Bacilli β-proteobacteria γ-proteobacteria Flavobacteria TIME 0
- 40. T 0 CTR DM B DB DBM Rhodococcus Arthrobacter Bacillus licheniformis Bacillus cereus Delftia Survival of the microbial formula 104 days Psedomonas
- 41. C17 / PRISTANE C18 / PHITANE DM 1 1,2 DB 1,2 1,5 DBM 1,8 2 Residual Diesel Hydrocarbons 0 25 50 75 100 C 1 4 C 1 5 C 1 6 C 1 7 pristan o C 1 8 fitan o C 1 9 C 2 0 C 2 1 C 2 2 C 2 3 C 2 4 U M C % DM time 0 DM 104 days Layer 0-20 cm Residual Diesel Hydrocarbons 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C14 C15 C16 C17 pristano C18 fitano C19 C20 C21 C22 C23 C24 U M C % DM 104 days DB 104 days DBM 104 days Leachate 5 min/tot Leachate 60 min/tot % % DM t0 33 37 DM 104 days 34 35 DBM 104 days 40 40 Pinto V., Cremisini C., Atti del convegno EGU 2008, Vienna, 13-18 aprile 2008. Bioavailability of metals
- 43. Conclusions . • The tailor-made Microbial formula tested for Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals showed to survive and to be effective in biodegradation of diesel • The native microbial communities developed in aged heavy metals pollutions can come to the rescue of co-contaminated environmental matrices. • The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards a rational selection of effective inocula for bioremediation applications • This way a serious limiting factor in bioremediation technology of co-contaminated matrices can find a solution.
- 44. . CONCLUSION The tailor-made Microbial formula tested for Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals showed to survive and to be effective in biodegradation of diesel The native microbial communities developed in aged heavy metals pollutions can come to the rescue of co-contaminated environmental matrices. The strategy of using tailor-made consortia, which link functionally the in situ microbial community structure with relevant chemical parameters, seems to be a promising avenue towards a rational selection of effective inocula for bioremediation applications This way a serious limiting factor in bioremediation technology of co-contaminated matrices can find a solution.
- 45. Consortium ENEA-CAR Pseudomonas, Enterobacter, Pantoea, Bacillus, Acinetobacter, Comamonas, Staphylococcus, Shewanella Biofilm on coal ESEM 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 TIME (hours) %residue 4-cloro-3-metil-fenolo C27 polietossilati Residue % + Cr (60 ppm) Resistant to Cr VI (250 ppm) TANNERY WASTEWATERS
- 46. • Isolation of microbial communities native to co-contaminated matrices and selection of strains resistant to heavy metals • Test for active (or inducible ) metabolism towards organic pollutants • Tailored Microbial Formula: Use of the strains in form of consortium for degradation of organic pollutants in the presence of heavy metals Use of PGP in association with plants Target Selected strategy • Co-contamination Biodegradation of organic pollutants in the presence of heavy metals • Heavy metals serious limiting factor in bioremediation technology
- 47. Using MicroBes for the REgula5on of heavy metaL mobiLity at ecosystem and landscape scAle: an integra5ve approach for soil remedia5on by geobiological processes h#p://www.umbrella.uni-‐jena.de/cms/index.php FP7-‐ THEME 3.1.2. ENV.2008.3.1.2.1 : Recovery of degraded soil resources Coordinator: Professor Erika Kothe, FS University of Jena, Germany Grant agreement no.: 226870 2009-‐2012
- 48. • FSU Jena • Forschungszentrum Dresden- Rossendorf • ENEA - Casaccia • University of Cagliari • VIROTEC, SME • Bangor University • Aberystwyth University • Lulea University of Technology • Orebro Universitet • University of Bucharest • Jagiellonian University,Krakow • Kwazar, City Council of Chrzanó • University of Vienna • AGES • University of Valladolid
- 49. � Kopparberg, Sweden� Cwmystwyth, Wales� Trzebionka, Poland� Zlatna Rosia, Romania� Ronnenburg, Germany, � Ingurtosu, Sardinia� Pb and Zinc since Bronze age Cu, Fe,Pb and Zn sulphide Since 13th century Zn-‐Pb ores 20th century Zn-‐Pb ores During 18th century Hll 1968 etherogeneous , Cu Former Russian Uranium mine
- 50. • Il suolo può essere considerato essenzialmente come una risorsa non rinnovabile dell'Unione Europea, per un totale di circa 400 milioni di e#ari. • Il degrado del suolo è un problema acuto in Europa e il costo sHmato potrebbe ammontare a 38 miliardi di euro all'anno. • Nella UE la superficie di suoli influenza5 da a^vità minerarie è stata s5mata pari allo 0,6%, rispeao a una media mondiale dello 0,2%. • La bonifica di queste aree è un obie^vo strategico per le poli5che europee. • Sono richieste tecnologie prome#enH su scala di ecosistema che devono garanHre il recupero dell'uso del suolo, con un impa#o posiHvo sui sistemi fluviali a valle, comprese le vie d'acqua internazionali (corsi d'acqua e il mare). PROBLEMATICA
- 51. Il ripris5no può essere oaenuto aaraverso l’a#enuazione naturale, che, tuaavia, è estremamente lenta. In realtà, ambien( contamina( da metalli soffrono in generale di bassa a2vità microbica, mo5vo per cui il biorisanamento può essere difficile da implementare nelle ex-‐miniere. Le possibilità dei microorganismi di accelerare le reazioni chimiche nell’ordine di 106 dimostra che vi è un enorme potenziale di miglioramento
- 52. Il ruolo che possono giocare i microrganismi nella fitoestrazione/stabilizzazione dei metalli è ancora soaovalutato Di solito la bonifica è s5mata solo su scala di sito, mentre il rischio per altri compar5 ambientali (es: acqua, fauna selva5ca) si verifica sia a livello di sito che su scala di ecosistema tramite dispersione fluviale I parametri geologici, mineralogici e geomorfologici che influenzano la distribuzione dei metalli sono indaga5 a livello di sito o di bacini limitrofi, e non sono correla5 all’impaao che gli affluen5 possono avere a valle, sull'ambiente cos5ero e marino. Vi è una mancanza di modelli matema5ci applicabili a livello europeo riguardo il risanamento di si5 contamina5 da metalli. Carenze delle tecniche a#uali
- 53. OLTRE LO STATO DELL’ARTE: l’idea di Umbrella Individuare appropriaH ceppi di microrganismi naHvi di siH minerari europei e uHlizzarli in combinazione con specie botaniche per o^mizzare processi di fito-‐estrazione o di fito-‐ stabilizzazione, Messa a punto di metodologie per la cara#erizzazione del rischio geochimico dovuto alla mobilità dei metalli, integrando a livello di ecosistema, per valutare l'efficienza di un biorisanamento migliorato dall’uso di microrganismi appositamente seleziona5 Produzione di modelli matemaHci dell'ecosistema chiave e dei processi rilevanH per la valutazione del rischio e per la bonifica, su scala di ecosistema, con applicabilità Europea.
- 54. Fornire agli uten5 finali “tool-‐boxes” per tecniche di bonifica in situ efficaci, economiche e rispeaose dell'ambiente, basate sulle conoscenze generali delle interazioni piante-‐ microrganismi : 1. microrganismi e piante 2. un approccio metodologico 3. modelli predi^vi Obie^vi
- 55. WP1 Microbiologia • Cara#erizzazione delle comunità microbiche • Sviluppo di consorzi microbici PGP e Micorrize • Frazionamento degli isotopi per seguire l'assorbimento di metalli nei sistemi vivenH WP 2: Botanica • Regolazione assorbimento radicale dei metalli e trasferimento nella pianta • Mappatura delle comunità botaniche • Speciazione dei metalli nel suolo e nelle piante WP 3: Geochimica • Idrogeochimica dei siH sperimentali • Ciclo suolo-‐pianta dei metalli • Processi di mobilizzazione eimmobilizzazione dei metalli • Mineralogia dei precipitaH • Biomineralizzazione WP 4: Modellazione • Produzione di modelli matematici biochimici/ ecotossicologici • Tool-box per decisori Per esplorare scenari di risanamento sulla protezione delle acque e della biodiversità a livello di bacino WP 5-7: Trasferiment o • Campi sperimentali • Linee-guida WP 6—8
- 56. Procedura per lo screening e la selezione di piante e consorzi microbici endemici per la realizzazione di un processo di fitorisanamento assistito
- 57. Phytoremediation strategies Bioaugmentation: use of Plant Growth- Promoting Bacteria (PGPB) Interactions between metals and microorganisms Lebeau et al. (2008) Environmental pollution, 153, 497–522
- 58. IT POL UK GER ROM SW Microbial load (CFU/ g soil-1) 9 x106 3 x106 2,7 x107 1 x106 1 x107 1 x106 N° of Colony morphotypes 41 33 42 18 21 22 N2 fixer (%) 90 82 76 78 62 50 PO4 mobilizer (%) 44 64 48 42 50 34 Siderophore producer (%) 63 58 45 89 43 59 Phytohormone producer (%) 32 33 24 22 67 55 Soil-extract (metal)resistant (%) 54 91 62 72 67 64 N2 fixing PO4 mobilisation Siderophores Phytohormones Metalt R Ingurtosu Trzebionka Ystwyth Wismut Zlatna Kopparberg 100%
- 59. IT RO GER POL SW UK 42 65 71 100 90 90 Diversità funzionale dei suoli di miniera Diversità funzionale dei suoli minerari espressa come % di utilizzo dei substrati contenuti nelle ECOPlates Biolog
- 60. ITALY P mobilisation N2 fixation Siderophores IAA Heavy Metals tolerance Ingurtosu Consortium Halo Growth halo Halo zone Pink- purple Ni Cd Cu Zn Pb Phylogenetic affiliation based on 16S r- RNA sequence 16S Nucleotide seq GenBank accession numbeR PVK AzM ARA CAS Na DF+ Tryp+SR mM mM mM mM mM UI2 Pseudomonas sp. Gammaproteobacteria BankIt1542646 UI2 JX133196 + + + + * + 20 5 5 20 10 UI3 Stenotrophomonas maltophilia Gammaproteobacteria BankIt1542646 UI3 JX133197 - + + * +/- 10 2,5 2,5 20 5 UI4 Rhizobium sp. Alphaproteobacteria BankIt1542646 UI4 JX133198 - + + * ++ 10 2,5 2,5 10 10 UI6 Niabella sp. Sphingobacteria BankIt1542646 UI6 JX133200 - + + * + 10 2.5 2,5 10 10 UI7 Curtobacterium flaccumfaciens Actinobacteria BankIt1542646 UI7 JX133199 + + + * +/- 10 2,5 5 10 10 UI9 Streptomyces ambofaciens Actinobacteria BankIt1542646 UI9 JX133201 +/- + + + * + 2,5 2,5 1 20 10 UI18 Streptomyces sp. Actinobacteria BankIt1544494 UI18 JX171076 + + + * - 2,5 2,5 2,5 20 10 UI24 Planctibacter flavus Actinobacteria BankIt1542646 UI24 JX133202 + + + * + 10 2,5 5 20 10 UI27 Niabella sp. Sphingobacteria sequence as UI6 - + + * + 20 5 5 20 10 UI28 Bacillus cereus Bacilli BankIt1542646 UI28 JX133203 + + ++ * + 30 10 5 20 10 ! Selezione dei consorzi promotori di crescita delle piante (PGP)
- 61. SPORE di AMF ISOLATE e IDENTIFICATE DALLE PIANTE DEL SITO DI INGURTOSU (Sardegna) Trap cultures (Plant species) AMF species Cistus monspeliensis Glomus constrictum Ranunculus bullatus Glomus sp. Festuca sp. Gennamari Not identified Euphorbia characias Not identified Helichrysum italicum Not identified Rosmarinus officinalis Not identified Ptilostemon casabonae Glomus irregulare Festuca sp. Not identified Carlina carymbosa Not identified Trifolium sp. Glomus fasciculatum Helichrysum sp. GENNAMARI Not identified Substratum from GENNAMARI Glomus sp. Fonte: prof. KatarzynaTurnau, UNI Cracovia.
- 62. Fonte: prof. Irene Lichtscheidl. UNI Vienna. Scelta delle piante
- 63. Fonte: Anja Grawunder UNI Jena
- 64. INGURTOSU Percorsi di scarico identificati nel bacino idrografico di Ingurtosu, all’interno del quale si trova il sito sperimentale dove è in corso un’applicazione di fitorisanamento assistito con microrganismi. . Un simile modello è stato definito per ogni sito minerario di UMBRELLA (fonte: Giovanni De Giudici, rapporto scientifico UMBRELLA). MOBILITA’ DEI METALLI PESANTI SITO DI INGURTOSU Fonte: G. DE Giudici UNI Cagliari
- 65. Integrando i dati é stato sviluppato un modello biogeochimico, riscrivendo il software CESAR- TRACER per poter eseguire l’integrazione tra scale crescenti, dalla scala di campo fino a livello di bacino, al fine di collegare le misure di bonifica locali con le loro conseguenze sul piano regionale. SITI: Ampoi river (Romania), Naracauli river (Sardinia), and Ystwyth river (Wales). MODELLAZIONE per sviluppare uno scenario per futuri trattamenti di risanamento Un modello concettuale per la bonifica su scala di bacino.
- 66. SERRA CAMPO 6 piante x 6 suoli+ consorzio nativo PGP Sito di Ingurtosu: Euphorbia pythiusa + consorzio PGP nativo Campo sperimentale
- 68. Campo sperimentale di Ingurtosu
- 69. Strain CODE Phylogenetic affiliation based on r-RNA 16S sequence SIM% GenBank accession number P mobilisation N2 fixation Siderophores IAA MMSE Heavy Metals tolerance Halo Growth halo Halo zone Pink-purple Ni Cd Cu Zn Pb PVK AzM ARA CAS Na DF+ Tryp+SR mM mM mM mM mM UI2 Pseudomonas sp. 99 JX133196 + + + + * + + 20 5 5 20 10 UI3 Stenotrophomonas maltophilia 99 JX133197 - + + * +/- +/- 10 2,5 2,5 20 5 UI4 Rhizobium sp. 99 JX133198 - + + * ++ + 10 2,5 2,5 10 10 UI6 Niabella sp. 96 JX133200 - + + * + + 10 2.5 2,5 10 10 UI7 Curtobacterium flaccumfaciens 99 JX133199 + + + * +/- + 10 2,5 5 10 10 UI9 Streptomyces ambofaciens 98 JX133201 +/- + + + * + + 2,5 2,5 1 20 10 UI18 Streptomyces sp. 99 in progress + + + * - + 2,5 2,5 2,5 20,0 10,0 UI24 Plantibacter flavus 99 JX133202 + + + * + + 10 2,5 5 20 10 UI27 Niabella sp. 96 similar to UI6 - + + * + + 20 5 5 20 10 UI28 Bacillus cereus 100 JX133203 + + ++ * + + 30 10 5 20 10 Consorzio batterico UI con proprietà PGP Rosmarinus officinalis , Ranunculus bullatus and Carlina corymbosa; in Asphodelus cerasiferus , Ptilostemon casabonae, Cistus salvifolius, Trifolium sp. and H. italicum Micorrize arbusculari BIOAUGMETATION
- 72. FIELD TRIAL UMBRELLA DOPO INOCULO ATTIVITA’ MICROBICA DEL SUOLO START Ottobre 2011
- 73. FIELD TRIAL UMBRELLA DOPO 5 MESI E. pithyusa ha la capacità di assorbire MP (metallofita) nella parte aerea della pianta ATTIVITA’ METABOLICA DEL SUOLO ASSORBIMENTO DI METALLI PESANTI
- 75. CONCLUSIONI FIELD-TRIAL UMBRELLA E. pithyusa ha la capacità di assorbire MP (metallofita) nella parte aerea della pianta La presenza diViromine™ha portato ad una riduzione della biodisponibilità per Zn e Cd con riduzione di assorbimento L’introduzione di E. pithyusa migliora l’attività metabolica del suolo anche senza bioaugmentation La presenza del consorzio UI migliora ulteriormente la qualità del suolo espandendo la diversità funzionale e specialmente la affinità per gli essudati plantari E. pithyusa + Consorzio UI sono compatibili e capaci di stabilire una associazione e possono agire come “tool box”
- 76. Strategie di fitorisanamento assistito da microrganismi promotori di crescita delle piante Progetto SMERI “Sviluppo di MEtodologie per la progettazione di interventi di bioRImedio”
- 77. 0 10 20 30 40 50 60 70 Sopravvivenza di Euphorbia p. % 0 20 40 60 80 Percentage 0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 AWCD (OD) 10 3 incubaHon Hme in Biolog ECOPlates (day) Bacteria VM VM+Myc VM+Bact Bact+ Myc Control Myc ATTIVITA’ METABOLICA DEL SUOLOSMERI Giugno 2014
- 78. A distanza di 2 anni e mezzo i parametri permane un effetto positivo di una sola applicazione di bioaugmentation con il consorzio batterico UI PROSPETTIVE Associazione di piante: E.pythiusa+ Juncus maritimus Bioaugmentation ion progress……………
- 80. Bioprospezione di siti minerari attraverso l’Europa per lo sviluppo di strategie di fitorisanamento assistito da batteri-PGP
- 81. L'importanza che la funzione dei microrganismi riveste a livello planetario richiede con urgenza che le nostre conoscenze siano accresciute insieme alla nostra capacità di sfruaamento Pertanto, ogni occasione di bioprospezione contribuisce a colmare alcune par5 nel mosaico della biodiversità microbica. Il progeao UMBRELLA (Using MicroBes for the REgula5on of heavy metaL mobiLity at ecosystem and landscape scAle: an integra5ve approach for soil remedia5on by geo-‐bio-‐logical processes) ha offerto l’occasione per la ricerca di PGP in 6 diversi si5 minerari distribui5 aaraverso l’Europa. Un quadro completo di una attività bioprospezione comporterebbe una serie di diverse lenti di osservazione. In questo lavoro, bioprospezione è presentato dal prospettiva del progetto UMBRELLA
- 82. L’obie2vo finale del proge9o: sviluppare un approccio integrale per il risanamento di suoli influenza4 da a5vità minerarie usando microrganismi in associazione con le piante. della bioprospezione stabilire sei consorzi ba8erici, uno per ogni sito di prova, oaenu5 raggruppando i migliori baaeri PGP isola5 dal suolo na5vo, da impiegare successivamente come agen4 di bioaugmenta4on in prove di campo. Il proge#o ha impa#ato ambiH disciplinari correlaH, ed in parHcolare la biodiversità. Questa parte del lavoro descrive la frazione col5vabile della biodiversità microbica na5va di sei si5, differen5 per caraaeris5che geografiche, clima5che e geochimiche, ma simili per essere sogge^ a stress cronico da metalli pesan5
- 83. Conservazione ex-situ I microrganismi di questi biotopi hanno attuato strategie adattattive come risposta a condizioni di vita critiche (stress cronico), che li rendono potenziali candidati per lo sfruttamento biotecnologico e potrebbero rappresentare potenziali soluzioni per le stesse aree danneggiate. Anche per questo motivo, tale biodiversità merita di essere preservata Come chiaramente dichiarato nel testo della convenzione internazionale sulla diversità biologica, le collezioni ex situ di microrganismi derivanti da siti inquinati, così come dai vents delle profondità marine, da ambienti ad alta alcalinità, da deserti caldi e freddi, costituiscono una risorsa essenziale per il futuro, poiché la complessità dei microrganismi unicellulari (replica molto veloce e adattamento veloce), rendono difficile eseguire la loro conservazione in situ
- 84. Diversità funzionale dei suoli oaenuta aaraverso l’analisi del profilo fisiologico a livello di comunità (CLPP -‐ BIOLOG Ecoplates™) Diversità ba9erica oaenuta aaraverso • l’analisi filogene5ca eseguita sulla base delle sequenze parziali del gene 16S-‐rRNA dei ceppi isola( • L’analisi metagenomica del DNA totale dei sei suoli (Illumina) In relazione ai parametri geo-chimici del substrato
- 85. Parametri del suolo BIODISPONIBILITA’
- 86. DIVERSITA’ FUNZIONALE DEL SUOLO ECOPlates –BIOLOG TM IT RO GER POL SW UK 42% 65% 71 % 100 % 90 % 90 %
- 87. IT POL UK GER ROM SW Microbial load (CFU/ g soil-1) 9 x106 3 x106 2,7 x107 1 x106 1 x107 1 x106 N° of Colony morphotypes 41 33 42 18 21 22 N2 fixer (%) 90 82 76 78 62 50 PO4 mobilizer (%) 44 64 48 42 50 34 Siderophore producer (%) 63 58 45 89 43 59 Phytohormone producer (%) 32 33 24 22 67 55 Soil-extract (metal)resistant (%) 54 91 62 72 67 64 DIVERSITA’ DELLA PORZIONE COLTIVABILE N2 fixing PO4 mobilisation Siderophores Phytohormones Metalt R Ingurtosu Trzebionka Ystwyth Wismut Zlatna Kopparberg 100%
- 89. La biodiversità coltivabile è stata analizzata a livello di phylum, classe e genere attraverso indici ecologici e analisi multivariata p IT c POL WAL GER n ROM rSWE Circa 200 morfotipi fc isolati 66% Gram+ 4 principali phyla 47 generi 99 specie
- 90. . Fonte: Sprocati et al. Environ Sci Pollut Res (2014) 21:6824–6835 At species-level, Shannon’s index (alpha diversity) and Sørensen's Similarity (beta diversity) indicates the sites are indeed diverse.
- 91. L’analisi multivariata dei fattori chimici del suolo e della biodiversità individua per ciascun sito alcuni fattori chimici e alcune specie ben discriminanti
- 92. L’analisi multivariata sostiene l’ipotesi che la biodiversità coltivabile dei sei siti minerari presenta, a livello di phylum, una convergenza correlata a fattori del suolo piuttosto che a fattori geografici, mentre, a livello di specie, riflette una notevole caratterizzazione locale L’analisi comparativa della biodioversità molecolare dei sei siti è in corso (Illumina) Per il sito italiano di Ingurtosu è disponibile l’analisi molecolare della comunità microbica, ottenuta mediante una libreria clonale di rRNA16S, sia per Eubatteri che Archaea
- 93. ARCHAEA N Uncultured archaeon clone UMV3A164 52 Uncultured archaeon clone Elev_16S_arch_961 50 Uncultured archaeon clone TX1C10 46 Uncultured archaeon clone sw-A333 16S 11 Uncultured crenarchaeote clone REF_A_48 7 Unidentified archaeon 16S rRNA gene, clone 218 1 Uncultured archaeon clone Amb_16S_arch_1427 1 Uncultured archaeon clone YMar-C232 2 Uncultured archaeon clone YMar-F25 1 Uncultured archaeon clone Amb_16S_arch_1394 1 Uncultured crenarchaeon, clone FJQFA13 1 Unidentified archaeon clone REF_E_1 1 Total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nvironmental samples 130 Alfa 42 Delta 18 Gemmatimonadates 21 Beta 11 Ciano 4 Cloroflexi 8 Acido 15 Actino 6 Gamma 3 Total 258 INGURTOSU SOIL CLONE LIBRARY (rDNA16 S)
- 94. GRAZIE PER L’ATTENZIONE Roma, Castel Sant’Angelo