1. In vitro modeli hepatotoksičnostiIn vitro modeli hepatotoksičnosti
Autori: Čaj Omanović, Vjera Ninčević i Martina Smolić
Pripadnost: Zavod za farmakologiju, Medicinski fakultet Osijek, Sveučilište u Osijeku,
J. Huttlera 4, 31000 Osijek, Hrvatska
1. Materijal i metode za proučavanje in vitro hepatotoksičnost1. Materijal i metode za proučavanje in vitro hepatotoksičnost
1.1. kulture hepatocita stanične
Dvije stanične linije s različitim karakteristikama će se koristiti za in vitro modeli hepatotoksičnosti:Dvije stanične linije s različitim karakteristikama će se koristiti za in vitro modeli hepatotoksičnosti:Dvije stanične linije s različitim karakteristikama će se koristiti za in vitro modeli hepatotoksičnosti:
1. HepG2 stanice su dobivene iz jetre hepatocelularni karcinom stara 15 godina bijele rase1. HepG2 stanice su dobivene iz jetre hepatocelularni karcinom stara 15 godina bijele rase
muški i zadržavaju mnoge karakteristike normalnih diferenciranih mirnim hepatocita (1).
2. Huh7 stanice su diferencirane i hepatocitima izvedene iz staničnih linija karcinoma stanične2. Huh7 stanice su diferencirane i hepatocitima izvedene iz staničnih linija karcinoma stanične
koji je izvorno preuzet iz tumora jetre u 57-godišnjeg japanskog muškarca 1982. godine.
Ovdje navedeni stanične kulture inkubiraju s DMEM (Dulbecco modificiran Eagle medij)
+ 10% FBS (fetalni goveđi serum) + 1% pen-strep (penicilin-streptomicin), u vlažnom inkubatoru s 5% isporučene
CO 2 na 37 ° C. Srednja treba mijenjati dva puta tjedno.CO 2 na 37 ° C. Srednja treba mijenjati dva puta tjedno.CO 2 na 37 ° C. Srednja treba mijenjati dva puta tjedno.CO 2 na 37 ° C. Srednja treba mijenjati dva puta tjedno.
1.2. Test isključenje Tripan Blue boja
Stanice održivost u suspenziji može se odrediti tripanskog modrila test. Žive stanice posjeduju netaknut stanične
membrane koje isključuju određene boje, među svim tripan plavim, a mrtve stanice ne (2). Stanična suspenzija (ako
stanice su kultivirane na pločama, treba biti odvojen prije ovog ispitivanja) se jednostavno pomiješa s bojom (npr., 10 ul
suspenzije stanica i 10 ul bojila). Stanice se broje korištenjem hemocitometra (uređaj koji se sastoji od debelog
mikroskopsko stakalce s pravokutno udubljenje koje stvara komora). Prije korištenja hemocitometra, prvo se uvjerite da
je posebna pokrovni ispravno pozicioniran na površini brojanje komore. Primjenjuju suspenzije stanica na rubu
pokrovnicom biti usisan u prostor putem kapilarnog djelovanja koja potpuno ispunjava komoru sa suspenzijom. Nakon
toga, vizualno pregledati kako bi se utvrdilo stanice preuzimaju ili isključiti boju. Vedro citoplazma će biti prisutan u živih
stanica dok mrtve stanice će imati plavu citoplazmu. Hemocitometra treba staviti na pozornici svjetlosnim mikroskopom i
fokus bi trebao biti na stanicama. Postoje različite metode brojanja stanica, jedan od njih je računati samo na održive
stanice s jasnim citoplazmi, a zatim koristite ovu jednadžbu:
2. ••••• •••••• •••••
••
= ••••• •••••• ••••• ••••••• ×
•••••••• •••••• •••••• •• ••••••• × 10 000 •••••
••
1.3. Ulje crvene O bojenje
Ulje crvene O je lysochrome (topljivi u mastima, boje) diazo boja se upotrijebi za bojanje neutralnih lipida i triglicerida u različitim tkivima. Ima izgled crvenog
praha maksimalnu apsorpciju pri 518 nm (359). 4% paraformaldehida (ohlađen na 4 ° C) se koristi za fiksiranje stanica. Nakon fiksiranje stanica za 30 - 45
minuta na 4 ° C, ukloni fiksatori i isprati dvaput s ohlađenom fosfatno puferiranoj otopini soli (PBS). Uklonite PBS i ostavite da se osuši na zraku.
Međuvremenu, pomiješati s crvenim uljem O. zalihu (0,5% Red Oil O zaliha sastoji od 0,5g Oil Red O razrijeđen u 100 ml 99% izopropanol) na 6: 4 omjeru
destiliranom H2O (dH2O) i pusti stajati 10 min. Radna otopina stabilna ne duže od 2 sata, tako da čine samo ono što će se u tom vremenu. Upotrijebiti
injekcijski filtar od 0,2 mikrona dodati Oil Red O da se stanice. Ako je ulje Crvena O ne filtriraju ispravno ćete imati puno pozadinskog bojenja. Polako okrećite
posudu za širenje crvenim uljem O. ravnomjerno stanica. Ostavite Oil Red O da 10 minuta, zatim izvadite i dobro isperite s dH2O dok voda teče jasno. Dodaj
hematoksilina suprotno obojenje u bunar tako da se stanice u potpunosti su pokriveni i ostavite stajati 1 minutu. Zatim izvadite i dobro isperite dH2O dok voda
teče jasno. Ostavite konačnu dH2O ispiranje na stanicama mikroskopije i analize. Ploče treba gledati na fazni kontrast mikroskopom gdje lipidi će se pojaviti
crvena i jezgre će se pojaviti plava. Dodaj hematoksilina suprotno obojenje u bunar tako da se stanice u potpunosti su pokriveni i ostavite stajati 1 minutu.
Zatim izvadite i dobro isperite dH2O dok voda teče jasno. Ostavite konačnu dH2O ispiranje na stanicama mikroskopije i analize. Ploče treba gledati na fazni
kontrast mikroskopom gdje lipidi će se pojaviti crvena i jezgre će se pojaviti plava. Dodaj hematoksilina suprotno obojenje u bunar tako da se stanice u
potpunosti su pokriveni i ostavite stajati 1 minutu. Zatim izvadite i dobro isperite dH2O dok voda teče jasno. Ostavite konačnu dH2O ispiranje na stanicama
mikroskopije i analize. Ploče treba gledati na fazni kontrast mikroskopom gdje lipidi će se pojaviti crvena i jezgre će se pojaviti plava.
1.4. MTT1.4. MTT
MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2) -2, 5-difeniltetrazolijevog bromida) Test je kolorimetrijsko određivanje procjenu
metaboličke aktivnosti stanica i proliferacije. Isto tako, kada metabolizma dovode do apoptoze ili nekroze, smanjenje
održivosti stanica može se odrediti MTT. Žuti tetrazolij MTT reducira u metabolički aktivnim stanicama, djelomično
djelovanjem enzimima dehidrogenaze, kako bi se smanjuje ekvivalente, kao što su NADH i NADPH (3). Dobivena
intracelularni purpurni formazan mogu otopiti i apsorbancija otopine ovog boji mogu se kvantificirati mjerenjem na
određene valne duljine (obično između 500 i 600 nm) pomoću spektrofotometra (3). MTT je pogodan za istraživanje
hepatotoksičnosti lijeka, s obzirom da je hepatotoksičnost droga istrage često zahtijeva ispitivanje nekoliko različitih
koncentracija i vremena izloženosti lijeku pomoću stanice u kulturi (4). Prema tome, to je atraktivna koristiti test
održivosti koja omogućuje analizu brojnih uzoraka s malo vremena za rukovanje, kao što su (4) MTT. MTT testovi
trebali
3. obaviti u mraku jer je MTT reagens je osjetljiv na svjetlo. Prvi korak je da se ploča stanice, obično u 96-jažica (npr 2x10 3 stanicaobaviti u mraku jer je MTT reagens je osjetljiv na svjetlo. Prvi korak je da se ploča stanice, obično u 96-jažica (npr 2x10 3 stanicaobaviti u mraku jer je MTT reagens je osjetljiv na svjetlo. Prvi korak je da se ploča stanice, obično u 96-jažica (npr 2x10 3 stanica
po komorici za jednotjednog eksperimenta) i inkubira 6-24 sati. Sljedeća stanica dan poklanjamo sredstava za odgovarajuće
vrijeme. Nakon toga, uklanjanje medij i doda se svježi medij sa 0,5 mg / ml MTT. Inkubirajte 4-8 sati (ovisno o staničnoj liniji,
gustoća stanica i sl .; npr 6 sati za Huh7, Huh7.5 i 3T3 stanica), dok ljubičasti talog je jasno vidljivo Ukloni MTT medija.
Dodavanje jednakog volumena 0,04 M HCl u izopropanolu ili 10% otopine SDS za otapanje stanica. (3). Pročitaj
apsorbancije na 595 nm na čitaču. Vrijednosti apsorbancije koje su niže u odnosu na kontrolne stanice značiti smanjenje
stope stanične proliferacije, za razliku od viših apsorpcije cijenama koje ukazuju na povećanje stanične proliferacije (3).
1.5. RT-PCR
Reverzne transkripcije lančana reakcija polimeraze (RT-PCR), predstavlja varijantu PCR prethodi sa konverzijom uzorka
RNA u cDNA. Ova tehnika se često koristi na području molekularne biologije za detekciju ekspresije gena stvaranjem cDNA
iz RNA transkripta pomoću enzima reverzne transkriptaze. (5). Nakon toga, pojačanje novosintetizovanih cDNA se postiže
tradicionalnim PCR. Prvi korak ove metode predstavlja reverzne transkripcije. RNA predloška (1-10 ug), klice (u.1 slučajni
oligonukleotida) i DEPC-H2O (DNase-RNaze bez vode) do 14 ul treba pomiješati zajedno u PCR epruvete, inkubiraju na 70
° C tijekom 10 minuta, i ohladi se na led. Nakon toga, dodavanje 7.8-8μl reakcijske smjese (2 ul 10xPCR pufera, 50 mM
MgCl u.1 2, 1 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 0.1 M DTT (ditiotreitol), 1 ul DEPC-H 2 O i 0.5-1μl reverzne transkriptaze) u svakom uzorkuMgCl u.1 2, 1 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 0.1 M DTT (ditiotreitol), 1 ul DEPC-H 2 O i 0.5-1μl reverzne transkriptaze) u svakom uzorkuMgCl u.1 2, 1 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 0.1 M DTT (ditiotreitol), 1 ul DEPC-H 2 O i 0.5-1μl reverzne transkriptaze) u svakom uzorkuMgCl u.1 2, 1 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 0.1 M DTT (ditiotreitol), 1 ul DEPC-H 2 O i 0.5-1μl reverzne transkriptaze) u svakom uzorkuMgCl u.1 2, 1 ul 10 mM dNTPs, 2 ul 0.1 M DTT (ditiotreitol), 1 ul DEPC-H 2 O i 0.5-1μl reverzne transkriptaze) u svakom uzorku
te inkubira 50 minuta na 42 ° C. Zaustaviti reakciju zagrijavanjem do 70 ° C tijekom 15 minuta i ohladi na ledu. Zatim se doda
1 J..lI inhibitora RNaze (10 ug) u svakom uzorku te se inkubira 20 minuta pri 37 ° C. U ovom trenutku, uzorci cDNA može se
koristiti za standardne PCR (drugi korak), ili oni mogu biti pohranjeni na 20 ° C, za duži vremenski period. Drugi korak
započinje dodavanjem primera (10 ul svake) 0,5 (0,5 ml) PCR podešavanje. Stvaraju glavni kombinaciju reagensa, koji se
sastoji od (100 ul za reakciju) 10xPCR pufer (10 ul), 10 mM dNTPs (2 ul), 50 mM MgCl 2 ( 3μl) i Taq polimeraze (0.5μl). Dodajsastoji od (100 ul za reakciju) 10xPCR pufer (10 ul), 10 mM dNTPs (2 ul), 50 mM MgCl 2 ( 3μl) i Taq polimeraze (0.5μl). Dodajsastoji od (100 ul za reakciju) 10xPCR pufer (10 ul), 10 mM dNTPs (2 ul), 50 mM MgCl 2 ( 3μl) i Taq polimeraze (0.5μl). Dodaj
15.5μl od glavne smjese za svaki uzorak. Zatim se doda 1-10mg razrjeđenje RT-PCR cDNA i DEPC-H 2 O do 65 uL. Overlay15.5μl od glavne smjese za svaki uzorak. Zatim se doda 1-10mg razrjeđenje RT-PCR cDNA i DEPC-H 2 O do 65 uL. Overlay15.5μl od glavne smjese za svaki uzorak. Zatim se doda 1-10mg razrjeđenje RT-PCR cDNA i DEPC-H 2 O do 65 uL. Overlay
svakog uzorka sa 3 kapi mineralnog ulja. Konačno, drže uzorci (trebao bi biti 100 ukupno), u PCR ciklusa.
1.6. Western blot1.6. Western blot
Western blot je široko korištena tehnika koja omogućuje detekciju specifičnih proteina u kompleksnoj mješavini
proteina dobivene iz stanica (6). Ova tehnika može se podijeliti u tri glavne korake: odvajanje proteina po veličini (gel
elektroforeze) elektroprijenosa za čvrstu podlogu, a na kraju i za blokiranje inkubacije antitijela (6). Prvi korak uključuje
standardni uzorak i gel
4. Pripravak prethodnim SDS-PAGE elektroforeze. Drugi korak predstavlja elektroprijenos, što čini proteine dostupne za
detekciju protutijela tako da ih se kreće unutar gela na nitroceluloznu membrani ili polivinil difluoridnu (PVDF)
membranu (6). Elektrobloting koristi električnu struju povući proteina iz gela u PVDF ili nitroceluloze membrane
(proteini su negativno nabijeni, dakle, biti siguran to mjesto membranu između gela i anode). Filtar ploče i membrane
treba smanjiti da stane mjerenje gela. Mokro membranu u MetOH i spužvasti filter papira i u prijenosnom puferu.
Nakon toga stvoriti sendvič prijenosa koji uključuje gel, membrana, slabljenja vlakana (spužve), na svakom kraju, a
filter papire za zaštitu gel i upijajući membrane. Premjestiti sendvič aparata za prijenos i dodati pufer transfer aparata.
Zatim stavite elektrode i prijenos za 45-90 minuta (ovisno o debljini gela). Posljednji stupanj započinje blokiranjem
membrane (sprječava nespecifično vezanje pozadina antitijela) s 5% obranim mlijekom u TBST puferom (Tris-Salin
Tween-
20) 1 sat. Nakon toga, dodavanje primarnog antitijela u 5% BSA i inkubira (vrijeme inkubacije može varirati između
nekoliko sati i preko noći, ovisno o afinitetu vezanja protutijela) na mikseru. Ispere se membrana 3 puta s TBST 5
minuta i zatim se inkubira s preporučenim razrjeđenja konjugiranih sekundarnih antitijela u puferu za blokiranje, na
sobnoj temperaturi tijekom 1 sata -2. Miješanje protutijela preporuča kako bi se omogućilo odgovarajuću homogene
pokrivanje membrane i spriječiti neujednačen vezanje. Ponovite postupak za pranje. Sekundarna protutijela obično se
označuje na reporter enzima kao što je hren peroksidaza (HRP). Membrana stoga se detektira signal koji obilježenog
antitijela (HRP) i enzima supstrata proizvodi koji odgovara položaju meta proteina. Konačno, razvijajući film u mračnoj
sobi, signal je zarobljen.
2. masna acids- in vitro modeli masne jetre2. masna acids- in vitro modeli masne jetre2. masna acids- in vitro modeli masne jetre2. masna acids- in vitro modeli masne jetre
Masnih kiselina (FFA), točnije, palmitinske (PA) i oleinska kiselina (OA) predstavljaju determinante patofiziologiju
masne jetre (1). Palmitinska i oleinska kiselina su Najrašireniji zasićenih i mononezasićenih masnih kiselina u prirodi.
Različite su studije pokazale kako PA i OA smjese inducirane steatoza je povezana sa lipotoxicity, oštećenja jetre,
apoptozu i masnom u staničnim kulturama hepatocita (7). Količina akumulacije masti zbog masnih kiselina aktivnosti
usporediva s onom zabilježenom u jetri bolesnika s masne jetre (8). Dakle, važno je savladati znanja i vještine
potrebne za razvoj in vitro modeli masne jetre koriste slobodne masne kiseline za bolje razumijevanje same bolesti.potrebne za razvoj in vitro modeli masne jetre koriste slobodne masne kiseline za bolje razumijevanje same bolesti.potrebne za razvoj in vitro modeli masne jetre koriste slobodne masne kiseline za bolje razumijevanje same bolesti.
5. 2.1. masne kiseline
Dugolančani učestalih, palmitinska (16: 0), oleinska i (18: 1) nalaze se kao natrijeve soli. PA i OA su otopljeni u 99%
(MetOH matična otopina 100 mM). Matične otopine čuvaju se na -20 ° C prije pokusa.
2.2. Protokol studijskog-indukcije i vrednovanje steatozom
HepG2 i Huh-7 stanične kulture su inkubirane sa gore navedenom mediju, obogaćenom s FA u slijedećim konačnim
koncentracijama: a) PA: 0,33 mM i 0.66 mM; b) OA: 0,66 mM i 1,32 mM (1). Inkubirati kontrolu stanične kulture s
običnom mediju i medija dodano je vozilo u kojem su otopljeni masne kiseline (u ovom slučaju 99% MetOH). Slika 2.
Slika 2. 6 jažica sa staničnom kulturom ispitane s FFAs kao što je navedeno u tekstu
1- Običnom mediju 2- Medij plus 99% 3- MetOH Medij1- Običnom mediju 2- Medij plus 99% 3- MetOH Medij1- Običnom mediju 2- Medij plus 99% 3- MetOH Medij1- Običnom mediju 2- Medij plus 99% 3- MetOH Medij
plus 0,33 mM otopine PA 4- Medij plus 0.66mMplus 0,33 mM otopine PA 4- Medij plus 0.66mM
otopina PA 5- Medij plus 0.66mM OA otopina 6- Srednjaotopina PA 5- Medij plus 0.66mM OA otopina 6- Srednjaotopina PA 5- Medij plus 0.66mM OA otopina 6- Srednja
plus 1.32mM OA rješenje
Razne studije su pokazale da je optimalno vrijeme inkubacije za dobivanje očekivane ishode je 24h sati (kada je
inkubacija u trajanju od 12h ili manje nakupljanje triglicerida je niska, nakon nemjerljivu varijacije u ekspresiji gena, za
razliku, duže razdoblje inkubacije ne daje značajnu prednost u smislu akumulacije intracelularnog triglicerida, ali
značajno smanjuje održivost stanica na višim koncentracijama FA) (1). Slijedeći korak uključuje mjerenje opsega
steatoze, apoptozu i ekspresiju gena. Steatoza mjeri prethodno objašnjena metoda ulja Crvena O bojanje (1.3), gdje
lipidnih kapi treba obojena u crveno, a jezgre u plavo. Razina apoptoze se određuje MTT (1.4). PA općenito ima veću
sposobnost da inducira apoptozu u staničnim kulturama, u usporedbi s OA. Razne studije korištenje zečjeg fosfo-AKT
protutijelom i anti-βActin protutijelo kao primarnim antitijelima za analize Western blot. Konačno, RT-PCR se koristi za
1 2 3
4 5 6
6. pokazuje ekspresiju gena , Ekspresija triju gena je nađeno kontinuirano mijenjati nakon tretiranja stanica sa učestalih:pokazuje ekspresiju gena , Ekspresija triju gena je nađeno kontinuirano mijenjati nakon tretiranja stanica sa učestalih:pokazuje ekspresiju gena , Ekspresija triju gena je nađeno kontinuirano mijenjati nakon tretiranja stanica sa učestalih:
PPARa, PPARy i SREBP-1 (1).
3. potiče hepatotoksičnost acetaminofen3. potiče hepatotoksičnost acetaminofen
Acetaminofen (APAP) predstavlja najčešće korišteni analgetik i antipiretik lijek u cjelini. Ipak, hepatotoksičnost
uzrokovane APAP predoziranja je najčešći uzrok akutnog zatajenja jetre u svijetu (9). Da bi istražili sve molekularnih
mehanizama uključenih u APAP hepatotoksičnosti, moraju se koristiti različite metode. Različite studije nude in vitro pristupmehanizama uključenih u APAP hepatotoksičnosti, moraju se koristiti različite metode. Različite studije nude in vitro pristupmehanizama uključenih u APAP hepatotoksičnosti, moraju se koristiti različite metode. Različite studije nude in vitro pristup
toj temi kao jedan od najučinkovitijih one. Ponajprije, inkubirati jetre kulture stanica u mediju koji sadrži APAP (0,5, 10,
ili 20 mM otopljen u 100% dimetil sulfoksida) za 2, 6 i 24 sata (10). Istražiti održivost hepatocita preko mitohondrijske
funkcije, MTT test koristi se kao što je ranije (9) opisana. PPARa, FAAH, Nape-PLD Mcp1, TNFa i IL6 geni
predstavljaju ciljeve za mjerenje ekspresije gena putem RT-PCR (10). Antitijela preporučuje za upotrebu za ekspresiju
proteina pomoću Western blot su PPARa, NAPZ-PLD i FAAH. APAP koji se akutno i opetovano davati izazivaju
oštećenje jetre, modificira transpoziciju NAEbased protuupalnom sustav sastavljen od PPARa, u Naes sinteza enzima
NAPEPLD i Naes degradacije enzima FAAH. Značajno smanjenje ekspresije navedenih proteina pokazana 6h nakon
tretmana s APAP (10). Zanimljivo, ovaj učinak na ekspresiju proteina je u potpunosti obrnut nakon 24 sata od davanja
akutne APAP (10).
4. potiče hepatotoksičnost amiodaron4. potiče hepatotoksičnost amiodaron
Amiodaron predstavlja klasa III antiaritmik lijekove koji se koristi za liječenje i sprečavanje raznih vrsta aritmija.
Amiodaron može imati ozbiljne nuspojave, uključujući hepatotoksične učinak. Točnije to lijek može uzrokovati DIFLD
(bolesti masne jetre uzrokovana lijekovima). Dakle, primjena amiodaron uglavnom se preporuča samo za ozbiljne
ventrikularne aritmije. Bolje razumijevanje amiodaron inducirane ozljede jetre, molekularni mehanizam je potrebno.
Jedan od načina postizanja tog cilja je procijeniti učinak amiodaron u kulturama jetrenih stanica. Prvi korak uključuje
inkubaciju kultura jetrenih stanica s različitim koncentracijama (npr amiodaron 10 uM i 20 uM amiodaron hidroklorida
98%, razrijedi se s 99% MetOH) za 24 sata i 48 sati. Nakon toga, različiti testovi mogu biti učinjeno. S Tripan blue boja
testa isključenja se može provesti kako bi se utvrdilo koncentraciju živih stanica. Ulje-Red-O mrlja se koristi za
demonstraciju nakupljanje triglicerida u hepatocitima. Nakon inkubacije s amiodaron, stanice mijenjaju svoj normalan
oblik za ovalni, veći oblik, s pojačanim nakupljanjem i veličina masnih kapljica u citosolu amiodarone-
7. stanice tretirane u odnosu na kontrole. Za određivanje točne koncentracije toksične amiodaron i njihov utjecaj na
staničnu vitalnost, može se koristiti test MTT. Western blot može se izvesti pomoću protutijela protiv adipofilin i PPARy.
5. potiče hepatotoksičnost tamoksifen5. potiče hepatotoksičnost tamoksifen
Tamoksifen je selektivni modulator receptora estrogena se obično koriste u liječenju raka dojke, osobito molekulske podtipova koji pokazuju estrogenske
receptore (11). Ipak, dugotrajna uporaba tamoksifen je povezana s različitim komplikacijama, uključujući bolesti masne jetre izazvane lijekovima. Prema
tome, za prevenciju i liječenje DIFLD kod pacijenata oboljelih od raka dojke zahtijeva razjašnjavanje molekularni mehanizam tamoksifenom inducirane DIFLD.
Studije o staničnim linijama jetre može igrati važnu ulogu u rasvjetljavanju ovog patološki mehanizam. Isto kao i za amiodaron, prvi korak uključuje inkubaciju
jetrenih staničnih kultura s različitim koncentracijama tamoksifenom (npr 5 uM i 10 uM tamoksifenom hidroklorid 98%, razrijedi se s 99% MetOH) za 24 sata i
48 sati. Nakon toga, različiti testovi mogu biti učinjeno. S Tripan blue boja testa isključenja se može provesti kako bi se utvrdilo koncentraciju živih stanica.
Tamoksifen smanjuje staničnu vitalnost jači od amiodaron. Nakon ulje-Red-O bojenje stanica inkubiranih s tamoksifenom, promjena njihovog uobičajenog
oblika do ovalni, veći oblik, macrovesicular steatozom i phospholipidosis vizualizira. Za određivanje točne koncentracije toksične amiodaron i njihov utjecaj na
staničnu vitalnost, može se koristiti test MTT. Kod izvođenja RT-PCR, ekspresiju SREBP-1c PPARy i C / EBPα gena je promijenjen (putem različitih studija).
Western blot analize treba uključivati antitijela za neki od tih proteina: SREBP-1c, FAS, C / EBPα, PPARy i MTP (12). promjene svog prvobitnog oblika na
ovalnom, veći oblik, macrovesicular steatozom i phospholipidosis vizualizira. Za određivanje točne koncentracije toksične amiodaron i njihov utjecaj na
staničnu vitalnost, može se koristiti test MTT. Kod izvođenja RT-PCR, ekspresiju SREBP-1c PPARy i C / EBPα gena je promijenjen (putem različitih studija).
Western blot analize treba uključivati antitijela za neki od tih proteina: SREBP-1c, FAS, C / EBPα, PPARy i MTP (12). promjene svog prvobitnog oblika na
ovalnom, veći oblik, macrovesicular steatozom i phospholipidosis vizualizira. Za određivanje točne koncentracije toksične amiodaron i njihov utjecaj na
staničnu vitalnost, može se koristiti test MTT. Kod izvođenja RT-PCR, ekspresiju SREBP-1c PPARy i C / EBPα gena je promijenjen (putem različitih studija).
Western blot analize treba uključivati antitijela za neki od tih proteina: SREBP-1c, FAS, C / EBPα, PPARy i MTP (12).
1. Ricchi M Odoardi MR, Carulli L, Anzivino C Ballestri S, Pinetti A, et al. Diferencijalna učinak oleinske kiseline i palmitinske na
nakupljanje lipida i apoptoze u kultiviranim hepatocitima. J Hepatol Gastroenterol. 2009. i 24 (5): 830-40.
2. Strober W. tripanskog modrila stanične održivosti. Curi Protoc Immunol. 2001; Dodatak 3: Dodatak 3B.
3. Kolekcija ATC. MTT testom proliferacije stanica 2011 [Dostupno od:
https://www.atcc.org/~/media/DA5285A1F52C414E864C966FD78C9A79.ashx ,https://www.atcc.org/~/media/DA5285A1F52C414E864C966FD78C9A79.ashx ,
4. Hansen J, Bross P. isplativost Stanični test za praćenje toksičnosti lijeka. Metode Mol Biol. 2010; 648: 303-11.
5. Freeman WM, Walker SJ, Vransko KE. Kvantitativna RT-PCR: zamke i potencijal. Biotechniqges. 1999; 26 (1): 112-22,
24-5.
6. Mahmood T, Yang računalo. Western blot: tehnika, teorija i nevolje snimanja. N Am J Med Sci. 2012; 4 (9): 429-34.
7. Feldstein AE, Canbay A, Guicciardi ME, Higuchi H, Bronk SF, Gores GJ. Dijeta povezana masne jetre senzibiliziraju na Fas
posredovanog oštećenja jetre u miševa. J Hepatol. 2003; 39 (6): 978-83.
8. 8. Gomez-Lechón MJ Donato MT, Martinez-Romero A, Jimenez N, Castell JV, O'Connor JE. Ljudska hepatocelularnog in
vitro modelu istražiti steatozu. Chem Biol interakciju. 2007., 165 (2): 106-16.
9. Jannuzzi AT, Kara M Alpertunga B. Celastrol poboljšava acetaminofen induciranu oksidativni stres i citotoksičnost u
HepG2 stanicama. Hum Exp Toxical. 2017: 960327117734622.
10. Rivera P, Pastor A, Arrabal S, Decara J, Vargas, Sánchez-Marín L, et al. Acetaminofen izazvana jetre ozljeda mijenja acil
etanolamin-based anti-upalni signalno-sigurnosnog sustava u jetri. Prednji Pharmacol. 2017; 8: 705.
11. Miele L, Liguori A, G Marrone, Biolato M Araneo C Vaccaro FG, et al. Masna jetra i droga: dvije strane istog novčića.
Eur Rev Pharmacol Med Sci. 2017, 21 (Suppl 1): 86-94.
12. Zhao F, Xie P, Jiang J, Zhang L, An W, Zhan Y. učinak i mehanizam tamoksifen inducirane hepatocita masnom in
vitro. Int J Mol Sci. 2014. 15 (3): 4019-30.
