2. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
3. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
S a d r ž a j
1. Mehaničke postavke setup-a 1
2. Priprema Krebs – Hansenleitove otopine 2
3. Priprema lijekova 3
4. Protokoli 4
5. Obrada podataka 5
4. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
1. M E H A N I Č K E K A R A K T E R I S T I K E S E T U P-a
1.1. Dijelovi četverokanalni standardni sustav kupki za izolirane organe
Četverokanalni standardni sustav kupki za izolirane organe (tkivne prstenove i trakice) sa svom
priključnom opremom (cijevi, kablovi itd.)
Četverokanalni pojačivać mjerene sile
Izometrični pretvarač sile
Softwer za prikupljanje i obradu podataka
Sustav za primanje i prijenos siganala sa sustava kupki za izolirane organe na računalo
(četverokanalni s mogućnošću proširivanja na osamkanalni sustav)
Sustav za grijanje i cirkulaciju vode sa spremnikom od 20 l i mogućnošću prilagodbe temperature u
rasponu od 20 – 50 ºC te s preciznošću od ±0,1 ºC
5. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
2. P R I P R E M A K R E B S – H A N S E N L E I T O V E O T O P I N E
Odvažite sastojke za otopinu prema tablici 2.1. Najprije u Erlenmayerovu tikvicu uspite 2 l
deionizirane vode i ubacite odgovarajući magnetić te sve postavite na magnetic strier. Postupno dodajte
sve sastojke te otopinu mješajjte na magnetic strieru 10ak minuta dok se svi sastojci ne otope.
Sastojak Koncentracija/mM Masa/g Masa/g
Deionizirana voda - 2 L 4 L
NaCl 113 13,79 27,580
KCl 4,7 0,701 1,402
CaCl2 x 2H2O 2,5 0,735 1,470
EDTA 0,026 0,0152 0,0304
MgSO4 x 6H2O 1,2 0,593 1,185
KH2PO4 1,2 0,327 0,653
NaHCO3 22 3,698 7,395
Glukoza - 3,998 7,999
Tablica 2.1 – sastojci Krebs – Henseleitove otopine
6. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
3. P R I P R E M A L I J E K O V A
Najčešće korišteni lijekovi u pokusima sa izoliranim krvnim žilama prikazani su u tablici 3.1. Kod
pripreme lijekova važno je imati na umu da se lijek (možda bi prikladniji naziv bio aktivna tvar) prilikom
aplikacije u bazenčić dodatno razrjeđuje.
Faktor razrjeđenja (FR) proizlazi iz omjera volumena bazenčića (VB) i volumena otopine lijeka koji
apliciramo u bazenčić (VA). Koncentraciju lijeka u otopini koju pripremamo (cP) izračunavamo tako da
koncentraciju lijeka koju želimo postići u bazenčiću (cB)pomnožimo sa faktorom razrjeđenja (FR).
Volumena bazenčića (Vb) našeg setup-a je 10 ml, stoga ako želimo aplicirati 100 μl otopine lijeka
ona će se pri tome razrijediti još 100 puta (FR = 10 000μl/100μl). Iz toga proizlazi da koncentracija otopine
lijeka (cP) koju pripremamo mora biti 100 puta veća od one koncentracije koju želimo postići u bazenčiću
(cP = 100 x cB).
Lijek/aktivna tvar Mr (g/L)
Koncentracija
za pripremu
lijeka
Koncentracija
nerazrijeđenog
lijeka u bazenčiću
Koncentracija u
pokusu
KCl 74,56 3 M 60 mM (200μL) 60 mM
Noradrenalin 205,0 10 mM 10-4
Zamorac: 100 x (10-6
)
Štakor: 1000x (10-7
)
Acetilkolin 181,7 10 mM 10-4
Zamorac: 10 x (10-5
)
Štakor: 100x (10-6
)
L-NAME 268,0 20 mM 3x10-4
M 3x10-4
M
Indometacin 358,0 10 mM 10-4 10x (10-5
M)
Klotrimazol 344,8 10 mM 10-4 10x (10-5
M)
Tablica 3.1 – najčešće korišteni lijekovi i njihove koncentracije
cP = FR x cB
cB – koncentracija lijeka u bazenčiću
cP – koncentracija lijeka kojeg
pripremamo
FR = VB / VA
VB - volume bazenčića
VA - volumen otopine lijeka koji
apliciramo u bazenčić
7. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
3.1 N A J Č E Š Ć E K O R I Š T E N E F O R M U L E
VB = 10 mL = FIXNO, određeno setup-om
VA = 100 μL = određujemo sami, 100 μL
praktično
VP = 10 mL = određujemo sami, bolje je
pripremiti veći volume otopine, odmjeriti
po 1mL te pohraniti na -20 ⁰C
VB - volume bazenčića
VA - volumen otopine koji apliciramo
VP - volumen otopineljeka koji pripremamo
cB – koncentracija lijeka u bazenčiću
cP – koncentracija lijeka kojeg pripremamo
n –množina lijeka
Mr – molekularna masa lijeka
m – masa lijeka
cP
VP
ntvari [mol]
=
cP
=
mtvari
[L]
ntvari
Mrtvari
[g]
=
[g/mol]
cP
VP
=
Mtvar
iMrtvari
FR
=cP
VApliciran
VBazenčić
FR cB
=
x
[mL]
[mL]
VP Mrtvari
Mtvari
Mtvari = [mol/L][g] x xMrtvari [g/mol] VP [L]
8. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
3.2 P R I P R E M A L I J E K O V A Z A P O K U S
K a l i j e v k l o r i d
Djelovanje Izaziva promjenu akcijskog potencijala na glatkim
mišičnim stanicama te kontrakciju krvne žile
Upotreba Najčešće se koristi za provjeru vitalnosti krvne žile na
početku protokola
Moze se koristiti za prekontrakciju krvne žile
Koncentracija otopine koja se
priprema
3M
Sastojci otopine 11,184 g KCl-a u 50 mL deionizirane vode
Pohrana Čuva se na +4 ⁰C
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 200 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
60 mM
Željena koncentracija u protokolu 60 mM
Dodatno razrijeđenje Ne
Volumen koji se aplicira 200 μL
VB = 10 mL
VA (KCl) = 200 μL Fr = 10 mL/0,2 mL = 50 x
VP (KCl) = 50 mL = 0,05 L
CB (KCl) = 60 mmol/L = 0,06 mol/L
CP (KCl) = 50 x 0,06 = 3 mol/L
Mr = 74,56 g/mol
m (KCl) = 3 mol/L x 74,56 g/mol x 0,05 L
= 11,184 g
9. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
N o r a d r e n a l i n
Djelovanje Djeluje izravno na GMS krvnih žila uzrokujući njihovu
kontrakciju. Djeluje putem α- i β- adrenergičnih receptora
koji su spregnuti s G proteinom
Upotreba Za inicijalnu prekontrakciju
Koncentracija otopine koja se
priprema
10 mM
Sastojci otopine 20,5 mg NA u 10 mL deionizirane vode
Pohrana Čuva se na -20 ⁰C u Eppendorf epruvetama od 1 mL
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 100 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
10-4 M
Željena koncentracija u protokolu 10-7 M
Dodatno razrijeđenje Da 1000x (3 puta u slijedu 100 μL otopine lijeka u 900 μL
deionizirane vode)
Volumen koji se aplicira 100 μL
VB = 10 mL
VA (NA) = 100 μL Fr = 10 mL/0,1 mL = 100 x
VP (NA) = 10 mL = 0,01 L
CB (KCl) = 10-4
mol/L
CP (KCl) = 100 x 10-4
= 10-2
mol/L
Mr = 205 g/mol
m (NA) = 0,01 mol/L x 205 g/mol x 0,01 L
= 0,0205 g
= 20,5 mg
10. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
A c e t i l k o l i n
Djelovanje Djeluje na muskarinske receptore na površini endotelnih
stanica i u njima potiče NO sintetazu (eNOS) na sintezu
NO iz L-arginina. NO difundira u GMS gdje posredstvom
cGMP-a potiće relaksaciju GMS te poslijedično
vazodilataciju
Upotreba Za ispitivanje intaktnosti i funkcije endotela
Koncentracija otopine koja se
priprema
10 mM
Sastojci otopine 18,2 mg NA u 10 mL deionizirane vode
Pohrana Čuva se na -20 ⁰C u Eppendorf epruvetama od 1 mL
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 100 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
10-4 M
Željena koncentracija u protokolu Za provjeru intaktnosti endotela: 10-6 M
Za provjeru funkcije endotela: 10-9 - 10-5 M
Dodatno razrijeđenje Za provjeru intaktnosti endotela: DA 100x (2 puta u
slijedu 100 μL otopine lijeka u 900 μL deionizirane vode)
Za provjeru funkcije endotela: DA 100x (5 puta u slijedu
100 μL otopine lijeka u 900 μL deionizirane vode)
Volumen koji se aplicira Za provjeru intaktnosti endotela: 100 μL 10-6 M
Za provjeru funkcije endotela: 100 μL 10-9, 90 μL 10-8 –
10 -5 M
VB = 10 mL
VA (NA) = 100 μL Fr = 10 mL/0,1 mL = 100 x
VP (NA) = 10 mL = 0,01 L
CB (KCl) = 10-4
mol/L
CP (KCl) = 100 x 10-4
= 10-2
mol/L
Mr = 181,7 g/mol
m (NA) = 0,01 mol/L x 181,7 g/mol x 0,01 L
= 0,0182 g
= 18,2 mg
11. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
L-NAME
Djelovanje L –NAME je blokator endotelne NO – sintetaze (eNOS) te
posljedično inhibitor relaksacije posredovane s ACh
Upotreba Za ispitivanje mehanizama odgovornih za promjenjenu
funkciju endotela uslijed nekih patoloških stanja
Koncentracija otopine koja se
priprema
20 mM
Sastojci otopine 0,0134 g u 2,5 mL deionizirane vode
Pohrana Uvijek se priprema svježa otopina za pokus
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 150 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
3x10-4 M
Željena koncentracija u protokolu 3x10-4 M
Dodatno razrijeđenje Ne
Volumen koji se aplicira 150 μL
m (NA) = 0,02 mol/L x 268,0 g/mol x 0,005 L
= 0,0182 g
= 18,2 mg
12. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
I n d o m e t a c i n
Djelovanje Nesteroidni antiinflamatorni lijek koji inhibira sintezu
prostangladina.
Upotreba Za ispitivanje mehanizama odgovornih za promjenjenu
funkciju endotela uslijed nekih patoloških stanja
Koncentracija otopine koja se
priprema
10 mM
Sastojci otopine 0,0179 g u 5 mL deionizirane vode
Pohrana Uvijek se priprema svježa otopina za pokus
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 100 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
10-4 M
Željena koncentracija u protokolu 10-5 M
Dodatno razrijeđenje Da 10x (1 puta 100 μL otopine lijeka u 900 μL deionizirane
vode)
Volumen koji se aplicira 100 μL
13. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
K l o t r i m a z o l
Djelovanje Specifični inhibitor citokrom p450 oksidaze (cyp450
oksidaza) u metabolizmu arahidonske kiseline.
Upotreba Za ispitivanje mehanizama odgovornih za promjenjenu
funkciju endotela uslijed nekih patoloških stanja
Koncentracija otopine koja se
priprema
10 mM
Sastojci otopine 0,01724 g u 5 mL deionizirane vode
Pohrana Uvijek se priprema svježa otopina za pokus
Koncentracija u bazenčiću ako se
ako 100 μL prpremljene otopine
aplicira u bazenčić
10-4 M
Željena koncentracija u protokolu 10-5 M
Dodatno razrijeđenje Da 10x (1 puta 100 μL otopine lijeka u 900 μL deionizirane
vode)
Volumen koji se aplicira 100 μL
14. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
15. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
4. Pokus i protokoli
Svaki pokus zapocinje pripremom Krebs – Henseleitove otopine te aktivacijom sustava. Aktivacija
sustava uključuje pokretanje pumpe koja grije sustav (namještena na 37 ⁰C), pokretanje amplifiera,
otvaranje kisika te pokretanje računala i SPEL Advanced IsoSys softwera. Potom se može pristupiti kirurgiji.
Kirurgija treba biti brza i pri tome treba nastojati odstraniti što više vezivnog i masnog tkiva. U protokol
ulazimo postavljanjem prstenova u bazenčiće.
Protokol čini nekoliko dijelova: stabilizacija krvne žile, inicijalni prekontrakcijski test, testiranje
intaktnosti i funkcije endotela te specifični testa (blokada specifičnih enzima, ispitivanje funkcije glatkih
mišićnih stanica i sl.).
16. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
17. P O K U S I N A I Z O L I R A N I M A O R T N I M P R S T E N O V I M A
Ringovi
5. Obrada podataka
