IZOLIRANE KRVNE ŽILE text

1. IZOLIRANE KRVNE ŽILE
1. Mehaničke postavke sustava tlačnog miografa (Pressure Myograph System)
1.1. Dijelovi sustava
Slika 1. Dijelovi sustava za izolirane krvne žile (Pressure Myograph System, DMT Model 111P)
1.2. Princip rada
Sustav tlačnog miografa s modulom za protok za male žile (The Myograph System;Model 110P
& 111P) predstavlja idealan način proučavanja strukture i funkcije izoliranih krvih žila malih
promjera (promjer > 60 μm) pod različitim (pato)fiziološkim uvjetima. Promjer krvnih žila
može se mjeriti kao odgovor na farmakološke i fiziološke podražaje. Ugrađeni sustav grijanja
održava temperaturu komorice stalnom, dok poklopac komorice uključuje otvore za
superfuziju, za brzo pražnjenje i punjenje, za kumulativno dodavanje lijekova i za oksidaciju.
Komorica je izrađena od nehrđajućeg čelika otpornog na kiseline, što olakšava njeno čišćenje
(nakon svakog korištenja) i održavanje.
Ovim sustavom mogu se ispitati fiziološki odgovori izoliranih krvnih žila, kao što su miogeni
odgovor i protokom posredovana dilatacija. U našim pokusima ovaj sustav koristimo za
proučavanje malih krvnih žila poput srednje moždane arterije štakora. Kombiniranjem različitih

2. vazoaktivnih tvari i blokatora specifičnih enzima (koji se inkubiraju u komorici 20 min),
moguće je proučavati funkciju endotela i glatkih mišićnih stanica te razne vazodilatacijske i
vazokonstriktorske mehanizme. Također, mogu se prikupiti podaci kao što su debljina stijenke
krvne žile, promjena promjera krvne žile, intravaskularni tlak te niz drugih izračunatih
parametara, kao što je shear stress i vaskularni otpor.
Sustav tlačnog miografa je dizajniran za korištenje samo u nastavi i istraživačkim aktivnostima.
Nije namijenjen za kliničku primjenu, niti se može koristiti u prevenciji, dijagnozi, liječenju ili
ublažavanju bolesti, ozljede ili hendikepa.
1.3. Programska podrška
Proizvođač našeg sustava za istraživanje vaskularne reaktivnosti i endotelne funkcije izoliranih
malih krvnih žila je Danish Myo Technology (DMT) (Danska). Mjerenja se kontinuirano
bilježe pomoću računala s softverom za analizu dimenzija - MyoVIEW. Kao dodatak,
FlowMeter - 161FM može se dodati sustavu kako bi se mjerila veličina protoka kroz izolirane
žile (protoka između 15-1500 μL/min).
Slika 2. MyoView

3. 2. Priprema PSS otopine
Physiological salt solution (PSS) modificirana je Krebs-Henseleitova otopina, koja se najčešće
koristi u proučavanju fiziologije izoliranih krvnih žila. U našim pokusima ćemo koristiti PSS
otopinu koja ima sljedeći sastav:
- Za pripremu 0,5 L :
 Destilirana voda: 450 mL
 Salt Stock otopina: 25 mL
 Buffer Stock otopina: 25 mL
 Glukoza: 0,5 g
 NaH2PO4: 0,07 g
Na kraju svakog pokusa, PSS otopina se zamijeni s Ca-free PSS otopinom, kako bi se odredila
maksimalna dilatacija ispitivane žile. Ca-free PSS otpina sadrži:
- Za pripremu 0,5 L:
 Destilirana voda: 450 mL
 Salt Stock Ca-free otopina: 25 mL
 Buffer Stock Ca-free otopina: 25 mL
 Glukoza: 0,5 g
 NaH2PO4: 0,07 g
pH otopina PSS i PSS Ca-free mora biti između 7.35 i 7.45.
3. Pokus i protokoli
Svaki pokus započinje pripremom PSSotopine, lijekova koje planiramo koristiti te aktivacijom
sustava. Nakon što pokrenemo sustav te otvorimo izvor plina, moramo propustiti PSS otopinu
kroz čitav sustav namještajući P1 tlak (inflow) na vrijednost od 150 mmHg, a P2 (outflow) na
70 mmHg, te moramo svakako upaliti grijač sustava na temperaturu od 37C.
3.1. Postupak izolacije srednje moždane arterije i eksperimentalni protokol
Pokusne životinje se važu i potom anesteziraju kombinacijom ketamina 75 mg/kg (Ketanest S
25 mg/ml, ampule 2ml, Pfizer) i midazolama 0,5 mg/kg (Midazolam Torrex 5 mg/ml, 3 ml,
Torrex Chiesi Pharma), nakon čega slijedi dekapitacija.
Pomoću mikrokirurškog pribora i operacijskog mikroskopa iz mozga se izolira središnja
moždana arterija, te se očišćena od okolnog tkiva postavlja između staklenih mikropipeta
(vanjskog promjera ~ 100-200 µm) smještenih u komorici koja je ispunjena toplom (37̊ C)
fiziološkom slanom otopinom (PSS, pH = 7.4 ± 0.05). Krajevi moždane arterije su pričvršćeni
tankim šavom (10-0 nylon Black) za pipete.

4. Sustav je kontinuirano oksigeniran smjesom plinova 21% O2, 5% CO2 i balans N2 (tlak ne smije
prelaziti vrijednost od 1.0 bara!).
Nakon postavljanja u komoricu, slijedi inkubacija krvne žile u trajanju od 60 minuta pri tlaku
od ∆80 mmHg (P1 je 80 mmHg, P2 0 mmHg), kako bi se procijenio osnovni (bazalni) promjer.
Žila je cijelo vrijeme snimana infracrvenom kamerom te se slika prikazuje na monitoru, a
bilježe se promjene promjera žile.
Nakon inkubacije, krvna žila će zatim biti izložena protoku koji se postiže istodobnim
promjenama ulaznog (inflow) i izlaznog (outflow) tlaka (tlačni gradijenti Δ10, Δ20, Δ40, Δ60 i
100 mmHg). Gradijent tlaka rezultirat će nastankom protoka pripremljene PSS otopine kroz
postavljenu krvnu žilu. Svakako se prilikom postavljanja krvne žile na staklene mikropipete
treba paziti da nema zaostalih mjehurića zraka, koji bi mogli oštetiti i ukoniti endotel iz krvne
žile.
Uloga dušikovog oksida (NO) u mehanizmu protokom potaknute dilatacije (flow-induced
dilation; FID), koja je o endotelu ovisna dilatacija, određuje se pomoću proučavanja FID u
prisutnosti L-NAME-a ( Nω-nitro-L-arginin metil ester) (10-5
mol/L) - inhibitora dušik oksid
sintetaze (NOS). Uloga COX metabolita određuje se u prisutnosti inhibitora ciklooksigenaze,
indometacina (INDO), dok se uloga metabolita enzima CYP450 ispituje u prisutnosti
selektivnog inhibitora CYP450 epoksidaze, MS-PPOH. Za ispitivanje protokom potaknute
dilatacije koja nije ovisna o endotelu koristi se izravan donor NO-a, natrij nitroprusid (SNP; 10-
6
mol/L), dok se za ispitivanje vazodilatacije ovisne o endotelu koristi acetilkolin (ACh, 10-6
mol/L). Odgovori na ACh i SNP procijenjuju se pri tlaku od 80 mmHg (stanje mirovanja bez
protoka). Da bi se procijenila postojanje i uloga oksidativnog stresa in vitro, mjeri se protokom-
posredovana dilatacija krvne žile u prisustvu "hvatača" superoksidnih radikala TEMPOL-a (100
μmol/L) u komorici. Na kraju eksperimentalnog protokola, krvne žile se izlože otopini PSS bez
otopine Ca2+
kako bi se izmjerio maksimalni promjer krvne žile. Podaci krvnih žila koje nisu
pokazivale značajnu razinu aktivnog tonusa (oko 50%), izuzimaju se iz obrade.
Aktivni tonus (%) izračunat je kao ((Dmax - Dbas) / Dmax) × 100, gdje su Dmax i Dbas najveći i
osnovni promjeri krvne žile (pri Δ 0 mmHg, bez protoka). Promjeri žila snimljeni su
infracrvenom kamerom, a slika je prikazana na monitoru.
4. Statistička obrada i prikaz podataka
Kako u našim pokusima najčešće koristimo više grupa pokusnih životinja te mjerimo odgovor
na pri nekoliko različitih vrijednosti protoka(Δ10, Δ20, Δ 40, Δ60, Δ100 mmHg), za obradu
podataka moramo koristiti two-way ANOVA repeated measures.

5. Slika 3. Bazični odgovor otporničkih arteriola potkožnog (SAT) i visceralnog (VAT) masnog tkiva na protokom
potaknutu dilataciju (FID), usporedba između 2 grupe