1. Molekularne metode mikrobiologije
1. Određivanje i identifikacija uzročnog uzročnik je vrlo važno pitanje u mikrobiološkim
dijagnostici.
Gradonačelnik proboj u kliničkim i dijagnostičkim mikrobiologije je učinjeno uvođenjem molekularnih
metoda u svakodnevnom dijagnostičke rutine.
2. Od otkrića tajni DNK spirale koja je prije pedeset godina, Svjedoci smo2. Od otkrića tajni DNK spirale koja je prije pedeset godina, Svjedoci smo
procvat metode za dijagnostičke postupke u Clinical Microbiologyprocvat metode za dijagnostičke postupke u Clinical Microbiology
3. ako je moguće da se u dijagnostičkim metodama molekularne mikrobiologije? jedan od glavnih
nastojanja usmjerena je na - izravno otkrivanje mikroorganizama uz identifikaciju
mikroorganizama
izuzetan značaj u području otkrivanja gena koji određuju virulencije i posebno otkrivanje gena koji određuju
otpornost na antimikrobna sredstva zadnje ali ne i najmanje su Bakterijski izolati upišete u epidemiološkim
istraživanjima
4. Dakle, molekularna dijagnostika u kliničkoj mikrobiologiji razvija u više pravaca
1. Pravilno identifikacija organizma izolira u čistom kulturom
2. Brzo detekcija izravno iz kliničkih uzoraka
3. otkrivanje organizama iz uzoraka od kojih je patogen nije izolirati od strane
tradicionalni uzgoj (npr. endokarditis) zbog
- Mala količina sredstava
- neodrživa mikroorganizmi
4. Karakterizacija uzročnika i za genotipizaciju
- otkrivanje otpornosti gena i drugih
- epidemiološki pokazatelji
5. Posebnu važnost treba staviti na otkrivanju nutricionistički zahtjevna bacteriaHACEK endokarditisa
(Haemophilus, Aggregatibacter, Cardiobacterium, Eikenella, Kingella koji su normalan dio ljudskog
mikrobiota, koji žive u usnoj-ždrijela regiji.
za sporo raste bakterija - roda Mycobacterium i
bakterija koje zahtijevaju posebne tehnike laboratorijskog uzgoja kao što su stanične kulture (treba imati na
umu važnost intracelularne bakterije). valja naglasiti mogućnost etiološki dijagnostičku u kliničkim slučajevima
Nakon već primjenjuje terapiju antibioticima, kada standardne metode nisu korisne, kao i
6. danas postoji primjena ovog dijagnostičkih metoda za: detekciju virusa
pandemijske
virusom humane imunodeficijencije 1 (HIV-1), virusom hepatitisa B (HBV) i C (HCV); uzročnici
spolno prenosivih infekcija kao dio programa za žene zdravstveni nadzor: Chlamydia trachomatis,
Neisseria gonorhoeae, ljudski papiloma virusa;
2. infekcije dišnog sustava;
Liječenje bolesnika liječenih s transplantacijom; neurotropni
virusa u likvoru sepse tekućine
7. Nažalost molekularna dijagnostika ima neke slabosti nedostaci
1. osjetljivost na inhibitore - lažno negativnih rezultata
2. Osjetljivost na kontaminacije - lažno pozitivni rezultati
3. Nemogućnost razlikovati od viabile neodrživa stanice
4. Nemogućnost dalje karakterizirati soj (osjetljivosti na antibiotike)
8. Međutim, slabosti su osvaja s brojnim pogodnostima Prednosti
brzina metode (važno za uspjeh liječenja)
Jedinstvenost metode (primjena u određene skupine pacijenata zbog nemogućnosti primijeniti druge metode)
Kvantitativno određivanje virusa (olakšana praćenje terapijskog učinka) piše u svrhu analize
epidemiološke
9. Iako se danas koriste mnoge metode, neke od najvažnijih su:
I. Nukleinske kiseline Križanje razvijen u 1970 i još
uvijek je u upotrebi
temelji na sposobnosti dvije jednolančane nukleinske kiseline imaju komplementarne sekvence i vežu se međusobno
stvaranja kiselinskog = dupleks ili hibridni dvolančanu nukleinsku.
Testni potrebe:
1.PROBE / sonde = jednolančane nukleinske kiseline (DNA, RNA) koja je izolirana od poznatog identiteta organizma
obilježene s enzimima i kemiluminiscentne molekule
2. ciljnu jednolančanu nukleinske kiseline iz nepoznatog organizam koji se detektira i identificirani.
PROBE se identificira organizam i razinu vrsta
10. postoje različite vrste hibridization kao što su
„Dot-blot” hibridizacija - izolirana DNA na membranu u obliku točkica Southern blot - DNA fragmente razdvoji od
elektroforeze na nitroceluloznom membranom na Northern blot - RNA blot je tehnika koja se koristi u istraživanju
molekularne biologije za proučavanje gensku ekspresiju detekcija RNA (mRNA), ili izolirane u uzorku.
Također slično tehnika može biti svjedok imunoblot ili Western blot hibridizacija - whicih služi za detekciju specifičnih
antitijela na elektroforezom izolira virusni antigeni se primjenjivali
3. nitroceluloznu membranu prema molekulskoj težini
Ag kompleksa i antitijelo-enzim detekcija obilježenih anti-mišjih antitijela ispita - obojeni crta na dio
membrane gdje ag i Ab vežu
Često se koristi kao metoda za potvrdu o specifičnosti antitijela u serologija (na ELISA)
12. drugi način, a najčešće i korišten je postupak Polymerase chain reaction PCR
Iz jednog primjerka DNK na nekoliko bilijuna kopija koje su dobivene u reakciji (2ndepending o broju kopiranje ciklusa)
PCR je popularizirao molekularnih metoda i uveo ih u dnevnu rutinu
13. Princip metode PCR je sadržana u nekoliko pravila: to je pojačanje određenog
fragmenta DNA u uvjetima in vitro, kao postupak množenje ovisi o brojnim čimbenicima i
uvjetima treba definirati, ne postoji niti jedan protokol,
i svaka reakcija protokol mora biti optimiziran prije
14. Za umnožavanje posebnog nukleotidnog slijeda među ostalim uvjetima trebamo dva kritična faktora: 1. klica (par
kratkih nukleotida koje predstavljaju granice: lijevo i desno od rezanja DNK koja se množi)
2.An enzim - termostabilna DNA polimeraza
Uspjeh reakcije ovisi o:
Odabir primera - Duljina u rasponu od 18 do 24 pb (do dugo - smanjuje učinkovitost podudaranja, prekratka -
dovodi do umnažanja nespecifičnu proizvod)
temperature za očvršćivanje: 50-65 ° C i uvijek 5 ° C niža od tališta „” točke
15. PCR u kratkim izgleda poput sheme u ovoj slici: postoje 3 koraka
16. nakon 30 ili 40 ciklusa od jedne DNA molekule imamo 1 bilion kopija ili amplikonima
17. Nakon koraka pojačavanja postoji potreba za otkrivanje amplikona i vizualizacije jedan od najčešće korištenih
metoda je gel elektroforeze - (, npr DNA, RNA i proteina) dobro poznata metoda za razdvajanje i analizu
makromolekula i njihovi fragmenti, na temelju o njihovoj veličini i naboja u električnom polju kroz matricu agaroze
18. Završni korak je dokumentacija gela sa foto kamerom
19. razvoj tehnologije stvoreni uvjeti za potpuno automatizirano RNA i DNA amplifikacija i sustava detekcije za rutinsku
dijagnostičku PCR kao što je ovaj jedan ovdje prikazan
4. klizač - sustav automatizira pojačanje i detekcija ciljane nukleinske kiseline izradu dijagnostičkog PCR rutinu
20. varijacije PCR razvijeni su na temeljima, kao što su ove lančane reakcije polimeraze
Reverzna transkripcija:
tehnika koristi za otkrivanje ekspresije gena stvaranjem komplementarne DNA (cDNA) transkripata iz RNA
21. i 22. Potpuno drugačija od RT-PCR, a često miješa s odvojenim i različita tehnike - stvarnom vremenu lančanom
reakcijom polimeraze također poznat kao lančane reakcije polimeraze kvantitativna.
Prati amplifikacija ciljane DNA molekula tijekom PCR, tj u stvarnom vremenu, a ne na kraju, u standardnim PCR
reakciji produkta su označeni fluorescentne boje i analizirana tijekom oblikovanja
Fluorescentne boje za označavanje proizvoda u realnom vremenu PCR i za određivanje broja RNA kopija u uzorku
uspoređujući sa standardnom krivuljom su:
1. SYBER Green 1 - vežu na novonastale dvostruke uzvojnice DNA i emitiraju fluorescentni koja mjeri
2. Oligonukleotid fluorescencije - sonda TaqMan
22. razina fluorescencije analizator mjere tijekom reakcije koja prijeđe u amplifikacije (ako postoje ciljna sekvenca
prisutna)
23. poštivanje RT-PCR i qPCR danas jedan od najčešće korištenih dijagnostičkih metoda molekulske temelju je Multiplex
PCR:
amplifikacijski višestrukih ciljeva u jednoj reakcijskoj posudi PCR
ova tehnika koristiti više klica u reakcijskoj smjesi daje multipleksiranje analizu, što znači da je više od jednog
ciljna sekvenca, mogu biti pojačan u isto vrijeme.
24. Slično sa Cobas Amplicor danas na tržištu mogu naći komercijalno dostupne multipleks PCR kao što je ovaj koji ima
snagu za istovremeno utvrđivanje 25 najčešćih bakterijskih i gljivičnih patogena izravno iz krvi bolesnika u kratkom
vremenu
25. postoje različiti drugi PCR postupak temeljen kao širok raspon PCR koji se koristi za detekciju univerzalnog
mikrobnih agenasa i PCR ciljaju 16S ribosomske RNA gen koji kodira - prvo koristi kao sredstvo taksonomskih, potom
u Clinical Microbiology
26. budućnost metode molekularne dijagnostike vjerojatno pripada DNA mikropolju (također poznat kao DNA chip ili
biočip), koji se može koristiti za mjerenje razine ekspresije velikog broja gena istovremeno ili genotip više područja
genoma. DNK se koriste microarray sonde (ili izvjestitelji ili oligonukleotida) i mogu se hibridizira cDNA ili cRNA na točne
pozicije na površini čipa kvarca prekrivene.
5. 27. primjena DNA chip su: analiza ekspresije gena, transkripcijski faktor analize i genotipizacija vezanje s
mogućnošću detektirati jednu nukleotidnu--polimorfizam. Koji bi ova metoda molekularne metode u budućnosti.
