Eksperimentalne metode i skupovi velikih podataka

1. Improved Medical Education in Basic
Sciences
for Better Medical Practicing
ImproveMEd
Sistemska biologija za medicinu
II. Eksperimentalne metode i skupovi velikih podataka

2. Eksperimenti u sistemskoj biologiji ne moraju biti omički razmjeri kako bi zadovoljili kriterije biologije
sustava!
Razmotrite eksperimente usmjerene na podsustave kao što su npr. praćenje mRNA energetskog
metabolizma pod različitim režimom hranjenja, ili u više vremenskih točaka od početka hranjenja.
Koja se biologija sustava razlikuje od uobičajenih znanstvenih istraživanja:
1. Kvantitativni podaci - gdje, koliko i koliko brzo (dinamički, ovisnost o vremenu) će se entitet promijeniti
2. Računalni modeli - simulacije temeljene na preciznoj kvantifikaciji i vremenu
Još uvijek su potrebne pozitivne i negativne kontrole i najmanje 3 ponavljanja!
2. Hipoteze pokrenute studije koje
prate ciljani podskup molekula (ili ciljanih
organela) - biologija sustava malih
razmjera.
1. Hypothesis generating studies!

3. molekule:
• DNAs tehnologije s mikroračunalima i sekvenciranjem
• RNAs mRNA sequencing
• proteini Proteomika na bazi masene spektrometrije
• lipidi tekućinska kromatografija i masena spektrometrija
• metaboliti tekućinska kromatografija Masena spektrometrija

4. Prosječne populacijske tehnike
• Populacija stanica ili uzorak tkiva
≈ 1 milijun stanica ili više
• Prosječno u mnogim stanicama
Tehnike pojedinačnih stanica
• Jedan uzorak stanica
• Varijabilnost stanica-stanica
HepaRG stabilna stanična linijaTkivo jetre Sferoidi hepatocita

5. Mikropostrojima -
diferencijalni izraz
• Dominantna tehnika 2000-ih
• Uglavnom se koristi za mjerenje razine transkripta
• Druge namjene: genotipizacija, DNA mapiranje
(variranje broja kopija), metilacija DNA
• Microarray se sastoji od mjesta otisnutih različitim
oligonukleotidom
• Hibridizacija između fluorescentno obilježenog uzorka
(probe) i tiskanih oligonukleotida
• GEO baza podataka
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.ht
ml

6. Array CGH usporedna genomska
hibridizacija
• molekularna citogenetska metoda /
kariotipizacija
• CNV relativan za ispitni uzorak
• Na temelju pretpostavke da se 2 uzorka blisko
povezanih osoba razlikuju (zdravi i bolesni) u
dobitku ili gubitku kromosoma ili kromosomske
regije
• Analiza velikog opsega tumor-specifičnih DNK
neuravnoteženih pregrada s rezolucijom od 5-10
megabaza
• OMIM baza podataka
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

7. Microarrays analiza metilacije -
epigenome
• Epigenetska regulacija ekspresije gena važna u razvoju, genetski otisak,
tumorogeneza ...
• Razina metilacije u genomu CpG na 30 000 do 500 000 CpG lokusa pokriva
cijeli genom
• Prvi korak je bisulfitna konverzija uzoraka - nemetilirana mjesta pretvaraju C u
U, dok metilirani gubitak metilacije
• Pretvorena DNA se dalje pojačava (i U se razmjenjuje za T)
• Fragmentirani i denaturirani oligonukleotidi su hibridizirani s dvije vrste alel
specifičnih zrnaca za svako mjesto
• Konačni nukleotid aniliranog alel specifičnog oligonukleotida se dalje proširuje
obilježenim dDNT
• Softver izračunava relativnu fluorescenciju svakog lokusa i razreda kao 0, 0,5 ili
1 (homozigotni nemetilirani, heterozigotni ili homozigotni metilirani)
• ENCODE
https://genome.ucsc.edu/encode/dataMatrix/encodeChipMatrixHuman.html

8. Tehnologije utemeljene na
sekvenciranju
• Počinje s izolacijom DNA ili RNA nakon čega
slijedi ili DNA fragmentacija ili sinteza cDNA
• Sljedeći korak je amplifikacija (fragmenti
klonova u vektor, transformiranje bakterija s
vektorima i amplifikacija)
• Paralelno sekvenciranje mnogih kratkih
dijelova DNA
• Sastavljanje susjednih fragmenata

9. Whole-genome sequencing (WGS)
vs. whole-exome sequencing (WES)
• WGS pokušava slijediti cijeli genom. Neke sekvence su
tehnički izazovne za sekvencu (telomere, centromeres,
visoki CG sadržaj ili ponavljajući lokusi) i propustile su
ih uobičajene platforme za sekvenciranje što rezultira
95-98% pokrivenosti genoma, ali na uniformiran način.
• WES slijed samo eksome (kodirajuće sekvence) ili 2%
genoma, pomoću svakog egzoma je sekvenca 30-100x
(visoka dubina). DNA-RNA hibridizacija koristi se za
odabir kodirajućih regija što uzrokuje prekomjernu
zastupljenost takozvanih "vrućih točaka" i nedovoljnu
reprezentaciju propuštenih varijanti. Brža, sitnija i
jednostavnija analiza podataka, ali niska ukupna
pokrivenost.
uniform
bias

10. Sekvenciranje exomea koristi korak
obogaćivanja za odabir ciljane DNA
• Mendelski poremećaji često narušavaju regije koje
kodiraju proteine
• Exom je dobar izvor varijanti rijetkih bolesti
• Mikroarije se mogu koristiti za izolaciju fragmenta
• WES daje visoku dubinu sekvenciranja
• Bamshat i sur. (2011) Pregled prirode Genetika

11. Trošak po genomu je pobijedio u utrci, a
WGS postaje poželjna metoda, posebno
za pregradnje specifične za tumor
Evolucija metoda sekvenciranja
• Prva generacija Sanger sekvenci; tehnologija
završetka lanca - ddNTPs koji se koriste za
prekidanje sinteze lanca dalje odvojene
kapilarnom elektroforezom (jedna traka u isto
vrijeme, spora, točna, skupa)
• Drugi (sljedeći) niz sekvenciranja -
sekvenciranje sintezom - uvođenje nano-
tehnologije - paralelno sekvenciranje i nema
potrebe za korak razdvajanja - granice u
dužini čitanja
• Sekvenciranje treće generacije - imobilizirana
polimeraza + fluorescentna dNTP + izvrsna
optika - detekcija ugradnje baze i modifikacija
baze

12. Podaci koji dolaze iz WGS-a ili WES-
a zahtijevaju provjeru preko velike
populacije! (više od 1000
pojedinaca)
Baza podataka o genotipovima i
fenotipovima (dbGaP)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap
Studije udruživanja u genomu
Foo et al. (2012) Nature Review Neurology

13. TranskriptomRNA-Seq
• Paralelno sekvenciranje mRNA, rRNA, miRNA ...
• Profil ekspresije gena
• Kvantitativna metoda idealna za eksperimente
biologije sustava
• Identifikacija alternativnih varijanti spajanja i nove
varijante transkripta
• GEO baza podataka
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.htm
l
• Ciljne baze podataka skeniranja (miRNA)
• http://www.targetscan.org/vert_71/
Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics

14. RNA-seq postaje dominantna metoda
transkriptoma i zamjenjuje mikromreže
Wang et al.(2009) Nature
Reviews Genetics

15. ChIP-seq kromatinsko
imunoprecipitacijsko sekvenciranje
• Kombinira taloženje transkripcijskih faktora ili
drugih DNA vezujućih proteina (koristeći
specifična antitijela) ili histonske modifikacije
i duboko sekvenciranje ko-
imunoprecipitirane DNA
• Otkriva regulatorne sekvence, promotore,
pojačivače, prigušivače, razmaknice
• Funkcionalna organizacija genoma

16. Western blot je prva metoda prema
kvantifikaciji i identifikaciji više od jednog
proteina
• Polu-kvantitativna zbog nelinearne kinetike
iza enzimskog obilježavanja sekundarnih
antitijela i reakcije supstrata
• Također ima nelinearnu kinetiku u slučaju
kemiluminescentne reakcije ili ekspozicije X-
zraka
• LICOR je infracrvena fluorescencija koja daje
malo pozadine i fluorescentni signal je
linearno proporcionalan količini antitijela
• https://www.licor.com/bio/applications/quan
titative_western_blots/

17. Napredna i obrnuta fazna
proteinska matrica (FPPA i RPPA)
• Pokušaj transformacije Western blot metoda niske
propusnosti (8-16 traka za uzorke) u metodu visokog
protoka
• U verziji s prednje strane jedan se antibiotik nalazi na
slajdovima, a uzorci griva su ispitani na prisutnost
epitopa
• U obrnutoj verziji, mnoga antitijela (s visokom
specifičnošću) su uočena na slajdu i jedan uzorak je
ispitan za sva antitijela.
• Zahtijeva antitijela visoke specifičnosti, skupa.

18. Masovna spektrometrija
proteomics, lipidomics,
metabolomics
• Proteomika često koristi tandemsku masenu spektrometriju
(dvije masovne specifikacije izvedene paralelno)
• Kvantitativno zato što mjeri ukupnu razinu proteina
• Daje pojedinosti o post-translacijskim modifikacijama
• Ako se kombinira s imunoprecipitacijom daje informacije o
interakcijama proteina
• Uključuje mnoge korake: odvajanje, probavu, obogaćivanje,
ponavljanje razdvajanja, ionizaciju, filtriranje mase (MS1),
analizu fragmentacije i mase (MS2), identifikaciju,
kvantifikaciju
• Mnoge varijacije

19. Masovna spektrometrija
proteomics, lipidomics,
metabolomics
Završni korak temelji se na velikoj bazi
podataka poznatih peptida i bioinformatskih
potraga za šibicama.
Za lipidomiku i metabolomiku koriste se
različite verzije MS i različite baze podataka.
UniProtKB baza podataka
https://web.expasy.org/docs/swiss-
prot_guideline.html

20. Analiza proteomike dekodira razlike između MAPK puta u
normalnoj i tumorskoj stanici.
Choudhary & Mann (2010) Nature Reviews Molecular and Cell Biology

21. proteomics, lipidomics,
metabolomics
Završni korak temelji se na velikoj bazi
podataka poznatih peptida i bioinformatskih
potraga za šibicama.
Za lipidomiku i metabolomiku koriste se
različite verzije MS i različite baze podataka.
UniProtKB database
https://web.expasy.org/docs/swiss-
prot_guideline.html

22. Tekuća kromatografija (LC) i LC / MS
lipidomics, metabolomics
Palermo et al. (2017) Analytica Chimica Acta
Vrlo često se LC & MS kombiniraju i
koriste u slijedu. Također, lipidomska
i metabolomika mogu se vršiti u nizu
na istim uzorcima.
LC se koristi za dijeljenje uzorka u
frakcijama, kao tehnika razdvajanja,
dok se MS koristi za identifikaciju
molekula.

23. Eksperimenti biologije sustava prikupljaju
velike podatke koristeći metode visoke
propusnosti :
• DNAs Tehnologije temeljene na mikročipovima i sekvenciranju (NGS) exome / genome
• DNA + regulatory proteins ChIP-seq ReMap
• RNAs RNA-seq transcriptome
• Proteins MS proteome
• Lipids LC/MS lipidom
• Metabolites LC/MS metabolom