Ciljana dostava lijeka na jetru

1. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
Ciljana dostava lijeka na jetru
Autori: Vjera Ninčević, čaj Omanović i Martina Smolić
Pripadnost: Zavod za farmakologiju, Medicinski fakultet Osijek, Sveučilište u Osijeku, J.
Huttlera 4, 31000 Osijek, Hrvatska
U uobičajenim sustavima za dostavu lijeka (npr oralnom uzimanju ili intravaskularnu injekciju),
da je lijek distribuira po cijelom tijelu i sistemski krvotok (1). Kod većine terapijskih agenasa,
samo mali dio od lijekova dosegne organ interesa. Sustavu ciljanog davanja lijeka je poseban
oblik sustava za primjenu lijeka, gdje je terapijsko sredstvo je selektivno ciljaju ili dostavljene
samo na svoje mjesto djelovanja ili apsorpcija i ne neciljano organa ili tkiva ili stanica (2). Kao
što je sposobnost lijeka da se akumuliraju u ciljanom organu ili tkivu selektivno i kvantitativno,
neovisno o mjestu i načinu njegovog režima. Ciljano djelovanje lijeka može se postići pomoću
sustava nosača. Molekule nosača su razvijeni za njihovo selektivno i učinkovito staničnog
prihvaćanja, iskorištavanjem pojedinih receptora ili mjesta vezanja su prikazani na površinu
membrane ciljane stanice (3). Farmaceutski nosači obuhvaćaju lipoproteina, liposomi, micele,
mikrokapsule, mikročestice, stanice, eritrocita i topive polimere. (4).
Jetra je poznata po svojoj visokoj uzimanja lijeka zbog prolaza prvih učinaka i značajan funkcije
u metabolizmu i izlučivanju više spojeva u koje je ugrađena kao terapeutski lijek (5). Mnogim
slučajevima fatalne uključujući kronični hepatitis, enzimske deficijencije i hepatoma događa u
hepatocitima, a time jetra je kritična za ciljano tkivo isporuku lijeka (4). Hcpatocita je jedan od
tipova najviše istaknuta stanica u jetri i utjeloviti više od 80% od ukupnog broja rezidentnih
jetrenih stanica. Trošenje u drugim staničnim tipovima, kao Kupfferove stanice također se može
dogoditi (5, 6). Hcpatocita nije najvažniji cilj stanica u pojedinim bolestima jetre (5).
Hepatocitima predstavlja određivanje ciljane stanice u virusni hepatitis ili ne-alkohol inducirane
hepatitisa (NASH) (7). Kupfferovih ili endotelnih stanica određeni su ciljne stanice u akutnom

2. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
upalom jetre, dok je u fibroze jetre ili ciroze su hepatičke stelatne stanice (8, 9). U primarna
bilijarna ciroza ciljna stanica za terapijske intervencije je žučovoda stanica epitela i karcinoma
jetre je to stanica tumora (10, 11). Jetre sustava ciljanja koriste pasivno hvatanje mikročestica
reticuloendothelium ili aktivnog ciljanjem na osnovi identifikacije između jetre i liganada koji
nose čestica (12).
Razne dostupne mogućnosti za primjenu lijeka u različitim intrahepatičkih staničnih tipova su
na raspolaganju: ciljanje lijeka u hepatocitima, ciljanje na hepatičkih zvjezdastih stanica (HSC),
dostavnih sustava u Kupfferovim i sinusnih endotelne stanice, za ciljanje u žučne epitelne
stanice kanala i Sistemi hepatocelularni karcinom stanice (5).
1. Lijek za ciljanje hepatocitima
Ciljanje na asialoglycoprotein receptora (ASGP-R) je najčešće korištena metoda univerzalno
koristiti kao ciljni receptor za primjenu lijeka u hepatocitima (4, 13). Asialoglycoprotein
receptor (ASGP-R) ima afinitet vezanja na širokom rasponu molekula izlažu galaktozu i
Nacetylgalactosamine ostataka, kao što su asialoorosomucoid (AsOR), asialofetuina (AF),
sterylglucoside, laktoza, za ciljanje u hepatocitima (4, 14) ,
1.1.1. Priprema Orosomucoid
Orosomucoid je pripravljen u skladu s prethodno objavljenog protokola (15).
Svježe humani serum (oko 1,2 L) prenosi se cijev za dijalizu i dijalizira preko noći na 4 od
20 litara 0,05 M natrijevog acetata, pH 4.5. Dijaliziran plazma se centrifugira na 14000
rpm kroz 10 minuta pri 4 , Pelet se baca a supernatant se filtrira kroz filter 0.45u. Dijalizira i
filtrira serum je prošlo kroz stupac DEAE-celuloze. Kolona se zatim ispere s 0,05 M NaAc, pH
4,5 dok se eluat imao absorbanciju pri 280 nm, manja od 0,10. Kolona se zatim eluira s 0,1 M
NaAc pH 4 do apsorbancija eluensa je manja od 0,1. Nakon orosomucoid bogata frakcija se
ispere i prikupljaju, kolona se ispire s 0,05 M natrij-acetata, pH 3.0 i ponovno ekvilibriran s
0.05 M natrijevog acetata, pH 4.5. Orosomucoid eluat će dovesti do 50% zasićenja s
amonijevim sulfatom. Kako bi se omogućilo ovo zasićenja, smjesa se miješa preko noći pri 4 °

3. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
C , Nakon završetka procesa zasićenja, smjesa je centrifugirana na 14000 rpm tijekom 15
minuta na 4 ° C i supernatanta su uzete.
Da bi se otopina na 92% zasićenja, u supernatant kruti amonij sulfat se polako dodaje. To treba
se miješa na 4 najmanje 4 sata. Nakon procesa zasićenja završi, priprema otopina se
centrifugira na 14000 rpm tijekom 30 minuta na 4 ° C , Odvoji se supernatant. Spremanje i
otopi talog u minimalnom volumenu vode te prenesena u cijev za dijalizu. Ostavilo slobodan
volumen 3 puta za širenje dijalizata. Dijalizira protiv to 20 L vode (voda mora se promijeniti
nakon 1 dan) kroz 2 dana pri 4 ° C , Pohranjeni na -20 ,
1.1.2. Asialoorosomucoid (AsOR) - Rapid desialyation od glikoproteina
Asialoorosomucoid (AsOR) proizvodi kiselom hidrolizom orosomucoid izoliran iz
združenog humanog seruma (16). Izolirani ili je otopljen u vodi i isti volumen 0.1 N
H2S04 doda se u otopinu OR. Smjesa se zagrijava na 80 ℃ tijekom 1 sata u vodenoj
kupelji (hidrolizirati sijalne kiseline iz proteina). Kiselu hidrolizu smjesa je uklonjena iz
vodene kupelji, te neutralizira s NaOH. Zatim se dijalizira nasuprot vode s 2 promjenama
u roku od 48 sati, a zatim liofilizira. Provjeriti djelotvornost desialyation Warren testu
(15).
EDC karbodiimid poprečno povezivanje (1-etil-3- (3 ( '- dimetilaminopropil) karbodiimid) je
sredstvo za umreživanje zerolength navikli nekoliko karboksilnih i fosfatnih grupa do primarnih
amina, koji može reagirati s karboksilnom skupinom biomolekule, stvoriti amin- reaktivni
Oacylisourea intermedijer. Ovaj umreživač se koristi u raznim aplikacijama, kao što su
konjugaciju karboksi amin skupine u peptida i proteina, pričvršćivanje haptene na proteine
nosače i oblik imunogena stvaranje amidne veze u sintezi peptida, označavanje nukleinske
kiseline kroz 5 fosfatnih grupa i proizvodnji amin-reaktivne NHS-esteri biomolekula (17).
Postupak: EDC reakcija kako bi se dobio (PL poli-L-lizina)
Asialoorosomucoid-polilizin (ASOR-PL) konjugati su dizajnirani kao nosači za elektrostatski
vezuju za DNA ciljanim dovođenjem u jetre asialoglycoprotein receptora (ASGPr) za gensku

4. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
terapiju (15). Prvi EDC se uravnoteži do sobne temperature i nakon toga ASOR se otopi u
vodi, te filtrira kroz filter za štrcaljku od 0,45 sati. Poslije filter se ispere s vodom i filtrati se
spoje, pH se podesi na 7,4 s 0,1 N NaOH.
Poli-L-lizin se zatim otopi u vodi i pH otopine se podesi na 7.4 s 0.1
N NaOH. Zatim EDC se otopi u vodi i doda se izravno u otopinu ASOR. PL otopina se dodaje
u otopinu ASOR-EDC-a, pH se ponovno podesi na 7.4 s 0.1 N NaOH. Reakcijska smjesa je
pokriven, miješa i održava pri 37 stupnjeva. EDC je otopljen u i doda se 2,3 sati na i 3.2 sati.
Nakon 72 h, reakcijska smjesa na 37 ℃ se prenese u cijev za dijalizu i dijalizira na 4 ℃
prema vodi za vrijeme 2 dana uz jednu promjenu vode. Dijalizat je liofiliziran i dobiveni
materijal se preparatively elektroforezi kroz kiselina-urea gelu preparativnom s 10 ml
skupljenom gelu (15).
EDC karbodiimida poprečno povezivanje
1.1. Primjer lijeka:

5. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
Ribavirin monofosfat konjugacija na AsOR
Asialoorosomucoid je pripremljen desijalilacija ljudske orosomucoid kao što je prethodno
opisano. Postupak za kemijsko vezanje na protein, RMP AsOR, kao sredstva za vezanje na
vodene otopine, bilo koristeći 1-etil-3-diisopropylaminocarbodiimide (EDC) (Pierce
Biotechnology, Rockford, IL). Otopina nukleozid-monofosfat (RMP 1 mM) radi sa 0,1 M EDC
u 0.5 M MES pufera pH 6,0, uz 0,01 mM AsOR u ukupnom volumenu od
2 ml. Nakon što je smjesa reagira na 25 ℃ jedan dan. Konačni Reakcijska smjesa je pročišćena
dijalizom kroz membranu sa 12-14 k Da molekularne težine prekidom na, u odnosu na četiri
litre destilirane i hladne vode sa šest do deset razmjene. Za kondenzaciju koso time protokolu
koji su opisali B. Chu et al. (18). EDC, i oligonukleotidi AsOR reakcija volumen i koncentracija
su različiti. Kvantitativno iskorištenje od konjugacije je procijenjena promjene smjene AsOR i
AsOR-RMP konjugata na denaturaciju SDS-PAGE elektroforeze (19).
Brojni se lijekovi ne postigne optimalna učinkovitost zbog njihove sustavne toksičnosti i
ozbiljnih nuspojava koje ponekad je potrebno doza spuštanje ili prestanak liječenja.
U zaključku, ciljana isporuka lijekova, u odnosu na zajedničku otpuštanja lijeka u sva tkiva i
organa u tijelu, povećava učinkovitost lijeka i izbjegava sistemskih nuspojava (19).

6. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
References:
1. Muller RH, Keck CM. Challenges and solutions for the delivery of biotech drugs--a
review of drug nanocrystal technology and lipid nanoparticles. J Biotechnol.
2004;113(1-3):151-70.
2. Bertrand N, Leroux JC. The journey of a drug-carrier in the body: an anatomo-
physiological perspective. J Control Release. 2012;161(2):152-63.
3. Mishra N, Yadav NP, Rai VK, Sinha P, Yadav KS, Jain S, et al. Efficient hepatic
delivery of drugs:
novel strategies and their significance. Biomed Res Int. 2013;2013:382184.
4. S.Gorad R, K.Mandlik S, N.Gujar K. Liver Specific Drug Targeting Strategies: A
Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research.
2013;4(11):4145-57.
5. Poelstra K, Prakash J, Beljaars L. Drug targeting to the diseased liver. J Control
Release. 2012;161(2):188-97.
6. Smith JS, Xu Z, Byrnes AP. A quantitative assay for measuring clearance of
adenovirus vectors by Kupffer cells. J Virol Methods. 2008;147(1):54-60.
7. Wieckowska A, McCullough AJ, Feldstein AE. Noninvasive diagnosis and monitoring
of nonalcoholic steatohepatitis: present and future. Hepatology. 2007;46(2):582-9.
8. Thakur V, McMullen MR, Pritchard MT, Nagy LE. Regulation of macrophage
activation in alcoholic liver disease. J Gastroenterol Hepatol. 2007;22 Suppl 1:S53-6.
9. Friedman SL, Bansal MB. Reversal of hepatic fibrosis -- fact or fantasy? Hepatology.
2006;43(2 Suppl 1):S82-8.
10. Robertson H, Kirby JA, Yip WW, Jones DE, Burt AD. Biliary epithelial-mesenchymal
transition in posttransplantation recurrence of primary biliary cirrhosis. Hepatology.
2007;45(4):977-81.
11. Fabregat I, Roncero C, Fernández M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance
in liver cancer. Liver Int. 2007;27(2):155-62.
12. Park JH, Saravanakumar G, Kim K, Kwon IC. Targeted delivery of low molecular
drugs using chitosan and its derivatives. Adv Drug Deliv Rev. 2010;62(1):28-41.
13. Rensen PC, Sliedregt LA, Ferns M, Kieviet E, van Rossenberg SM, van Leeuwen SH,
et al. Determination of the upper size limit for uptake and processing of ligands by the
asialoglycoprotein receptor on hepatocytes in vitro and in vivo. J Biol Chem.
2001;276(40):37577-84.
14. Wu J, Nantz MH, Zern MA. Targeting hepatocytes for drug and gene delivery:
emerging novel approaches and applications. Front Biosci. 2002;7:d717-25.
15. McKee TD, DeRome ME, Wu GY, Findeis MA. Preparation of asialoorosomucoid-
polylysine conjugates. Bioconjug Chem. 1994;5(4):306-11.

7. “A cross-border region where rivers connect, not divide” –
Interreg V-A Hungary-Croatia Co-operation Programme 2014-2020
16. Volarevic M, Wu CH, Smolic R, Andorfer JH, Wu GY. A novel G418 conjugate
results in targeted selection of genetically protected hepatocytes without bystander
toxicity. Bioconjug Chem.
2007;18(6):1965-71.
17. Grabarek Z, Gergely J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active
esters. Anal Biochem. 1990;185(1):131-5.
18. Chu BC, Wahl GM, Orgel LE. Derivatization of unprotected polynucleotides. Nucleic
Acids Res. 1983;11(18):6513-29.
19. Virovic Jukic L, Duvnjak M, Wu CH, Wu GY. Human uridine-cytidine kinase
phosphorylation of ribavirin: a convenient method for activation of ribavirin for
conjugation to proteins. J Biomed Sci.
2008;15(2):205-13.