'Biologija sustava za medicinu'

1. Lecture 2 Heffer
1
Sljedećatemau'Biologijasustavazamedicinu'je 'Eksperimentalne metode i veliki skupovi podataka'
2
Vjerojatnose sjećate sprvogpredavanjadabiološki sustavi čestokoristeeksperimenttipaomics.Isto
tako,omic studije smatrajuse "hipotezomkojagenerirastudije".No,kakobi klasificiralineke studije
u tipsustavabiologije,eksperimenti ne trebajunužnobiti omic-scale i samastudijamože se temeljiti
na hipotezi.
Uzmimou obzireksperimentusredotočennapodsustave poputnpr.praćenje relevantne mRNA za
metabolizamenergije podrazličitimrežimomhranjenja,ili uviše vremenskihtočakaodpočetka
hranjenja.Štobi u dizajnueksperimentapretvorilostudijuubiologijusustava?
Treba zadovoljiti dvaglavnakriterija:
1. studijamora prikupiti kvantitativnepodatke,npr.odgovoriti napitanjakolikoi kolikobrzo
2. treba nam omogućiti izraduračunalnogmodelanatemeljueksperimentalnihpodatakaili paralelno
s eksperimentalnimpodacima.
Ipak,studije biologije sustava se ne razlikujuodbilokoje druge znanstvenestudije sobziromna
zahtjevnegativnihi pozitivnihkontrolai ponovljivosti
3
Metode u biologijisustavapokrivajuobje - makromolekulei male molekulske mase molekula.
Rasponnukleotidnihpolimeraistražujese dvjemavrstamatehnika- tehnologijamakoje se temeljena
mikroraskuili sekvenciranju.Rasponproteinaistražuje se masenomspektrometrijomdoklipidi,
glikani i metaboliti zahtijevajudodatnikorakodvajanjatekućinskomkromatografijom.
4
Biološki uzorakobičnoje komadtkivaili populacije stanicaizstanične kulture.Veličinauzorkaje
običnomilijuniliviše stanica.Zbogvarijabilnosti stanica,rezultatstudije je prosjek mnogihstanica
što može generirati velikueksperimentalnupogrešku.
Postoje tehnikekoje koriste jednustanicuili se temelje naklonovimajedne stanice.Utom slučaju
možemoočekivati eksperimentalnupogreškuzbogvarijabilnostistanica.
5
Tehnikamikropostrojatemeljise naSouthernblottehnici i DNA hibridizaciji - DNA sonde koje
predstavljajugeneili nekadrugamjestaugenomutiskajuse načvrstoj površini kaoštoje staklo,
plastikaili silikonski biočip.
Tehnikakoristi paralelnodvauzorka - jedanuzorakje kontroladokje drugi eksperimentalan.Uzorci
su različitooznačeni fluoroforama(običnocrvenoi zeleno) i naneseni naniztiskaniholigonukleotida.
Nakonkoraka hibridizacijei ispiranja,neke označene sonde ostajuvezane zatiskani oligonukleotidi

2. emitirajusvjetloodređenevalne duljine nakonekscitacije pomoćulasera.Laserski skenermjeri
intenzitetemitiranogsvjetlanarazličitimmjestima.Konačno,računaloizračunavaomjerintenziteta
crvenopremazelenomusvakoj točki.Obrazacse tumači kaopovećanje ili smanjenje ekspresijeako
su uzorci bili cDNA i ako smo određivali diferencijalnuekspresiju,štoje najčešćaupotreba
mikropostroja.Istatehnikamože se koristiti zagenotipizaciju(npr.detekcijaSNP-ova),mapiranje
DNA (varijacijabrojakopija),DNA metilacijui takodalje.
GEO baza podatakaje velikazbirkastudijadobivenihpomoćumikropostroja.
6
Usporednagenomskahibridizacijaje verzijatehnike mikropostrojarazvijenaposebnozacitogenetsku
upotrebu,takođerpoznatakaomolekularnacitogenetika.
Tehnikase temeljinapretpostavci dase 2 uzorka izbliskopovezanihosoba(zdrave i bolesne)
razlikujupodobitkuili gubitkukromosomaili dobitku/gubitkukromosomske regije.Tehnikaje
osobitoprikladnazadetekcijuaneuploidijai analizutumor- specifičnihpreslagivanjagenoma.
OMIM baza podatakasadrži rezultate izbrojnihCGHstudijai daje pregledgenazahumane bolesti.
7
Epigenetskaregulacijaekspresije genaimamoćpromijeniti sudbinustanicei ovisi outjecajuokoline.
CpG metiliranjeje jedanodmnogihoblikaepigenetskihmodifikacija. Mikropostrojizametilacijsku
analizusutehnikamjerenjaobrascaDNA metilacijevelikihrazmjerai dajukorisne informacije o
diferencijaciji,tumorogenezi,progresiji bolestiili djelotvornosti terapije.
Prvi korak u metodi je bisulfitnakonverzijauzorkaukojoj svaneimetiliranaCpGmjestapretvarajuCu
U, dok metiliranamjestaizgube metilaciju.Sljedeći korakje umnažanje kadase svamjestaU
izmjenjujuzaT,nakon čegaslijedi fragmentacijaenzimom, denaturacijai hibridizacijasdvije vrste
alel- specifičnihkuglicazasvaki lokus.Poravnavanjedenaturiraniholigonukleotidai oligonukleotidnih
sondi vezanihzakuglice specifičnoje zaalel.Nakonuspješnogporavnavanja,oligonukleotidnasonda
se produljuje sjednimfluorescentnooznačenimdDNT.Konačno,softverizračunavarelativnu
fluorescencijusvakoglokusai ocjenjuje gakao0, 0,5 ili 1 (homozigotnemetilirani,heterozigotili
homozigotmetilirani).
8
Metode mikropostrojaoslanjajuse nauspješnuhibridizacijuizmeđuoligonukleotidaizuzorka i
oligonukleotidapričvršćenihnamikročip.Metodaje ograničenabrojemoligonukleotidakoji
predstavljajuodređenelokuse ugenomu,zapravosdizajnommikročipa.
Metode temeljene nasekvenciranjunemajuovoograničenje i mogutestirati bilokoji broj prethodno
nepoznatihDNA ili RNA sekvenci.MetodazapočinjeizolacijomDNA iliRNA,nakončegaslijedi
fragmentacijaDNA ili sintezacDNA.Sljedeći korakje umnažanje koje se može obaviti namnogo
različitihnačina.Zatimslijedi paralelnosekvenciranjemnogih kratkihDNA fragmenata(takođerse
može obaviti namnogorazličitihnačina) i sve završi sastavljanjemsusjednihfragmenata - štose
obavljaračunalno.
9

3. Trenutačnose upotrebljavajudvapristupagenomskomsekvenciranju - cjelokupnosekvencioniranje
genomai cjelokupnosekvencioniranje egzoma.Doksekvencioniranje cijeloggenomapokušava
obuhvatiti cijeli genom,sekvenciranje egzomaje pristrano - usmjerenopremadijelugenomakoji se
transkribira.Istotako,sekvencioniranjeegzomaje brže,jeftinije,ima"većudubinu"(više čitanjapo
paru baza,sekvence odinteresase čitajumnogoputa) i lakše je za analizirati.
10
Ključnarazlikaizmeđucjelovitoggenomskogi cjelovitogegzomskogsekvenciranjaje i korak
obogaćivanjaukojemse odabiruciljani fragmenti DNA izcijeloggenoma- oni koji se prepisuju.
Razdvajanje se vrši hibridizacijom, amicroarraysje jedanodnačinaza to. Budući da Mendelovski
poremećaji čestoprekidajuregije zakodiranjaproteina,egzomje dobarizvorrijetkihvarijanti bolesti.
11
Unatoč očiglednimprednostimacjelo-egzomskog sekvenciranja,sekvencioniranjecijeloggenoma
postaje preferiranimotoda.Jedanodrazlogaje ogromanpadcijene sekvenciranja,čaki veći od
očekivanogpremaMoorovomzakonu.Sdruge strane,sekvencioniranjecijeloggenomaimaočitu
prednostuotkrivanjutumor-specifičnihpregradnji.
Prva generacijametodasekvencioniranjabilaje bazirananaSangerovoj ideji "tehnologije terminacije
lanca" - umjestodase sekvencioniradegradacijomprvobitnoglanca,ddNTPsukorišteni zaprekinuti
sintezulancana uređennačin.Metodaje bilatočna,ali spora i skupo.Druga(ili sljedeća) generacija
metodasekvenciranja takođerje sekvenciralasintezom, ali paralelnosekvenciranje,uvođenje nano-
tehnologije i izostavljanje korakarazdvajanjaznatnosupoboljšali performanse.Metodaje bilabrzai
jeftina,ali manje pogodnazaduge fragmente.Ovoograničenje korigirase usekvenciranjutreće
generacije koje se temelji naotkrivanjufluorescentnihdNTP-atijekomugradnje pomoću
imobiliziranepolimeraze i izvrsne optike.
Posljednje dvije generacije sekvencioniranjakoristese ponovljenimsekvenciranjemDNA fragmenata
- takozvanimdubinskimsekvenciranjem - štopovećavaosjetljivosti točnost.
12
Podaci koji dolaze izcijelo- genomskogili egzomskog sekvenciranjatrebajudodatnuprovjerukroz
podatke ovelikoj populacijikakobi bili sigurni daje određenagenomskavarijantapovezanaili nije
povezanaspojavombolesti.Studijegenomskogudruživanjaprocjenjujurizikgenetskihvarijantikoje
se odvajajuunutarobitelji kojinose određenubolest.
13
RNA-Segili cjelokupnosačmaricasekvenciranje transkriptomaje kvantitativnametodakojakoristi
sekvencioniranje sljedećegeneracije kakobi se sekvencirali dijelovi genomakojisuuupotrebi –
odnosnotranskriptom.Ukupnaili filtriranaRNA (samokodirajući ilinekodirajući sljedovi) pretvorise
reverznomtranskriptazomucDNA,sekvencirai mapiranareferentni genom.Budući dapretvorba
RNA u cDNA može uvesti pristranosti, direknoRNA sekvenciranjejednemolekule (DRSTM) je

4. tehnologijaurazvoju.Bilokojaodovihdvijumetodaidealnaje zabiologijusustava,budući daje
kvantitativnai sposobnapratiti promjene koje se javljajuzbogokolišnihuvjetaili vremenapoput
alternativnogprekrajanja,posttranskripcijskihmodifikacija,fuzije gena,mutacija - promjenau
ekspresiji genaopćenito.
14
RNA sekvencioniranje gotovoje potpunozamijenilomicropostroje koji suprethodnobili dominantna
metodaza određivanje transkriptazbog sposobnostiove metodedarazlikujurazličite izoforme,
razlikujualelne ekspresije, razlučivanjeodjedne baze,niske količine potrebne RNA i relativnoniskih
troškova.
15
ChIP-seq,sekvenciranje imunoprecipitiranogkromatinaje jošjedna metodasekvenciranjakojase
razlikuje odsvihostalihuodabiruDNA fragmenata.Prvi korakuovoj metodi je ko-precipitacija
transkripcijskihfaktoraili drugihDNA vezujućihproteinai DNA fragmenatakorištenjemspecifičnih
protutijela.Metodaje također osjetljivanamodifikacije histona.Nakonpročišćavanja,odabrani
fragmenti supodvrgnuti dubokomsekvenciranju.Ovametodaje pogodnazapronalaženje
funkcionalnihelemenataugenomu - regulatornihsljedova,promotora,pojačivača,prigušivača,
mjestaprekrajanjai slično.
16
Kao štosmo prethodnorekli,metode prikladne zabiologijusustavamorajuzadovoljiti dvakriterija -
biti u stanjumjeriti istodobnomnoge entitete i buti kvantitativne - ati sukriteriji zadovoljeni u
slučajuvećine DNA i RNA metodasekvenciranja.Westernblotje bioprvametodakvantifikacije i
identifikacije više odjednogproteina,ali zbogkorakaumetodi - vizualizacije smatrase semi-
kvantitativnim.Glavni problemje nelinearnakinetikaizaenzimskogoznačavanjasekundarnih
antitijelai takođerizareakcije kemiluminiscencije i ekspozicije rendgenskihfilmova.Nedavnoje
problemriješenpomoćutehnologijeLICORkojakoristi sekundarnaantitijelaoznačenasIRDye
fluorescentnimbojamabliskiminfracrvenomspektru(NIR).Ovi NIRfluorescentnisignalisu
mjesecimastabilni - nemaenzimailisupstrata,pozadinskisignal je minimalan,asignal uzorkaje
proporcionalankoličini antitijela.
17
LICOR je riješiosamoproblemkvantifikacije,ali Westernblotje jošuvijekmetodaslabe propusnosti
jermjeri vrloograničenuskupinuproteina - oko20 po uzorkukoji sadrži nekolikotisućarazličitih
proteina.
Metode mikropostroja zaproteine naprednei obrnute faze sukorakprema naprijedmjerenju
mnogihentitetaodjednom.Obje metode temelje se navisokospecifičnimprotutijelima.Upostupku
premanaprijedjednoje antitijelopričvršćenonapodlogui nanjemuse ispitujumnogi uzorci.U
postupkuobrnute faze mnogarazličitihprotutijelaje pričvršćenonapodlogui samojedanuzorak se
ispituje naprisutnostodabranihproteina.Budući daove metode zahtijevajuvrlospecifičnaantitijela,
vrlosu skupe.
18

5. Druga metodavelike propusnostizaanalizuproteinaje masenaspektrometrija.Metodapostoji u
mnogimvarijantamai uključuje mnogekorake:odvajanje,digestiju,obogaćivanje,ponovljeno
razdvajanje,ionizaciju, filtriranje premamasi (MS1),fragmentiranje i analizumase (MS2),
identifikaciju,kvantifikaciju.Nakrajudobivamomolekularnumasumnogihentitetakoji sačinjavaju
uzoraki uspoređujemoihsbazompodatakapoznatihpeptidakakobismoihidentificirali.Methodje
svestranai koristi se s nekimizmjenamane samozaproteomiku,veći za lipidomiku,glikomikui
metabolomiku.
19
Posljednji korakumasenoj spektrometrijije usporedbapodatakadobivenihzaodređeni uzoraks
podacimau bazi podataka.Svakaomica se oslanjana drugubazu podatakai bioinformatičkotraženje
podudarnosti.Različiti maseni spektrometrijskipostupci se razlikujupopropusnosti - naprimjer,
analize metabolomamogumjeriti odnekolikostotinadonekolikotisućarazličitihentitetaodjednom.
20
Može se reći da transkriptomi proteommjere isto,ali suzapravokomplementarni.Nekavrlovažna
otkrićadošlasu iz proteomskihstudija,naprimjerproteomske analize sudekodiralerazlikeizmeđu
MAPK putau normalnoj i tumorskoj stanici.Proteomske studijesuosjetljive napostranslacijske
modifikacije kaoštoje fosforilacijai glikozilacija,koje suposebnovažne usignalnimputovimai
aktivaciji ili deaktivacijienzima.Studije transkriptomasuslijepeprematakvimmodifikacijama.
21
Tekućinskakromatografijase čestokoristi ukombinaciji smasenomspektrometrijom.Akose koriste
zajedno,tekućinskakromatografijaprethodi masenoj spektrometriji i koristi kaokorakodvajanjaza
MS. Također,korištenjemLC/MS,lipidomi metabolommogubiti učinjeni uslijedu,naistim
uzorcima,štopovećavapropusnostmetode.
22
U genomskimi proteomskimistraživanjimamožemoočekivati varijacije ueksperimentalnim
podacimazbograzličitihizvoravarijacija.Ugenomskimstudijamaizvorvarijacijaje:
Biološkavarijacijaizmeđuuzoraka(osobitoakoje uzoraktkivo)
Broj sondi koji predstavljajugen - moramoshvatiti daje prikladnasekvencakojapredstavljagen
ponekadkompliciranazapronalaženje.
Križnareaktivnostsonde
Različiti proizvođači mikročipova
Primjenasoftveraza"uklanjanje"tehničkihartefakata
U proteomskimstudijamaizvorvarijacijaje:
Biološkavarijacijaizmeđuuzoraka(i pripreme uzoraka)
Broj peptidapoproteinuproizvedenenzimskomrazgradnjom
Prekomjernopredstavljanje najzastupljenijihproteina
Prikladnaanalizapodataka- štose tiče poboljšanjatražilicai bazapodataka.

6. 23
Ukratko - Eksperimenti biologijesustavaprikupljajuvelikepodatke pomoćumetodavisoke
propusnosti.
U slučajuDNA prikladne sumetode mikropostrojai NGS.Rezultattakve analizeje genomili egzom.
Akobismoželjeli istražiti regulatorne elemente ugenomumetodaizboraje ChIPI-seqi rezultatje
ReMap. Kodirajuće i nekodirajuće RNA kojemožemoistražiti pomoćuRNA-seqkakobismodobili
transkriptom.Metodaizboraza proteine je MS,a lipidom, metabolomi glikommožemodobiti
pomoćuLC / MS.