2. Рестрикция ДНК
- Разрезание молекулы ДНК в определенной
последовательности
Рестриктазы
1. Узнают определенные
последовательности в ДНК
2. Разрезают молекулу ДНК в определенных
местах
10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Polymerase chain reaction (PCR)
1983 г, Кэри Муллис
– метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количества
определённых фрагментов ДНК
• «Полимеразная» - используется фермент ДНК-
полимераза
• «Цепная» - состоит из повторяющихся циклов,
количество ДНК с каждым циклом увеличивается в
геометрической прогрессии
13. Компоненты ПЦР
Праймеры
Определяют амплифицируемый участок
Служат «затравкой» для синтеза ДНК
dNTP «Строительный материал»
KCl
Моновалентные катион необходим для оптимальной
гибридизации праймеров
Tris Поддержание оптимального для ферментативной реакции рН
MgCl2 Бивалентный катион необходим для работы фермента
Полимераза Осуществляет синтез ДНК
Матрица Анализируемый образец ДНК
Буфер
24. Применение ПЦР для диагностики
генетических нарушений
Анализ делеций Анализ транслокаций
25. Разновидности ПЦР
• Hot-start PCR – для повышения специфичности реакции
• Touch-down PCR – для повышения специфичности реакции
• Allele-specific PCR– для выявления однонуклеотидных различий
• RT-PCR (reverse transcriptase PCR)– для амплификации РНК
• Asymmetric PCR– для получения одноцепочечного продукта ДНК
• Real-time PCR, qPCR
• Inverse PCR– если известна небольшая последовательность внутри
амплифицируемого участка
• Nested PCR – две последовательные реакции (для повышения
чувствительности и специфичности)
• PCR mutagenesis – две направленного внесения замен в
последовательность
33. ПЦР в реальном времени
(Real-time PCR)
• одновременная амплификация и измерение количества
продукта
• наличие флюоресцентного красителя в смеси
• наличие оптического блока в амплификаторе
линейный lg
33
34. Системы детекции
1. Неспецифичные
– интеркалирующие красители (SYBR Green и др.)
2. Специфичные
– линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
– «молекулярные маячки» (beacons)
– примыкающие пробы
36. Метод TaqMan
(линейные разрушаемые зонды)
флуоресцентные зонды и гашение флуоресценции
флуоресцентный
краситель
гаситель
флуоресценции
зонд
специфический фрагмент
ДНК
FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer
37. FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer
Резонансный перенос энергии флуоресценции
54. Виды ПЦР-анализа
Качественный анализ
Сравнительный анализ
(полуколичественный)
Количественный анализ
есть нет
больше меньше Х раз
лечение
10 000 копий 1000 копий
55. Количественная ПЦР (qPCR)
• Подсчёт числа копий генов
• Анализ представленности транскриптов
• Оценка инфекционной нагрузки
57. Преимущества Real-time PCR
• возможность как качественной, так и количественной оценки исходной матрицы
• отсутствие манипуляций после проведения ПЦР (электрофорез)
• большая чувствительность (от единичных копий) и специфичность
• большой динамический диапазон концентраций (порядка 10^7)
• возможность постановки Multiplex анализа
58. 1. Научные исследования
– амплификация ДНК для гибридизации
(блоттинг, микрочипы)
– амплификация ДНК для секвенирования
– клонирование геномной ДНК, кДНК
– филогенетическое сравнение геномов
– генетическое картирование
– анализ уровня транскрипции
Применение ПЦР
59. 2. Медицина
– генетическое тестирование
– типирование тканей (для трансплантации)
– тестирование мутаций в онкогенах
– диагностика инфекций
3. Судебная медицина
– ДНК-дактилоскопия
– установление родства
4. Анализ пищевых продуктов, детекция ГМО
Применение ПЦР
60. Применение ПЦР
Залог успеха ПЦР
• высокая чувствительность
• высокая специфичность
• высокая устойчивость
• низкая стоимость, быстрота
Получение информации
• анализ уровня
транскрипции
• ДНК-диагностика
• генотипирование
Получение материала
• клонирование ДНК
• мутагенез
• секвенирование
64. О-
ОCH2
ОP
О
О–
О-
3`
4`
5`
2`
1`
Н
Использование UDG – метод борьбы с
контаминацией продуктами ПЦР
2) При нагревании до 950С UDG инактивируется, а AP-сайты
расщепляются, в результате урацил-содержащая ДНК, попавшая в
пробирку до начала ПЦР, деградирует
3) Проводится обычная ПЦР, реакционная смесь очищена от продуктов
предыдущей амплификации
65. Digital PCR (dPCR)
65
R
P
M 1ln М – среднее количество целевой ДНК на сегмент реакции (на основе
распределения Пуассона)
Р – доля сегментов, содержащих ПЦР-продукт
R – общее кол-во проанализированных сегментов
Лимитирующие факторы dPCR:
• Количество сегментов реакции
• Концентрация целевой ДНК в анализируемом образце
• Реакционный объѐм
66. Коммерчески доступные системы,
реализующие dPCR
66
Fluidigm - технология
микрофлюидных чипов
Bio-Rad (QuantaLife) -
dPCR в суспензии
(Digital Droplet PCR)
Life Technologies
dPCR в платах
OpenArray®
68. Сравнение с Real-Time PCR
68
Digital PCR: a powerful new tool for noninvasive prenatal diagnosis? Bernhard G. Zimmermann, Simon Grill,
Wolfgang Holzgreve. Prenat Diagn 2008; 28: 1087–1093.
