A brief outline of RNA synthesis basics

1. ДНК – РНК – БЕЛКИ

2. Отличия РНК от ДНК
• Рибоза вместо 2’-O-
дезоксирибозы
• Урацил вместо тимина

4. Что есть «консенсус»?

5. WEB-LOGO
TATGTT
CATGAT
TATGCT
TACTGT
TGTCAT
TTAACT
TAGACT
TAGGTT
TATGAT
TATAAT
TATAAT
TATTAT
• Высота стэка букв отражает
консервативность
• Высота индивидуальных буквы
отражает частоту встречаемости
нуклеотидов (аминокислот)

6. Расположение промоторов в ДНК
(аденовирус)
Важное отличие РНК-полимераз от ДНК-полимераз: им не
нужна затравка (праймер)

7. Роль σ-субъединицы
 -35 -10
E.coli 70 TTGACA TATAAT
E.coli 32 TCTC-CCCTTGAA CCCCAT-TA
E.coli 54 (-24)CTGG-A (-12)TTGCA
B. sub A TTGACA TATAAT
B. sub  AGGTTTAA GGGTAT
B. sub D CTAAA CCGATAT
B. sub E ATATT ATACA
B. sub K AC CATA---T
B. sub H CAGGA GAATT—T
SPO1gp28 AGGAGA TTT-TTT
T4gp55 - TATAAATA

8. Разные σ-субъединицы регулируют
разные гены

9. Уровни регуляции экспрессии генов
• На уровне
транскрипции
• На уровне
стабильности мРНК
• На уровне
трансляции
• На уровне
стабильности белка

10. Анти-σ факторы
• Связывают σ-фактор, препятствуя инициации
транскрипции
• Обычно регулируют специфические σ-факторы,
необходимые для споруляции и т.д.
• Некоторые бактериофаги кодируют свои анти-σ-
факторы, чтобы заблокировать синтез клеточных
мРНК

11. Транскрипция генов бактериофага SPO1
• Транскрипция ранних мРНК, среди которых есть мРНК
σ28, осуществляется клеточным σ-фактором.
• σ28 запускает транскрипцию средних генов, в том числе и
σ34.
• σ34 отвечает за транскрипцию поздних мРНК.

12. Элонгация транскрипции
•Белок NusA вызывает паузы при
элонгации на определенных
последовательностях
•Белок NusG, наоборот,
препятствует паузам
•GreA и GreB узнают
«арестованные» комплексы, в
которых РНК-полимераза
«съехала» назад и содержит в
активном центре не 3’-конец РНК,
а дуплекс РНК-ДНК
•Mfd узнает комплексы, в которых
полимераза наткнулась на
непреодолимое препятствие,
например, тиминовый димер.

13. Структура полимеразного комплекса

14. • Скорость транскрипции 20-50
нуклеотидов в секунду при 37оС

15. Транскрипция и трансляция
•У прокариот трансляция
начинается еще до того, как
синтезируется
полноразмерная мРНК.
•У эукариот процессы
транскрипции и трансляции
разделены в пространстве и
во времени.

16. Регуляция лактозного оперона
•Лактоза – менее питательный
субстрат для бактерий, чем глюкоза
•Белок LacI в отсутствие лактозы
связывается с промоторной областью
оперона и блокирует транскрипцию.
•Когда лактоза есть, LacI связывает ее,
и не связывает ДНК.
•В отсутствие глюкозы в клетке
накапливается cAMP, связывая
который активируется CAP (catabolism
activation protein).
•Активированный САР связывается с с
лактозным опероном, и включает его
транскрипцию.

17. Искусственные системы на основе lac-
оперона
• Можно заставлять клетку (бактериальную)
включать или выключать синтез мРНК с
введенного в клетку гена
• Для активации можно использовать
негидролизуемый аналог лактозы: IPTG

18. Оперон
• Функциональная единица транскрипции
• В одной мРНК закодированы несколько белков,
участвующих в одном и том же процессе
• У эукариот (за редчайшим исключением!) в
одной мРНК всегда закодирован один
единственный белок

19. Терминация транскрипции (ρ-зависимая)
Фактор ρ (ро) – РНК-зависимая АТФаза (хеликаза)
Садится на мРНК и «ползет» в направлении 5’->3’ и, когда «догоняет»
РНК-полимеразу, терминирует транскрипцию

20. Терминация транскрипции (ρ-независимая)
В других случаях терминация транскрипции происходит вследствие
сигнала в самой мРНК: стабильная шпилька, за которой следует U-
богатый участок

21. Рибосома и РНК-полимераза. Кто-кого? I
При недостатке в клетке UTP рибосома ползет быстрее, но когда UTP много –
полимераза успевает синтезировать терминаторный сигнал.
Регуляция синтеза
мРНК, кодирующей
белок,
необходимый для
синтеза UTP.
Соответственно,
когда UTP в клетке
достаточно - этот
белок не нужен.

22. Альтернативные структуры в РНК

23. Рибосома и РНК-полимераза. Кто-кого? II
Когда в клетке мало триптофана, рибосома ползет медленно и образуется
более стабильная структура мРНК, предотвращающая терминацию.
Регуляция
белка,
необходимого
для синтеза
триптофана.
Когда
триптофана в
клетке много -
этот белок не
нужен.

24. Регуляция trp-оперона у Bacillus subtilis

26. «Незаряженная тРНК» как сигнал для
транскрипции

27. Когда вся тРНК проаминоацилирована -
транскрипция не идет

28. РНК-полимеразы эукариот
Полимераза Функция
I 18S, 4.5S, 28S rRNA
II mRNA, snoRNA, snRNA
III
5S rRNA, tRNA, U6
sRNA, vRNA

29. РНК-полимераза II

30. Базовая структура промотра

31. Отличия от прокариот
• Больше ДНК
• Хроматин
• Ядро
• По умолчанию у прокариот гены
включены, у эукариот - выключены
Как следствие,
больше
возможностей для
регуляции

32. Еще сложнее!
• Альтернативные факторы
транскрипции
• Альтернативные промоторы
• Альтернативные терминаторы
транскрипции
• Альтернативный сплайсинг

33. И еще сложнее!
• Энхансеры могут регулировать транскрипцию
на огромном расстоянии
• Иногда находятся вообще на другой
хромосоме

35. • α-аманитин
• Ингибирует РНК-
полимеразы II и III
• 5-6 мг летальны
для человека
• Смерть наступает через несколько
дней, и это отражает время жизни
мРНК у человека