Clostridum botulinum

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN

CLOSTRIDUM BOTULINUM VÀ
HỘI CHỨNG NGỘ ĐỘC THỊT
(BOTULISM)
GVHD:KS PHẠM MINH NHỰT

NHÓM 5:(07DSH02)

NGUYỄN ĐÔNG TRIỀU
VÕ THANH TRUYỀN
NGUYỄN HẢI YẾN
LÊ VĂN TUÂN

Clostridium Botulinum và hội chứng ngộ độc thịt (Botulism)

Mục lục

Lời nói đầu ........................................................................... trang 4
Chương I: Tổng quan về Clostridium Botulinum ........................................... 5

1.1. Giới thiệu chung về C.Botulinum ................................................................... 5

.1 Lịch sử phát triển ...................................................................................... 5

.1.2 Kiểu hình .......................................................................................... 6

.1.3 Phân loại .......................................................................................... 6

.1.4 Đặc điểm chung của C.Botulinum .................................................... 6

1.2 Cấu trúc ........................................................................................................... 8

1.2.1 Cấu trúc tế bào .................................................................................. 8

1.2.2 Cấu trúc phân tử................................................................................ 8

1.3 Hội chứng ngộ độc thit (Botulism) .............................................................. 9

1.3.1 Các triệu chứng ................................................................................ 9

1.3.2 Phát hiện và điều trị ........................................................................ 10

1.3.3 Các biện pháp kiểm soát .................................................................. 11

1.4 Đặc điểm của độc tố Botulinum .................................................................. 11

1.5 Cơ chế gây độc của độc tố Botulinum .......................................................... 12

1.6 Những ứng dụng tuyệt vời của C.Botulinum ............................................... 13

1.6.1 Trong y học....................................................................................... 13

1.6.2 Trong thẩm mỹ ................................................................................. 16

1.7.3 Hạn chế ............................................................................................ 16

GVHD Phạm Minh Nhựt - Nhóm 5
-2-


1.7 Các loại thực phẩm nhiễm C.Botulinum ....................................................... 16

1.8 Tình hình nhiễm C.Botulinum trên thế giới và tại Việt Nam ........................ 18

Chương II: Các phương pháp xác định C.Botulinum ................................... 20

2.1 Phương pháp xác định C.Botulinum truyền thống ..................................... 20

2.1.1 Môi trường và hóa chất ....................................................................... 20

2.1.2 Quy trình phân tích ....................................................................... 20

2.2 Phương pháp xác định C.Botulinum hiện đại ............................................. 23

2.1 Phương pháp ELISA ............................................................................ 23

2.2 Phương pháp PCR............................................................................... 25

Chương III: Kết luận và đề nghị ............................................................. 29

Tài liệu tham khảo .................................................................................. 30

-3-


Lời nói đầu
Hiện nay trong sinh hoạt hàng ngày, các loại thực phẩm đóng hộp có mặt
khá phổ biến trên thị trường và được rất nhiều người tiêu dùng sử dụng. Vào mùa
mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại càng quan tâm đến vấn đề dự
trữ các loại thực phẩm trong nhà để đối phó với những khó khăn có thể xảy ra. Một
trong những thực phẩm thường được dự trữ là các loại thực phẩm đóng hộp. Nếu
khi mua và sử dụng các loại đồ hộp không cẩn thận, con người có thể bị ngộ độc do
ăn phải mầm bệnh phát triển ở trong loại thực phẩm này. Ngộ độc thường được ghi
nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có trong đồ hộp, còn gọi
là ngộ độc Botulism, có thể gây tử vong.

Ngộ độc Botulism là bệnh ngộ độc thực phẩm mang tính chất cấp tính xảy
ra rất nặng, nó có thể phá hủy hệ thần kinh trung ương và gây tử vong cao. Bệnh
thường xảy ra sau khi ăn các loại thực phẩm dự trữ được đóng hộp như thịt hộp, cá
hộp, pa tê, xúc xích, rau quả ... Bệnh ngộ độc Botulism thường do loại vi khuẩn
Clostridium botulinum type A và B gây nên, vi khuẩn tiết ra độc tố botulotoxin, một
ngoại độc tố có độc tính rất cao, cao hơn hẳn các độc tố của các vi khuẩn khác. So
với độc tố gây bệnh uốn ván, nó mạnh gấp 7 lần (liều gây chết của độc tố uốn ván là
0,250 mg và của botulotoxin là 0,035 mg). Mặc dù vậy nhưng độc tố của nó dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao, chỉ cần đun thực phẩm lên đến 100 oC trong 10-30 phút thì
độc tố sẽ bị phá hủy hoàn toàn. Nhưng độc tố này rất bền vững với men tiêu hóa.

Bệnh ngộ độc Botulism là một bệnh nhiễm độc do độc tố của vi khuẩn
Clostridium botulinum xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra độc tố. Người
ǎn phải thức ǎn có độc tố sẽ bị nhiễm độc. Còn vi khuẩn thường không gây nên
bệnh vì nó không sinh sản được trong cơ thể con người. Gần đây, vai trò các bào tử
của vi khuẩn có mặt trong thực phẩm có khả nǎng gây ngộ độc là vấn đề đang được
nghiên cứu.

-4-


Chương I :Tổng quan về Clostridium
Botulinum
1.1 Giới thiệu chung về C.Botulinum:

 Vực (domain) : Bacteria

 Ngành (phylum) : Firmicutes

 Lớp (class) : Clostridia

 Bộ (ordo) : Clostridiales

 Họ (familia) : Clostridiaceae

 Chi (genus) : Clostridium Hình 1 : Clostridium
botulinum

 Loài (species) : C. Botulinum

1.1.1 Lịch sử phát hiện:

Clostridium botulinum lần đầu tiên được công nhận và cô lập năm 1896 bởi
Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào một ổ dịch botulism.
Các cô lập ban đầu được đặt tên là botulinus Bacillus. Tuy nhiên, cô lập từ các ổ
dịch tiếp theo luôn luôn tìm thấy là những bào tử dạng kỵ khí, do đó, Bengston đề
xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.
Từ năm 1953 tất cả các loài sản xuất độc tố thần kinh botulinum (loại AG)
được xác định là C. botulinum. Bằng chứng tồn tại số kiểu hình và kiểu gen đáng
kể đã chứng minh sự đa dạng trong loài. Điều này đã dẫn đến sự phân loại lại của
C. botulinum loại G giống như là một loài mới argentinense Clostridium.
Chủng Clostridium botulinum không sản xuất ra chất độc botulin được gọi là
sporogenes Clostridium .

-5-


Năm 2003 bộ gen của Clostridium botulinum được công bố với công trình của viện
Sanger với Tiến sĩ Roger Huston và Tiến sĩ M. Peck .

1.1.2. Kiểu hình:

Các danh pháp của C.botulinum công nhận bốn nhóm sinh lý (I-IV). Điều
này chủ yếu dựa trên khả năng sinh vật có thể tiêu hóa protein phức tạp. Nghiên cứu
ADN và cấp rRNA hỗ trợ các phân khu của loài này thành các nhóm I-IV. Hầu hết
các ổ dịch của botulism con người là do nhóm I (thủy phân protein) hoặc II (không
thủy phân protein) C. botulinum nhóm III chủ yếu là các sinh vật gây bệnh ở động
vật. Hiện đã có hồ sơ về C.Botulinum nhóm IV con người và động vật gây bệnh.

1.1.3 Phân loại C.Botulinum :

Sản xuất chất độc thần kinh là tính năng cơ bản nhất của C.Botulinum. Có 6
loại độc tố đã được xác định và phân bố ( từ A đến F). Clostridium botulinum sản
xuất độc tố loại B và loại F đã được phân lập từ các trường hợp người bị ngộ độc
thịt ở New Mexico và California.
Chỉ có các loại A, B, E và F gây bệnh ở người, trong khi các loại C và D gây
bệnh ở bò, chim, và động vật khác nhưng không gây ở người.
1.1.4 Đặc điểm chung của C.Botulinum:
Clostridium là các vi khuẩn gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần
lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng
lượng. Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa
nhiệt và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan
trọng là C.botulinum và C.perfringens.
C. botulinum là loài sống kỵ khí bắt buộc, chỉ tăng trưởng được trong môi
trường trung tính, không có sự cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Các dòng trong
loài này có các đặc điểm nuôi cấy khác nhau và có 6 kiểu kháng nguyên được ký
hiệu từ A – F. Kiểu kháng nguyên A, B và F có hoạt tính thủy phân protein tạo nên

-6-


một vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc trên môi trường Willis và Hobbs, còn các
kiểu C, D, E không có khả năng này. Kiểu A thường thấy trên các mẫu thịt trong
khi kiểu E chỉ được phân lập trên các mẫu cá.
Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường
có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày.
Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50 oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc
Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có
trong môi trường.
Độc tố Botulin được sản xuất bởi Clostridium botulinum được cho rằng là vũ khí
sinh học tiềm năng, mất khoảng 75 nanogram để giết một người (LD50 của
1ng/kg,giả định một người trung bình nặng ~ 75kg); 500 gram của nó sẽ là đủ để
giết một nửa số dân số toàn bộ con người.
Clostridium botulinum là một loại vi khuẩn đất. Các bào tử có thể tồn tại ở
hầu hết các môi trường và rất khó để giết.
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được ngăn chặn bởi axit cao, tỷ lệ của
đường hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp hoặc lưu trữ ở nhiệt độ dưới 38 ° F
(loại A).
Ví dụ: Mật ong, xirô bắp và chất ngọt khác có thể chứa các bào tử bào tử nhưng
không có thể phát triển trong nồng độ đường cao độ tuy nhiên khi nồng độ đường
bị pha loãng trong oxy thấp, acid thấp trong hệ thống tiêu hóa của trẻ sơ sinh thì các
bào tử có thể phát triển và sản xuất chất độc. Ngay sau khi trẻ bắt đầu ăn thức ăn
rắn, các loại nước tiêu hóa trở nên quá chua cho vi khuẩn phát triển.

-7-


Hình : Clostridium quan sát qua kính hiển vi
1.2 Cấu trúc
1.2.1 Cấu trúc tế bào

- Kích thước khoảng 0,3 – 0,7µm × 3,5 – 7,0 µm, có hình que, không có có roi.
- C.botulinum là vi khuẩn Gram (+)
- Sinh bào tử, bào tử thường to hơn chiều ngang của tế bào .
1.2.2 Cấu trúc phân tử
Bộ gen của Clostridium botulinum là 3.886.916 bp, trong đó G + C của
khoảng 28,2%, Ngoài ra còn có một plasmid 16.344 bp.
Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần
150.000 dalton. Ở cấu trúc này, phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấp, nhưng
khi bị một số enzym của vi khuẩn và trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000

-8-


dalton) và nhẹ (50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối sulfur có gắn với một
phân tử Zn.

1.3 Hội chứng ngộ độc thịt (Botulism)

Botulism là một căn bệnh bại liệt hiếm nhưng nghiêm trọng do botulin là độc
thần kinh và là sản phẩm của vi khuẩn Clostridium botulinum.

Hình: Cấu trúc phân tử của vi khuẩn Clostridium botulinum gây ngộ độc.

1.3.1 Các triệu chứng của Botulism:

Các triệu chứng cơ bản của Botulism gồm : làm tổn thương hệ thần kinh
trung ương (đặc biệt là đến các tín hiệu từ não đến cơ bắp), gây liệt cơ rõ nhất là liệt
cơ mắt (không có phản ứng với ánh sáng, song thị), liệt cơ vòm miệng, lưỡi hầu,
gây nên biến dạng mặt, nguy hiểm nhất là gây liệt trung tâm hô hấp, tim dẫn đến tử
vong.

-9-


Hình 2 : Vịt bị tê liệt mềm do bệnh

Trẻ sơ sinh với Botulism sẽ xuất hiện nôn nửa, kém ăn, táo bón, khóc yếu và
cơ không phát triển. Nếu không chữa trị, những triệu chứng này có thể phát triển
gay tê liệt cánh tay, chân, thân và các cơ bắp hô hấp. Các triệu chứng thường bắt
đầu từ 18 – 36h sau khi tiêu thụ thực phẩm bị ô nhiễm, nhưng cũng có thể xảy ra
sớm nhất là 6g hoặc trễ là 10 ngày sau khi tiêu thụ. Botulism có nhiều loại A, B, C,
D, E nhưng loại A, B, E cho độc tố mạnh nhất.

Hình: trẻ em bị nhiễm botulism

1.3.2 Phát hiện và điều trị :

- 10 -


Cách trực tiếp và hiệu quả nhất để xác định chẩn đoán lâm sàng của botulism
trong phòng thí nghiệm là chứng minh sự hiện diện của chất độc trong huyết thanh
hoặc phân của bệnh nhân hoặc trong thực phẩm bệnh nhân tiêu thụ. Hiện nay,
phương pháp sử dụng rộng rải nhất để phát hiện chất độc là thử nghiệm trung hòa ở
chuột , trong đó bao gồm việc tiêm huyết thanh hoặc phân người bệnh vào chuột và
tìm kiếm các dấu hiệu của Botulism, thử nghiệm này thường mất 48 giờ. Nuôi mẫu
vật mất từ 5 – 7 ngày.

Những suy hô hấp và tê liệt nghiêm trọng xảy ra với botulism có thể để bệnh
nhân sử dụng máy thở (thông gió) cho 1 tuần, cộng với chuyên sâu về y tế và chăm
sóc điều dưỡng. Sau vài tuần, tê liệt từ từ được cải thiện. Nếu chẩn đoán sớm,
botulism thực phẩm và botulism vết thương có thể được điều trị bằng một khối chất
kháng độc, hoạt động của các độc tố lưu hành trong máu này có thể ngăn ngừa bệnh
xấu đi, nhưng phục hồi vẫn phải mất nhiều tuần lễ. Bác sĩ có thể thử loại bỏ thực
phẩm bị ô nhiễm còn trong ruột bằng cách cho nôn ra hoặc rửa ruột. Đối vời vết
thương cần được điều trị, thường là phẫu thuật, để loại bỏ các nguồn sản xuất vi
khuẩn chất độc hại này bằng cách cung cấp thuốc kháng sinh thích hợp. Hỗ trợ
chăm sóc tố tại bệnh viện là yếu tố chính của liệu pháp cho tất cả các hình thức bị
nhiễm botulism.

1.3.3 Các biện pháp kiểm soát:

Các biện pháp để ngăn chặn botulism bao gồm giảm mức độ ô nhiễm vi sinh
vật, quá trình axit hóa, giảm mức độ ẩm, và bất cứ khi nào có thể, tiêu hủy tất cả các
bào tử botulism trong thực phẩm. Chế biến thực phẩm đóng hộp đúng cách sẽ
không có sự hiện diện của C. Botulinum.

Một thực phẩm có thể chứa C. botulinum vẫn không có khả năng gây ra botulism
nếu các sinh vật không phát triển, không có độc tố được sản xuất. Mặc dù nhiều loại
thực phẩm đáp ứng các yêu cầu về dinh dưỡng cho sự phát triển của C. botulinum,
không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí cần thiết.

- 11 -


1.4 Đặc điểm của độc tố Botulin

-Độc tố Botulin do vi khuẩn Clostridium Botulinum sinh ra (độc tố gây chết
do làm suy hô hấp). Vi khuẩn C. Botulinum có dạng hình que, sinh nha bào có sức
đề kháng cao (đun sôi ở độ cao bằng mặt nước biển cũng không giết chết được vi
khuẩn). Để tồn tại, clostridium botulinum cần rất ít oxy. Độc lực của botulin rất cao
(chỉ cần 1 microgam hay 1 phần triệu gam đã có thể làm chết một người, một giọt
chât độc này có thể làm chết cả trăm ngàn người). Nếu quy trình chế biến bảo quản
không tốt trong chế biến thực phẩm (nhất là đồ hộp), thực phẩm có thể bị nhiễm vi
khuẩn này. Phương pháp làm sôi kết hợp với điều áp có thể diệt được vi khuẩn. Nha
bào của vi khuẩn không phát triển trong những đồ hộp có hàm lượng đường cao như
mật ong, sirô nhưng có khả năng phát triển khi vào đường tiêu hóa của trẻ sơ sinh.

-Ngộ độc Botulism là một loại ngộ độc thực phẩm nặng do ăn các loại thực
phẩm có chứa chất độc thần kinh mạnh được hình thành trong sự phát triển của cơ
thể. Độc tố không bền nhiệt và có thể bị phá hủy nếu đun nóng ở 800C trong 10
phút hoặc lâu hơn. Các tỷ lệ mắc bệnh thấp, nhưng bệnh được quan tâm đáng kể vì
tỷ lệ tử vong cao nếu không được điều trị ngay lập tức và đúng cách. Xúc xích, sản
phẩm thịt, rau quả đóng hộp và sản phẩm thủy sản là nơi thường xuyên nhất cho
botulism con người.

Có ba loại chính của botulism:

 Botulism thực phẩm là là kết quả từ thực phẩm bị ô nhiễm, trong đó bào tử
C.Botulinum được sinh ra trong điều kiện yếm khí, điều này thường xảy ra
trong thực phẩm đóng hộp.
 Vết thương botulism là do độc tố sản xuất từ một vết thương bị nhiễm
Clostridium botulinum, điều này trở nên phổ biến hơn ở người dùng thuốc
tiêm tĩnh mạch kể từ năm 1990, đặc biệt là những người sử dụng ma túy đen
(black tar heroin) và những người tiêm ma túy vào da hơn là tiêm vào các
tĩnh mạch.

- 12 -


 Botulism trẻ sơ sinh là do tiêu thụ các bào tử của vi khuẩn botulinum, mà sau
đó phát triển trong ruột và được hấp thu vào máu, việc tiêu thụ mật ong trong
những năm đầu tiên của cuộc sống được xác định là yếu tố nguy cơ Botulism
trẻ sơ sinh .

Tất cả các hình thức botulism có thể gây tử vong và được xem là trường hợp
khẩn cấp y tế. Botulism thực phẩm có thể được đặc biệt nguy hiểm vì nhiều người
có thể bị ngộ độc do ăn thực phẩm bị ô nhiễm.

1.5 Cơ chế gây độc của độc tố Botulin

Khi phát triển trên thực phẩm, C.botulinum tiết độc tố Acethylcholine là một chất
dẫn truyền thần kinh gây đáp ứng bằng tình trạng co thắt cơ. Botulin tác động như
một độc tố thần kinh mạnh làm ức chế phóng thích acetylcholine, do đó gây kết
quả như cắt dây thần kinh bằng chất hóa học, gây liệt phản hồi. Mặc dù có đến 07
loại BTX ( A,B,C1,D,E,F,G) gây liệt phản hồi do ức chế phóng thích acetylcholine
tại đường nối thần kinh-cơ của các sợi cơ vân , chúng lại không giống nhau tại vị trí
gắn kết trên tế bào niêm mạc và vị trí tác động. Có 7 loại nhưng 3 loại A, B và E
thuộc loại hay gây ngộ độc và nguy hiểm, gây chết người do tác động lên hệ thống
thần kinh.Thời kỳ ủ bệnh thường là 12-36 giờ nhưng cũng có thể từ 2 giờ đến 8
ngày với các triệu chứng lâm sang như đau bụng, buồn nôn, đau đầu, chóng mặt,

- 13 -


hoa mắt có khi nhìn đôi, khó nuốt, khó thở... Ngộ độc C. botulinum còn phụ thuộc
vào rất nhiều điều kiện như yếu tố môi trường, đặc tính thực phẩm, biện pháp bảo
quản, tập quán sinh hoạt và ăn uống của nhân dân mà nguồn thực phẩm gây ngộ độc
cũng khác nhau

1.6 Những ứng dụng tuyệt vời của C.Botulinum :

1.6.1 Trong y học :

-Chữa chứng giật mi mắt: Vài chục năm trước, các thầy thuốc đã có suy
nghĩ độc đáo: tiêm botulotoxin (BoNT-A) vào cơ mắt, làm liệt có mức độ các cơ
này sẽ chữa được bệnh mắt hay giật. Thử nghiệm này thành công, trở thành liệu
pháp chữa giật mi mắt hiệu quả.

-Chữa chứng co cứng cơ, tắc nghẽn niệu: Tiêm vào cơ ở chỗ tận cùng thần
kinh BoTX-A ức chế sự phóng thích chất dẫn truyền acetylcholin, làm giảm sự co
cứng cơ. Sau tai biến mạch máu não có 60% người bị co cứng cơ chi trên và chỉ
5% trong số này có thể hồi phục. Co cứng chi trên cùng với việc mất đi các phản
ứng kết hợp khéo léo làm cho người bệnh khó khăn trong vận động, không thể chủ
động trong cuộc sống (khó mặc quần áo, cầm thìa nĩa, khó rửa lòng bàn tay).

Tiêm tại chỗ, BoTX-A chỉ cho tác dụng khu trú, không tác động trên các cơ lành,
cũng không gây ra các tác dụng độc chung. Tương tự như cơ chế trên, tiêm BoTX-
A vào ở chỗ nối thần kinh - cơ sẽ gây liệt cơ vân nên chống được tắc nghẽn niệu
do phì đại tiền liệt tuyến.

-Chữa chứng tiết nhiều nước bọt: Trong các bệnh thần kinh như Parkinson,
bại não, thoái hoá thần kinh, đột quỵ, xơ cứng bên (amyotrophic lateral sclerosis)
thường có chứng tiết nhiều nước bọt, ảnh hưởng không tốt đến hình ảnh, hoạt động
giao tiếp của người bệnh. Lần lượt có nhiều tác giả Friedman, Potuska, Jongerius
(2001); Suskin, Tuilon, Bothwell (2002), Ellies (2002-2003); Cheng, Mancini
(2003) đã nghiên cứu dùng BoTX-A và BoTX-B chữa chứng này. Các nghiên cứu

- 14 -


này tuy chưa lớn, nhưng đều nhận thấy có hiệu quả, chưa ghi nhận tai biến, trừ
trường hợp trong bệnh xơ cứng bên. Tuy nhiên, trong bệnh xơ cứng bên, nếu tiêm
vào tuyến mang tai hay các tuyến dưới hàm cũng giảm thiểu được tai biến này.

-Chữa chứng tiết mồ hôi khu trú nguyên phát: Nghiên cứu của Naumann
(2001 và 2002) cho biết: trong trường hợp đổ mồ hôi vừa và nặng, dùng BoTX-A
tiêm dưới da cho hiệu quả tới 94% trong khi ở nhóm chứng chỉ đạt 36%. Trong thử
nghiệm này, nhóm chứng cho tác dụng phụ nhiễm khuẩn cao hơn nhóm tiêm
BoTX-A. Các tác giả sau đó Dressler, Benecke, Baumann, Halem (2003) cũng lặp
lại thử nghiệm này với BoTX-B cho kết quả tương đương, tuy nhiên có gặp tác
dụng phụ là làm khô miệng, gây khó khăn trong điều tiết mắt. Hiện BoTX-A được
chỉ định chính thức dùng cho chứng tiết mồ hôi khu trú vừa và nặng tại nhiều nước
như Canada, Australia, Vương quốc Anh.

Hình: Botox giúp ngăn đổ mồ hôi và chửa chứng đau cơ xương

-Chữa chứng đau cơ xương : Foster (2001) đã thử nghiệm dùng BoTX-A
điều trị đau cơ xương thắt lưng mạn tính. Các kết quả cho thấy: trên nhóm dùng
BoTX-A có 73% người dùng giảm được 50% các triệu chứng (tính theo thang điểm
nhìn) và có 67% giảm được sự tàn tật (đánh giá bằng bộ thang điểm câu hỏi đau
thắt lưng OLBPD), trong khi trên nhóm chứng các tỷ lệ tương ứng này chỉ là 25-
19%. Lang (2003) cũng đề nghị dùng BoTX-A để cải thiện đau do làm giảm trương

- 15 -


lực, giảm hoạt động quá mức của cơ, coi như một liệu pháp giảm đau đa phương
thức, có lợi hơn cách trước đó là làm hồi phục chiều dài bình thường và sự cân bằng
sinh học của cơ.

-Chữa các chứng đau nhức đầu: Có thể tiêm BoTX-A vào các cơ vùng mặt
hay vào các điểm đau cho các trường hợp nhức đầu mà nguyên nhân chưa xác định
rõ. Nghiên cứu hồi cứu (Blumenfeld-2003): trong 271 người (bao gồm 29 nhức
đầu Migraine, 19 nhức đầu do căng thẳng, 74 bị nhức đầu hỗn hợp, 154 nhức đầu
mạn tính xảy ra hàng ngày) dùng BoTX-A thấy làm giảm được số ngày nhức đầu
tính theo tháng từ 19 xuống 8 ngày, giảm được cường độ đau từ 2,4 điểm xuống
1,8 điểm. Cũng như thế với 263 người khác cũng thấy có 85% số người dùng
BoTX-A giảm được về số ngày nhức đầu trong tháng, giảm được cường độ đau.
Trước đó Silberstein (2000) và Foster (2001) thực hiện các thử nghiệm có đối
chứng với giả dược cho biết BoTX-A thực sự có lợi ích trên chứng nhức đầu. Tsui
(1986) và Brashear (1999) cũng thấy BoTX-A, BoTX-B có làm giảm đau trên các
rối loạn trương lực cổ.

1.6.2 Trong thẩm mỹ :

Sự co các cơ đã gây nên các vết nhăn gợn sóng ở trán, vết nhăn chân chim ở
khoé mắt. Trước cả khi ứng dụng vào y học, các thầy thuốc thẩm mỹ đã táo bạo
tiêm vào cơ bắp trên mặt, làm liệt có mức độ các cơ này, xoá vết nhăn. Mãi đến
tháng 4/2002, FDA (Mỹ) mới chính thức cho lưu hành, nhưng ngay từ năm 2001 đã
có 1,6 triệu người Mỹ tự nguyện dùng thử, doanh số bán ra hàng năm lúc ấy 301
triệu USD và đến năm 2006 thì vượt qua ngưỡng 1 tỷ USD. Đối với việc dùng
BoTX-A, nếu trong y học đi từng bước thăm dò, dè dặt thì trong thẩm mỹ lại sớm
được ưa chuộng và dùng phổ biến.

- 16 -


Hình: Tiêm BoTX-A điều trị vết nhăn

1.7.2 Hạn chế

BoTX-A chỉ xoá được các nếp nhăn do co cơ (ví dụ co cơ khi vui, khi buồn)
nhưng không thể xoá vết nhăn do lão hoá (do giãn và trùng cơ). Vì thế không thể
làm cho người già tươi tắn lại như nhiều người vẫn nhầm tưởng. Khi vui, khi buồn
thì có sự co cơ tương thích tạo nên nét rạng rỡ hay ủ dột. Làm liệt các cơ này thì
xoá được nếp nhăn, song cũng lại mất đi sự co cơ để biểu lộ tình cảm. Nói một cách
khác, xoá vết nhăn sẽ tạo nên người đẹp nhưng nhìn bên ngoài dường như là "người
đẹp vô hồn". Mỗi lần xoá nếp nhăn chỉ kéo dài được 5-6 tháng, sau đó sẽ nhăn trở
lại, và nếu muốn tiếp tục thì lại phải đến điều trị trở lại nhưng dường như sự vô
cảm bên ngoài càng rõ hơn.
Dùng BoTX-A cần có hai thủ thuật cực kỳ quan trọng là phải tiêm đúng cơ bị
bệnh, tiêm đúng vào đầu thần kinh cơ. Trong thẩm mĩ, nếu tiêm không đúng sẽ làm
liệt cơ chỗ khác, sinh ra nếp nhăn khác, kéo lệch hay biến dạng mặt. Trong y khoa,
nếu tiêm không đúng sẽ không chữa được bệnh tại nơi cần trong khi đó lại gây
giảm trương lực cơ tại nơi khác. Dùng BoTX-A còn có một điều quan trọng thứ hai
là phải thăm dò, chọn được liều thích hợp. Cả trong thẩm mỹ cũng như trong y học,
việc dùng quá liều sẽ gây phản tác dụng, tức là gây ra tác dụng ngoài ý muốn, làm

- 17 -


liệt hay ức chế đau quá mức. Kể từ khi BoTX-A được dùng tới nay cũng đã có
nhiều vụ kiện do các tai biến này gây ra.
Hiện nay hầu hết các nghiên cứu phần lớn là trên BoTX-A, thấy có hiệu quả, ít
độc, nhưng chưa nhiều trên BoTX-B, thấy có hiệu quả tương đương nhưng có độc
hơn.

1.8 Các loại thực phẩm nhiễm C.Botulinum

Botulin là độc tố đã được chứng minh có nhiều trong các loại thực phẩm đồ
hộp như ngô đóng hộp, ớt, đậu xanh, súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau
bina, cá ngừ, thịt gà và gan gà và pate gan, và các loại thịt , xúc xích, tôm hùm , thịt
hun khói và cá muối...

Hình: Đồ hôp nhiễm C.Botulinum

1.9 Tình hình nhiễm C.Botulinum trên thế giới và tại Việt Nam

- Ở Hoa Kỳ nhiễm C.Botulinum chủ yếu trong đồ hộp rau quả. như ớt, đậu xanh,
súp, củ cải, măng tây, nấm, chín ô liu, rau bina, cá ngừ, thịt gà

Gần đây tại Hoa Kỳ sản phẩm tương ớt đóng hộp thuộc nhiều nhãn hiệu đang được
thu hồi sau khi có 4 người nhập viện vì bệnh botulism phát sinh từ độc tố có trong
sản phẩm của công ty Castleberry"s.

-Ở Nga, ngộ độc chủ yếu do cá

- 18 -


-Ở Đức do ăn các thức ăn làm bằng thịt chế biến sẵn, ăn nguội, dăm bông, xúc
xích...

- Nhật Bản - 36 người bị bệnh và 11 người đã thiệt mạng sau khi ăn chiên nhồi rễ
sen. Rễ sen được chân không đóng gói và bán unrefrigerated. Các điều kiện này
được cho phép cho sự phát triển và sản xuất độc tố của C. botulinum .

- Canada - Ít nhất 37 người đã bị ảnh hưởng sau khi ăn tại một nhà hàng mà được sử
dụng một nhiệt độ lạm dụng unacidified tỏi trong dầu vốn đã được bảo quản ở nhiệt
độ phòng.

- USA - Các trường hợp ngộ độc đã xảy ra do việc tiêu thụ khoai tây salad. Ba ổ
dịch đã xảy ra, kết quả là 50 người bị bệnh và tử vong một. Người ta cho rằng các
botulinum được hiện diện trong khoai tây nướng được sử dụng cho salad này.
Những đã được lưu trữ ở nhiệt độ môi trường xung quanh trong nhiều ngày trước
khi sử dụng.

- Mỹ - xào hành tây đã được liên quan đến một ổ dịch tại một nhà hàng ở Mỹ. 28
người đã bị ảnh hưởng, với một tử vong.

- Anh - bị ô nhiễm sữa chua hazelnut chịu trách nhiệm về một ổ dịch dẫn đến 27
người bệnh và tử vong một. botulinum là nghiền hazelnut được sử dụng trong da ua.

-Vào ngày 23/3, 17 bệnh nhân nặng nhất trong vụ ngộ độc do ăn măng tre ở tỉnh
Nan (Thái Lan) đã được đưa lên Bangkok điều trị.

-Năm 1991, 90 người ở Ai Cập đã phát bệnh sau khi ăn thức ăn chứa vi khuẩn
Clostridium botulinum.Theo Christopher Braden, chuyên gia Trung tâm Atlanta của
Trung tâm Kiểm soát và Phòng bệnh của Mỹ (CDC).

- 19 -


Chương II :Các phương pháp xác định
Clostridium Botulinum
2.1 Phương pháp truyền thống để xác định Clostridium Botulinum:

2.1.1 Môi trường và hóa chất
Pepton đệm bufer pepton water (BPW)
Iron suphide Agar (ISA)
Perfringns selective Agar ( shahidi ferguson ferfringens, SFP)

2.1.2 Quy trình phân tích
Cân 10g (hoặc 25g) mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml (hoặc 225ml)
nước pepton đệm và đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. mẫu được tiếp tục pha
loãng thập phân tùy mật độ hiện diện của C.botulinum trong máu. Trước khi
cấy,mẫu được xữ lý nhiệt ở 70 – 800C trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng
của các vi sinh vật khác.
Cấy vào đĩa 1ml dịch mẫu đã dược pha loãng thích hợp vào một đĩa petri vô
trùng. Đỗ 15ml môi trường ISA hoặc SFP Agar đã được ủ ấm ở 45 0C vào đĩa, lắc
đều. sau khi môi trường đã đông, đỗ lên trên thêm bề mặt khoảng 10ml ISA hoặc
SFP Agar. Một phương pháp khác là cho thêm một ống nghiệm vô trùng 1ml dịch
mẫu ở nồng độ thích hợp, thêm 12ml ISA hoặc SFP Agar đã ủ ấm ở 45 0C vào ống
trộn đều mẫu. sau khi môi trường đã đông, đỗ thêm lên thêm bề mặt 2-3 ISA hoặc
SFP Agar. Đĩa hoăc ống nghiệm đã được cấy mẫu ủ ở 37 0C trong 24 – 48h trong
các bình kỵ khí. Nếu nghi ngờ Clostridium chịu nhiệt thực hiện ủ song song ở 37 0C
và 500C thông thường đọc kết quả trên đĩa là dễ hơn trong ống nghiệm. ISA môi
trường không chọn lọc nên các loài sinh H2S khác không phải Clostridium
botulinum cũng tăng trưởng được và tạo khuẩn lạc màu đen trên môi trường này. Để
khẳng định khuẩn lạc là Clostridium botulinum cần thực hiện những quy trình tiêu

- 20 -


chuẩn để giúp khẳng định kết quả. Phương pháp này chỉ phân lập Clostridium với
các vi sinh vật khác, không phân biệt được các loài Clostridium với nhau như:
C. acetobutylicum,C. aerotolerans,C. beijerinckii,C, bifermentans, C. butyricum,
C. cadaveris, C. chauvoei, C. clostridioforme, C. colicanis, C. difficile, C. fallax
C. formicaceticum, C. histolyticum, C. innocuum, C. ljungdahlii,C. laramie
C. lavalense, C. novyi, C. oedematiens, C. paraputrificum, C. perfringens,
C. phytofermentans, C. piliforme, C. ramosum, C. scatologenes, C. septicum,
C. sordellii, C. sporogenes, C. tertium, C. tetani, C. tyrobutyricum

- 21 -


Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy phân
xử lý mẫu ở 800C trong 15-20 phút

Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa Cấy 1ml dung dịch mẫu vào ống
petri, đổ 10-15ml môi trường ISA ở nghiệm, đổ 10-15ml môi trường
450C lắc đều ISA ở 450C lắc đều

Đổ lớp ISA thứ hai khi lớp thứ Đổ lớp ISA thứ hai cao 1-2cm
nhất đã đông đặc khi lớp thứ nhất đã đông đặc

ủ trong bình kín, ở
370C 24-48 giờ ủ ở 370C, 24-48 giờ

Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen Đếm tất cả các khuẩn lạc màu
đường kính ≥0,5mm đen xuất hiện trong ống

Tính kết quả Tính kết quả

Công thúc tính:
A(CFU/ml)=( NxR)/(n1vf1+…..+nivfi)
 N tổng số khuẩn lạc đếm được
 R tỷ lệ xác xuất
 v thể tích cấy vào mỗi đĩa/ống
nghiệm
 ni số đĩa/ống nghiệm có số khuẩn
lạc được chọn
 fi độ pha loãng tương ứng

- 22 -


Cần phải thực hiên các kiểm tra hóa sinh khác mới khẳng định được.
Tính chất của các chủng:
Nhóm I II II IV
Dạng độc tố A,B,F B,E,F C,D G

Làm tan Gelatin + + + +

Lên men Glucose + + + -

Lên men Fructose ± + ± -

Lên men Mannose - + + _
Lên men Maltose ± + ± -

Lên men Sucroe - + - -
Lên men Trehalose - + - -

Lên men Lactose - - - -

Lipase + + + -

Lecithinase - - - -

Sinh H2S + + + +

Dựa vào đặc sinh hoá của Clostridium botulinum mà ta kiểm tra các phản ứng
sinh hoá nhằm khẳng định Clostridium botulinum.

2.2 Phương pháp hiện đại xác định C.Botulinum :

1.2.1 Phương pháp ELISA:

Mẫu thu thập từ môi trường nuôi cấy của C. botulinum trong canh trường TPY-C
đã được sử dụng để định lượng sản xuất hoạt tính sinh học BoNT-B bởi phương
pháp ELISA với kháng thể đa dòng, cụ thể cho các loại BoNT-B từ thỏ. Lấy một
ml của môi trường nuôi cấy tế bào C. botulinum, được ly tâm ở 4°C và 14.000 vòng

- 23 -


/ phút trong 10 phút để tách C. botulinum từ các dịch nổi. Dịch nổi được pha loãng
trong dung dịch đệm casein. Thêm 100 µL của kháng thể được phát hiện pha loãng
với từng ống. Sự thay đổi màu sắc được đo bằng một multiscanner ELISA tại 492
nm , các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng các kháng thể thứ
cấp có gắn với ezyme alkaline Phosphatase. Đo BoNT-B trong mỗi ống ở nồng độ
sau đây: 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, và 0,4 ng / ml. Bằng cách theo dõi sự đổi màu, có
thể phát hiện và định lượng kháng nguyên

- 24 -


1.2.2 Phương pháp PCR:

Tất cả các chủng clostridium được nuôi cấy trong 10 ml tryptose-peptone-
glucose- yeast extract (TPGY) và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37°C trong 24-48 h,
tiếp theo nuôi qua đêm(20 giờ ở nhiệt độ tương ứng).

B1. Chuẩn bị khuôn mẫu:

Lấy 1 ml dung dịch chứa tế bào từ môi trường , rửa sạch với 1 ml đệm TE
(0,01 M Tris-HCl, EDTA 0,001 M ,PH 8.0) trong 1 giờ ở 37°C và ngâm trong 1 ml
nước cất. Ngoài các tế bào riêng rẻ được phân lập của từng chủng vi khuẩn, ba hỗn
hợp được phân lập chứa các C.botulinum thủy phân protein loại A, B và F, các
C.botulinum không thủy phân protein loại B, E , và F hoặc tất cả bốn huyết thanh
đã được chuẩn bị bằng cách trộn riêng rẻ các tế bào được phân lập. Mọi các tế bào
phân lập được đun nóng ở 99 o C trong 10 phút để chia tế bào và phát hành các
DNA của vi khuẩn và đã ly tâm trong 5 phút ở 10.000 × g. Một khối lượng của 1 μL
của nổ i trên mă ̣t từng được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR . Tất cả được
đun nóng ở 990C trong 10 phút nhằm phá vỡ tế bào và tách chiết DNA của
C.botulinum. Ly tâm trong 5 phút ở 10.000 vòng/phút. Khoảng 1 μL dịch nổ i trên
mă ̣t được sử dụng như bản mẫu trong hỗn hợp PCR.

B2 .Mồi:

Dựa trên công bố trình tự DNA của gen BoNT , bốn cặp mồi mới với nhau
được cụ thể cho cả hai loại C. botulinum A, B, E, hoặc F được thiết kế ( Bảng 2)

- 25 -


TABLE 2. Mồi cho multiplex PCR của C. botulinum loại A, B, E và F

Product
Vị trí trên gen Nhiệt độ GC content
Loại Mồi Chuỗi (5'-3') size
(mã vùng) (°C) (%)
(bp)

Af CBMLA1 AGC TAC GGA GGC 782 1788-1808 63.9 52
AGC TAT GTT
Ar BMLA2 CGT ATT TGG AAA 2569-2548 63.4 41
GCT GAA AAG G
Bf CBMLB1 CAG GAG AAG TGG 205 434-453 64.3 50
AGC GAA AA
Br CBMLB2 CTT GCG CCT TTG 638-619 64.5 45
TTT TCT TG
Ef CBMLE1 CCA AGA TTT TCA 389 156-175 63.7 45
TCC GCC TA
Er CBMLE2 GCT ATT GAT CCA 544-525 63.6 43
AAA CGG TGA
Ff CBMLF1 CGG CTT CAT TAG 543 185-194 64.1 50
AGA ACG GA
Fr CBMLF2 TAA CTC CCC TAG 727-708 63.3 55
CCC CGT AT

- 26 -


B3.PCR:

PCR được thực hiện với 50 μL của hỗn hợp phản ứng có chứa 1 μL của mẫu,
0,3 μM của mỗi mồi, 220 nM của mỗi triphosphate deoxynucleotide (dATP, dCTP,
dGTP, và dTTP), 32 mM Tris-HCl (pH 8,4), 80 mM KCl, 4,8 mM MgCl, và DNA
polymerase. Các sản phẩm PCR khuyếch đại được xác định ở agarose gel 2%
nhuộm màu với ethydium bromide.

B4 .Đọc kết quả:

Multiplex PCR của tế bào C. botulinum loại A, B, E, và F mang lại những
sản phẩm khuếch đại dự kiến (Bảng 1): loại A: 782 bp; loại B: 205 bp; loại E: 389
bp; và loại F 543 bp (hình). Hỗn hợp bị đìnhcác tế bào mang các đoạn ADN tương
ứng (hình 1). Các sản phẩm PCR được hình dung rõ ràng trong gel agarose; từ
150bp đến 200bp khác biệt trong kích thước của mỗi sản phẩm khuếch đại kích hoạt
một sự phân biệt giữa các mảnh vỡ dễ dàng mà không cần sử dụng độ phân giải cao
agarose (hình).

- 27 -


Multiplex PCR phát hiện của C. botulinum. Đường 1: trọng lượng phân tử
đánh dấu; 2: C. botulinum loại A; 3: C. botulinum loại B; 4: C. botulinum loại E; 5:
C. botulinum loại F; 6: C. botulinum thủy phân protein loại A, B và F; 7: C.
botulinum không thủy phân protein loại B, E và F; 8: C. botulinum loại A, B, E, và
F; và 9: tiêu cực kiểm soát.

- 28 -


Chương III :Kết luận và đề nghị

Botulism là một bệnh rất nguy hiểm nhưng hiếm xảy ra. Mấy năm gần đây,
cơ quan FDA Hoa Kỳ và CFIA Canada cũng thỉnh thoảng ra cảnh báo về bệnh
botulism và cho lệnh thu hồi một vài loại sản phẩm nhiễm khuẩn bày bán trên thị
trường chẳng hạn như Hot Dog Chili Sauce Castleberry’s Ford Cpy USA, Austex
Hot Dog Chili Sauce, Kroger Hot Dog Chili Sauce, Chili French Style Green Beans
Lakeside Foods, Bolthouse Farm 100% Carrot Juice (Canada), Hot Great Value
Original Chili with Beans.
Tuy nhiên độc tố botulism cũng có được vài ứng dụng ích lợi trong y khoa trị
liệu. Độc tố A (BTXA) được sử dụng để trị những xáo trộn thần kinh gây sự co thắt
cơ, bệnh chứng gây ngứa ngoài da (prurit cutané), đau cơ vùng mặt (douleur
myofaciale), tiết quá nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine)...
Gần đây, do một sự tình cờ lý thú trong lúc dùng toxine để trị chứng mí mắt
co thắt bất thường (blépharospasme) ở một bệnh nhân, các bác sĩ đã khám phá thêm
một tác dụng khác của độc tố là nó có thể làm tan biến và xóa bớt nếp nhăn trên mặt
một cách tạm thời.
Thế là độc tố botulism nhảy vào lĩnh vực thẩm mỹ với sự xuất hiện của thuốc
Botox® Cosmetic (toxinA), Myobloc (toxinB), Dysport và Vistabel. Tất cả đều
được bào chế từ độc tố botulism. Botox có thể giúp xoá bỏ đi các nếp nhăn trên
trán, hai bên khóe mắt còn gọi là vết chân chim (patte d’oie, crows feet), khóe
miệng, giữa hai chân mày…

- 29 -


Tài liệu tham khảo:

Clostridium botulinum: ecology and control in foods by Andreas H. W.
Hauschild,Karen L. Dodds.

http://www.cdc.gov/

http://www.cfsan.fda.gov/mow/chap2.html

www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1489423/

http://www.ebook.edu.vn/?page=1.15&view=5339

http://d.violet.vn/uploads/resources/49/78892/preview.swf

http://elearning.hueuni.edu.vn/

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/Bacteriologic
alAnalyticalManualBAM/UCM070879.

http://en.wikipedia.org/wiki/Botulism

- 30 -

Clostridum botulinum

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (20)

Similar to Clostridum botulinum

Similar to Clostridum botulinum (20)

Clostridum botulinum