研究内容：超音波の破骨細胞への作用

1. 酵素
低出力超音波パルスの破骨細胞に対する作用
○半本泰三1・古澤之裕2・矢野幸子3・田渕圭章2・近藤 隆2・池亀美華4・北村敬一郎1・関口俊男1・和田重人2・高垣裕子4・服部淳彦5・鈴木信雄1
1金沢大学、2富山大学、3JAXA、4岡山大学、5東京医科歯科大学
超音波照射によってウロコの破骨細胞がどのように応答するか形態学的・遺伝学的解析より明らかにする
目的
背景 実験２. 破骨細胞 分化シグナルの変化
実験３. 破骨細胞 遺伝子発現の変化
結論
１．臨床で超音波が骨の再生を早めるとの報告
２．経験的に 1回(20min)/24時間 照射が良い
３．詳しいメカニズムは不明
３．特に破骨細胞に関する知見が骨芽細胞
に比べ少ない
● “ウロコ”を骨のモデルとして用い
超音波の破骨細胞への作用を調べた
・魚のウロコは骨基質、骨芽細胞と
破骨細胞があり、哺乳類の骨に酷似。
・哺乳類の骨に比べ培養などの扱いが容易。
● 骨のモデルとしてキンギョのウロコ
● 超音波は低出力超音波パルス（LIPUS）
材料と方法
・骨折に効く超音波は経験的に決まっている。
→低出力超音波パルス（LIPUS）
・セーフス（帝人）を使用。プローブを
ウロコの入ったプレートに照射。
● 解析はTunel染色とReal Time PCR
・本研究ではアポトーシスの局在と、遺伝子発現量の変化を解析。
・アポトーシスの局在はウロコをホールマウントでTunel染色、
遺伝子発現量の解析はウロコライセートからmRNA抽出、
cDNA合成の後、Real Time PCRを用いた。
ウロコの採取 超音波照射
Tunel染色
Real Time PCR
・ゼブラフィッシュのウロコを用いたGenechip解析により、
超音波照射によってアポトーシス関連遺伝子の発現増加が確認
された。
実験１. Tunel 染色による細胞死の確認
…破骨細胞とアポトーシスの局在が一致
図１．Tunel染色. 左はTRAP染色で、黒い矢印は破骨細胞の局在を示す。右はTunel染色で、黄
色の矢印で示した赤い部分でアポトーシスが起こっている。
RANKL：破骨細胞分化促進 RANK：RANKL受容体 OPG：RANKL阻害タンパク
0
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0 5 10 15 20 25
ExpressionLevel(ratio)
hour
RANKL（分化促進）
*
**
図２．RANKL,RANK, OPGの遺伝子発現量.
RANKLは6時間と12時間、RANKは3時間で、
OPGは6時間で有意差が見られた。また超音波
を照射した群は、遺伝子発現量が12時間から
24時間にかけて減少傾向が見られた。
●RANKL, RANK, OPG
の発現量を解析
0
0.3
0.6
0.9
1.2
0 5 10 15 20 25
ExpressionLevel(ratio)
hour
OPG（分化抑制）
*
実験の流れ
OPG
RANKL
RANK
破骨細胞分化の
促進とブレーキ
破骨細胞でアポトーシスを確認！
分化促進 細胞融合
成熟破骨細胞(多核)
破骨細胞の分化
RANK
RANKL
MAPK
NFATc1
NF-kβ
AP-1
cFos(Figf)
NFATc1
TARF
NFATc1は核内へ
細胞膜
図３．破骨細胞細胞内シグナル、破骨プロテアーゼ遺伝子発現
量。
細胞内シグナルは超音波照射後6時間で、照射群の活性が有意に
上昇した(p＜0.05)。破骨細胞プロテアーゼは超音波照射後12時間
で、照射群の活性が有意に上昇した(p＜0.001, p＜0.05)。
破骨細胞内シグナル
核膜
カテプシン,
MMP9など
●破骨細胞細胞内シグナル、
破骨プロテアーゼ遺伝子の
発現量を解析
破骨細胞機能遺伝子
の活性増加
単核破骨細胞が集まる
●超音波照射後３時間のキンギョのウロコを
アポトーシスの局在を示すTunel染色を用いて染色。
LIPUS照射後 結果
3時間 RANKの低下
6時間
RANKLの増加、OPGの増加
破骨細胞内シグナルの増加
12時間
RANKLの増加
破骨細胞プロテアーゼ発現増加
24時間
各遺伝子の発現量が
12時間から低下
これまで経験的に知られている超音波
照射条件1回 (20min ) /DAYは、骨の
形成に効率的な使用方法であること
がウロコのモデルを用いて初めて明
らかになった。
破骨細胞
骨芽細胞
0
8
16
ExpressionLevel(ratio)
TRAF6 Figf NFATc1
破骨細胞 細胞内シグナル
(6hour)
*
*
*
0
1.25
2.5
1
ExpressionLevel(ratio)
CathepsinK MMP9
破骨細胞プロテアーゼ
(12hour)
Control
LIPUS
*
***
0 3 6 12 24 0 3 6 12 24
0 3 6 12 24
骨芽細胞
破骨細胞前駆細胞(単核)
結果まとめ
結論
酸
酸
0
0.4
0.8
1.2
1.6
0 5 10 15 20 25
ExpressionLevel(ratio)
hour
RANK
control
LIPUS
*
0 3 6 12 24
“波状縁”から酸や酵素
骨を溶かす！
0hour 3hour 6hour 12hour
超音波照射
RANKL増加
破骨細胞前駆細胞(単核)
成熟破骨細胞(単核)
RANKの減少
破骨細胞
アポトーシス
…などの原因
RANK戻る
破骨シグナル増加
骨芽細胞
RANKL RANK
骨芽細胞 破骨細胞
プロテアーゼ分泌！
RANKL増加
骨芽細胞
プロテアーゼ増加
破骨細胞破骨細胞
破骨細胞分化
24hourにかけて破骨細胞の活性はControlのレベルに戻る
破骨細胞活性化！