1. Маркеры аномального метилирования ДНК при
остром миелоидном лейкозе у детей
Федеральное государственное бюджетное научное
учреждение
"Медико-генетический научный центр"
Руденко Виктория Владимировна
Москва
2017 год
2. Цель - изучение универсальной системы маркеров метилирования
острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) у детей.
Задачи:
формирование системы маркеров метилирования при ОМЛ у детей;
изучение изменения профиля аберрантного метилирования в
динамике ОМЛ, а также при различных терапевтических схемах ОМЛ;
анализ выявленных маркеров метилирования на предмет наличия
клинико-генетических корреляций с целью изучения прогностического
потенциала аберрантного метилирования;
оценка перспективы определения минимальной остаточной болезни с
использованием системы выявленных маркеров.
Детекция метилирования методом МЧ-ПЦР
Определение частоты аномального метилирования маркеров,
соответствующих промоторным областям генов SOX8, CXCL14, GSG1L,
TMEM176A/TMEM176B, CLDN7, EGFLAM, проводили методом
мультиплексной МЧ-ПЦР с использованием внутренних контролей.
Для определения метилирования был использован фермент
BstHHI, имеющий многочисленные сайты рестрикции в пределах
изучаемых локусов, для определения гомогенности метилирования CpG-
пар региона.
3. Мультиплексная МЧ-ПЦР для детекции
аномального метилирования при ОМЛ у детей
Рис.1. Мультиплексная МЧ-ПЦР для праймеров
«ABCG4, DLK2, SOX8» с использованием внутренних
контролей. «pUC/MspI» – маркер молекулярного
веса, «k-» отрицательный контроль, «k+» -
контрольный образец, «CUX1» - внутренний
контроль на наличие амплификации, «SNRK» -
внутренний контроль на полноту рестрикции.
Рис.2. Мультиплексная МЧ-ПЦР для
праймеров «CXCL14, GSG1L,
TMEM176A/176B» с использованием
внутренних контролей. «pUC/MspI» –
маркер молекулярного веса, «k+» -
контрольный образец, «CUX1» - внутренний
контроль на наличие амплификации, «SNRK»
- внутренний контроль на полноту
рестрикции.
4. Выборка
В исследовании использованы 86 образцов биологического материала
костного мозга 39 детей с ОМЛ (НИИ ДОиГ им. Н.Н.Блохина) и 6
образцов донорского КМ (ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева)
Образцы биологического материала костного мозга 39 пациентов с
ОМЛ представлены до лечения, а также на различных его этапах
Пациенты после лечения представляют собой гетерогенную выборку:
дакоген до проведения химиотерапии (0-5 день) – 10 человек
(группа I)
дакоген после блока AIE (16-20 день) – 29 человек (группа II)
биологические образцы КМ взятые после блока AIE представляют собой
выборку пациентов с «чистой химиотерапией»
AIE:
Цитозинарабинозид
Идарубицин
Этопозид
5. Рисунок 1. Схема метаболизма децитабина (5-aza-dC).
В клетку он попадает с помощью переносчика
нуклеозидов hENT1. Далее с помощью
дезоксицитидинкиназы фосфорилируется до
монофосфата, а следующая киназа превращает его в
нуклеотиддифосфат. После трех фосфорилирований он
включается в ДНК.
Рисунок 2. Принцип работы азануклеозидов как лекарств.
В ходе репликации ДНК-метилаза копирует метильную группу (фиолетовый
кружок) на новосинтезированную цепь ДНК. Фермент садится на встроенный
в цепь ДНК вместо цитозина динуклеотид азацитидин-гуанин (Z) (так как не
чувствителен к замене основания) и ковалентно с ним сшивается. После чего
подвергается деградации. Таким образом, в ДНК будет метилированной только
одна из цепочек вместо двух, а значит, новая клетка будет метилирована только
наполовину. Дальнейшая репликация приведет к появлению клеток, полностью
лишенных метилирования.
http://biomolecula.ru/content/1355
Принцип действия Децитабина
7. Определение гомогенности выборки по частоте аномального метилирования
изучаемых локусов
Ген Общая группа, % (n=39) Группа I, % (n=10) Группа II, % (n=29) p
SOX8
51.3 (20/39) 50 (5/10) 51.7 (15/29) 0.9956
GSG1L 10 (4/39) 10 (1/10) 10.4 (3/29) 0.9995
EGFLAM 13 (5/39) 20 (2/10) 10.4 (3/29) 0.7334
CLDN7 23 (9/39) 30 (3/10) 20.7 (6/29) 0.834
THEM176A/176B
61.5 (24/39) 60 (6/10) 62 (18/29) 0.9933
CXCL14
94.9 (37/39) 90 (9/10) 96.6 (28/29) 0.7203
Определение различия частоты аномального метилирования изучаемых локусов в группах
до и после лечения
Ген Группа I
до лечения, %
(n=10)
Группа I
после
лечения, %
(n=10)
p Группа II до
лечения, % (n=29)
Группа II после
лечения, %
(n=25)
p FDR
CLDN7 30 (3/10) 30 (3/10) 1 20.7 (6/29) 80 (20/25) <0.0001 0.0083
SOX8 50 (5/10) 10 (1/10) 0.1409 51.7 (15/29) 0 (0/25) <0.0001 0.0166
EGFLAM 20 (2/10) 10 (1/10) 1 10.4 (3/29) 20 (5/25) 0.4487 0.0249
THEM176A/176B 60 (6/10) 30 (3/10) 0.3698 62 (18/29) 68 (17/25) 0.7772 0.0332
CXCL14 90 (9/10) 80 (8/10) 1 96.6 (28/29) 100 (25/25) 1 0.0415
GSG1L 10 (1/10) 0 (0/10) 1 10.4 (3/29) 8 (2/25) 1 0.0498
8. Ген Группа I, %
(n=10)
Группа II, %
(n=25)
p FDR
CLDN7 30 (3/10) 80 (20/25) 0.0146 0.0083
THEM176A/176B 30 (3/10) 68 (17/25) 0.0619 0.0166
CXCL14 80 (8/10) 100 (25/25) 0.0756 0.0249
SOX8 10 (1/10) 0 (0/25) 0.2857 0.0332
EGFLAM 10 (1/10) 20 (5/25) 0.6493 0.0415
GSG1L 0 (0/10) 8 (2/25) 1 0.0498
Определение различия частоты аномального
метилирования изучаемых локусов в группах
после лечения
9. Клинико-генетические корреляции для
статуса метилирования изучаемых генов
THEM176A/176B GSG1L CXCL14 CLDN7 EGFLAM
CNS+ 2/9 0/9 8/9 1/9 0/9
CNS- 22/30 4/30 29/30 8/30 5/30
p 0.0153 0.5558 0.413 0.6542 0.3178
высокая 19/28 3/28 26/28 8/28 4/28
невысокая 5/11 1/11 11/11 1/11 1/11
p 0.2773 1 1 0.3994 1
c ЦГА 22/31 4/31 29/31 9/31 4/31
без ЦГА 2/8 0/8 8/8 0/8 1/8
p 0.037 0.5628 1 0.1602 1
мол+ 8/10 2/10 9/10 3/10 1/10
мол- 16/29 2/29 26/29 6/29 4/29
p 0.2625 0.267 1 0.6686 1
10. Выводы
Предложенная система из 6 маркеров аномального метилирования является
универсальной системой маркеров ОМЛ у детей.
Показано, что использование деметилирующей терапии перед курсом химиотерапии
снижает уровень метилирования ДНК, однако это снижение статистически не значимо.
После блока AIE происходит увеличение частоты метилирования у 4х изучаемых генов
(статистически значимо для гена CLDN7), а снижение - у 2х (статистически значимо для гена
SOX8), что свидетельствует о клональной эволюции опухоли.
Была определены статистически значимые ассоциации между статусом метилирования
гена TMEM176A/176B и вовлеченностью центральной нервной системы в патологический
процесс у больных ОМЛ до лечения (р = 0,0153), а также наличием у пациента
цитогенетической аномалии (p=0,037).
C помощью разработанной системы возможна оценка злокачественной прогрессии
бластных клеток.
Благодарность:
Залетаев Дмитрий Владимирович 1,3
Казакова Светлана Александровна 3
Кузнецова Екатерина Борисовна 1,3
Немировченко Валентина Святославовна 2
Попа Александр Валентинович 2
Стрельников Владимир Викторович 1
Танас Александр Сергеевич 1
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико-Генетический Научный Центр»
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический центр им. Н.Н. Блохина»
3 ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
