Il documento analizza la mutazione c.-32-13t>g del gene gaa, comune nel 90% dei pazienti, e le strategie per ripristinare lo splicing normale degli mRNA colpiti. Vengono valutati approcci terapeutici mirati, come l'uso di piccole molecole e oligonucleotidi antisenso, attraverso esperimenti in vitro. I risultati suggeriscono un potenziale per correggere lo splicing anomalo, aprendo la strada a terapie specifiche per questa mutazione.

1. Functional characterization of the
common c.-32-13T>G mutation of
GAA gene: identification of
potential therapeutic agents.
Dardis et al., Nucleic Acid Research; 2013

2. La maggior parte dei pazienti LO presenta la mutazione di splicing c.-
32-13TG. (circa il 90 % dei pazienti presentano la mutazione in un
allele).
Recentemente, sono state utilizzate numerose strategie per valutare
approcci terapeutici in grado di correggere/aumentare lo splicing
normale di trascritti che presentano mutazioni che colpiscono lo
splicing dell’mRNA.
Esempi: AONs (clinical trials).
Piccole molecole che aumentano l’espressione o l’attività
dei fattori di splicing
Questi approcci sono mutazione specifici e dipendono del
meccanismo mediante il quale la mutazione altera lo splicing normale.

3. Obbiettivi
Caratterizzazione funzionale della mutazione c.-32-
13TG del gene GAA
Valutare in vitro strategie mirate a correggere/aumentare
lo splicing normale dei trascritti mutati.

4. exon 1
5’ss(c1) GAA 3’ss(c2)
-13TG Tcttccccaag/ga
exon 2 (578 bp)
exon 3
gcg/gtaaca
35 bp
cgggtgaga
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
g
Relative norrmal spliced
mRNA expression(% of C)
RT-qPCR
1 2 3
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
Control P1 P2
SV2
SV3
c2
SV1
SV3’
c2

5. mRNA splicing
YURAY AGGURAGU (Y)n NCAGG
Exon 1 Exon 2
U4 U6
U2
U1
U2AF
BBP 65
U1 U2
U5
U2A
F35
U2AF
65
U2A
F35
SPLICEOSOME
mRNA
Exon 1
Exon 2
Exon 1 Exon 2
ISE/ESE
ESS/ISS

6. A
-13u gccucccugcugagcccgcuuucuucucccgcagGCCUGUAugugugug
-13g gccucccugcugagcccgcuugcuucucccgcagGCCUGUAugugugug
BP ug-tail
-13 3‘ss
-13g -13u Beads
U2AF65
TDP-43
(yncuray)
B C MW -13g -13u Beads
kDa
83
58
47.5
32.5
P. red Western

7. Nde1
SV40 Exon 2
WT Mut
N
SV3
SV2
Nde1
SV40 Exon 2
120
GAA
100
80
60
40
20
0
Relative WT Mut norrmal spliced
mRNA expression(% of WT)
Nde1
GAA
50nt 50nt
pA
Nde1
50nt 50nt
pA
a2-3 Bra2
Minigene

8. Effetto della sovraespressione di proteine SR e hnRNP sullo
WT
Mut
N
SV3
SV2
N
SV3
SV2
-
splicing del esone 2 della GAA
N
SV3
SV2
SV3
SV2
-
N

9. 2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
B C SRSF4
Relative norrmal Tubulin
spliced mRNA
expression(% of scramble)
0
P1 P1+2ug SRSF4 P1+4ug SRSF4
A
Relative norrmal spliced mRNA
expression(% of mock transfecetd cells)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
scramble siRNA
*
*
*
Fibroblasti c.-32-13TG
Fibroblasti Normali

10. 6
5
4
3
2
1
Resv
Resv.
- +
SRSF4
SRSF6
SRSF1
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
*
*
Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv
Relative norrmal spliced
mRNA expression(% of C)
*
*
*
Relative norrmal spliced
mRNA expression(% of Mut)
Relative GAA activity (% of C)
*
*
120
100
80
60
40
20
0
Control P1 P1+Resv P2 P2+Resv
0
*
*
70kDa
GAA
Actin
C P1 P2
- - + - +
Screening

11. Relative norrmal spliced
mRNA expression(% of Mut)
*
* *
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Screening

12. exon 1
In sintesi
5’ss(c1) 3’ss(c2)
exon 2 (578 bp)
exon 3
gcg/gtaaca
35 bp
cgggtgaga
tcttctcccgcaggc….
60 bp
….acggtgggc catctcttctagat
-13TG
Tcttccccaag/ga
U2AF
65
SRSF4 Isoforma normale di splicing
Resv. SAHA Isoforma normale di splicing
Espressione della proteina GAA
Attività enzimatica GAA
“in vitro proof of principle” per l’utilizzo di piccole molecole al fine di
correggere lo splicing degli alleli che presentano la mutazione c.-32-
13TG

13. Ringraziamenti
ICGEB
Emanuele Buratti
Cristiana Stuani
Francisco Baralle
Regional Coordinator Centre
for Rare Diseases
Stefania Zampieri
Irene Zanin
Annalisa Pianta
Milena Romanello
Bruno Bembi