Dipartimento di Scienze Mediche di Base,Neuroscienze e Organi di SensoUniversità di Bari "A. Moro"Dipartimento interdiscip...
INDICE1. Analisi chimica dei costituenti minori degli oli extravergine di oliva pag.32. Valutazione chimica e biologico mo...
Analisi chimica dei costituenti minori degli oli extra-vergine di olivaL’olio extra-vergine di oliva, una delle principali...
4. Idrocarburi : Costituiscono oltre il 50% della frazione in saponificabile. Tra gli idrocarburisaturi il nonacosano è il...
Mediamente la quantità di sostanze fenoliche presenti nell’olio extra-vergine di oliva oscilla tra 60 e400 mg/Kg.I compost...
3. Secoiridoidi : Oleuropeina aglicone, Oleuropeina, Ligstroside aglicone, Ligstroside4. Lignani : Acetossipinoresinolo, P...
centrifugazione viene recuperata la fase idroalcolica nella quale sono presenti le sostanze fenoliche(l’estrazione viene r...
La concentrazione dell’estratto fenolico dell’olio extra-vergine di oliva viene calcolato medianteinterpolazione sulla ret...
fase mobile che fluisce attraverso di essa. Le sostanze più affini alla fase stazionaria impiegano untempo maggiore per pe...
due estremità delle colonne sono presenti dei setti perforati di acciaio inossidabile, o di teflon, cheservono a trattener...
Gli eluiti così ottenuti vengono sottoposti a valutazione qualitativa e quantitativa facendoli passareattraverso un rivela...
Un altro tipo di rivelatore utilizzato per l’identificazione delle sostanze fenoliche presenti nell’olioextra-vergine di o...
dell’elettrodo repulsore, al quale viene applicato un potenziale positivo, è quello di provocarel’espulsione degli ioni da...
L’analizzatore di massa separa gli ioni sulla base dei loro valori m/z. I più comuni analizzatori sonoil “filtro di massa ...
2. C. Cantarelli. Sui polifenoli presenti nella drupa e nell’olio di oliva. Riv. Ital. Sost. Grasse.1961, 38: 69-72.3. G.F...
La Dieta Mediterranea è associata ad una più bassa incidenza di tumori (prostata, polmone, laringe,ovaio, seno, colon), ma...
Le cellule rispondono allo stress ossidativo attivando la trascrizione di geni implicati nella rispostaantiossidante la cu...
Studi in vivo, in modelli animali di aterosclerosi indotta, hanno mostrato un miglioramento delprofilo lipidico ematico do...
È molto probabile, quindi, che l’effetto protettivo degli antiossidanti naturali, così come dell’HT edell’HVA, in sistemi ...
Hao et al. hanno dimostrato, in adipociti murini 3T3-L1, che il trattamento con HT porta ad unmiglioramento della funzione...
EA) (30). Il 3,4-DHPEA inibisce la proliferazione ed induce l’apoptosi in diverse linee cellularitumorali (29) (31-35).Tut...
Infine, è stato riportato che cellule di melanoma umano M14 rispondono al trattamento con 3,4-DHPEA solo a concentrazioni ...
E’ ampiamente descritto in letteratura, inoltre, che l’iperglicemia porta ad una over-produzione diradicali liberi e ad un...
BIBLIOGRAFIA1. Bosetti C et al. Food groups and laryngeal cancer risk: a case control study from Italy andSwitzerland. Int...
Bosetti C et al. Olive oil, seed oils and other added fats in relation to ovarian cancer (Italy).Cancer Causes Control, 20...
13. Dinkova-Kostova AT et al. Direct evidence that sulfhydryl groups of Keap1 are the sensorsregulating induction of phase...
23. Bendini A et al. Phenolic molecules in virgin olive oils: a survey of their sensory properties,health effects, antioxi...
34. Fabiani R. et al. Cancer chemoprevention by hydroxytyrosol isolated from virgin olive oilthrough G1 cell cycle arrest ...
45. Lapidot T et al. Can apple antioxidants inhibit tumor cell proliferation? Generation of H2O2during interaction of phen...
Valutazione clinica del potere salutistico dell’olio extra-vergine di olivaUna strategia che sta acquisendo particolare im...
studiò 12770 uomini di età compresa tra i 40 e i 59 anni, di Finlandia, Grecia, Italia, Giappone,Olanda, Stati Uniti e Jug...
Lo studio PREvencion con DIeta MEDiterranea (PREDIMED) (7) è un esperimento di prevenzioneprimaria lanciato nel 2003 7, in...
di piante e vegetali (12), probabilmente sintetizzati per preservare l’integrità della pianta dallecontinue minacce degli ...
legate alla loro struttura ortodifenolica, come mostrato in sistemi senza cellule (18) (19) e in modellianimali (20).Lo st...
L’assunzione di olio d’oliva ad alto contenuto di polifenoli ha modificato l’espressione di molti genicorrelati con l’obes...
Inoltre, i polifenoli dell’olio d’oliva modulano direttamente la risposta della parete vascolare agliinsulti pro-aterogeni...
BIBLIOGRAFIA1. Saini HK, Xu YJ, Arneja AS, Tappia PS, Dhalla NS. Pharmacological basis of different targetsfor the treatme...
10. Mena MP, Sacanella E, Vazquez-Agell M, Morales M, Fito M, Escoda R, et al. Inhibition ofcirculating immune cell activa...
20. Visioli F, Poli A, Gall C. Antioxidant and other biological activities of phenols from olives andolive oil. Med Res Re...
27. Konstantinidou V, Covas MI, Munoz-Aguayo D, Khymenets O, de la Torre R, Saez G, et al. Invivo nutrigenomic effects of ...
pregi e difetti dell’olio extravergine di olivaLanalisi sensoriale valuta le caratteristiche di un prodotto alimentare gra...
modi e dai tempi di conservazione delle olive prima della lavorazione, dai sistemi di estrazione,dalla modalità di stoccag...
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Regolamento CE 2568/91. Si specifica, inoltre, che l’ambiente dovrà essere gradevole, isolato dafonti di rumore o di inqui...
Fig. 4 Tabella precedente di valutazione della qualità degli oli.Questa scheda, denominata scheda numerica o strutturata, ...
1. Versare lolio in un apposito bicchierino di vetro scuro (il regolamento stabilisce una quantitàpari a circa 15 ml). Il ...
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ottenuto da frutti verdi. Lattributo fruttato si definisce maturo quando le sensazioni olfattivericordano quelle dei frutt...
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Il difetto di rancido, invece, dall’odore/sapore inconfondibile, è quello che deriva dall’ossidazionedei grassi e ci indic...
c) olio di sansa di oliva greggio: olio ottenuto dalla sansa delle olive mediante estrazione consolventi o processi fisici...
Tra i difetti di origine fermentativa, frequenti sono quelli di “avvinato - inacetito” (odore chericorda il vino o l’aceto...
fruttificare (1) e nessun altro paese possiede tante varietà autoctone di olivi (circa 538) (2).L’Italia detiene il primat...
olive cadano naturalmente poiché, in quel caso, fornirebbero oli con elevata acidità e con unprofilo sensoriale difettato....
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Tesina a cura del dott. Fabrizio Bossis - Corso di formazione "valore nutrizionale e salutistico di prodotti agroalimentari” - Università degli studi di Bari luglio 2012

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  1. 1. Dipartimento di Scienze Mediche di Base,Neuroscienze e Organi di SensoUniversità di Bari "A. Moro"Dipartimento interdisciplinare di Medicina,Università di Bari “A. Moro”Dipartimento di Scienze e tecnologie Biologiche ed Ambientali(DISTEBA), laboratorio di Biochimica e Biologia MolecolareUniversità del Salento – LecceIstituto di Fisiologia Clinica, CNR – LecceProgetto Strategico POR CIP_PS101CORSO DI FORMAZIONE “VALUTAZIONE NUTRIZIONALE ESALUTISTICA DI PRODOTTI AGROALIMENTARI”Relazione finaleFormanda:Mariangela Pellegrino23 novembre 20121
  2. 2. INDICE1. Analisi chimica dei costituenti minori degli oli extravergine di oliva pag.32. Valutazione chimica e biologico molecolare del valore antiossidante dei costituenti minori edell’impatto sulla bioenergetica cellulare pag.163. Valutazione clinica del potere salutistico degli oli extravergine di oliva pag.304. Valutazione organolettica sensoriale: pregi e difetti dell’olio extravergine di oliva pag.415. Procedure per la produzione dell’olio extravergine di oliva pag.552
  3. 3. Analisi chimica dei costituenti minori degli oli extra-vergine di olivaL’olio extra-vergine di oliva, una delle principali fonti di grassi della Dieta Mediterranea, ha unacomposizione chimica peculiare ed una qualità nutrizionale superiore rispetto agli oli ottenuti daisemi. E’costituito per il 95-98% dai trigliceridi insieme ad una piccola quota di digliceridi emonogliceridi, che rappresentano la frazione saponificabile (solubile), e per circa il 2% da compostiminori che rappresentano la frazione insaponificabile (insolubile). Questi ultimi sono diversiqualitativamente e quantitativamente e conferiscono ai diversi oli caratteristiche organolettiche,nutrizionali, dietetiche e merceologiche diverse.Gli acidi grassi presenti nei trigliceridi dell’olio extra-vergine di oliva sono in prevalenzamonoinsaturi ma sono presenti, anche se in minori concentrazioni, saturi e polinsaturi.Gli acidi grassi più rappresentativi sono i saturi palmitico (C16:0) e stearico (C18:0), i monoinsaturipalmitoleico (C16:1) ed oleico (C18:1) ed i polinsaturi linoleico (C18:2) e linolenico (C18:3). Questi ultimisono acidi grassi essenziali, rispettivamente precursori degli acidi grassi ω -6 ed ω -3, e devonoessere introdotti con l’alimentazione in quanto l’organismo umano non è in grado di sintetizzarli.I composti minori dell’olio extra-vergine di oliva (più di 230 sostanze chimiche diverse) hanno unruolo importante sia da un punto di vista nutrizionale-salutistico che organolettico. Sono:fosfolipidi, cere, sfingolipidi, idrocarburi, tocoferoli, alcoli alifatici superiori, steroli, metilsteroli,alcoli diterpenici e triterpenici, vitamine, pigmenti e ubichinoni.1. Fosfolipidi : Fosfatidilcolina, fosfatidiletanolammina. Derivati dell’acido glicerofosforico,presenti in quantità variabili ma mai elevate.2. Cere : Miscele complesse di esteri di acidi grassi a lunga catena con alcoli superiori.Costituiscono il rivestimento protettivo della drupa3. Sfingolipidi : Ammidi di acidi grassi con basi a lunga catena3
  4. 4. 4. Idrocarburi : Costituiscono oltre il 50% della frazione in saponificabile. Tra gli idrocarburisaturi il nonacosano è il predominante, tra gli insaturi il componente più abbondante è losqualene (precursore biosintetico di tutti gli steroli).5. Tocoferoli : α-, β - e γ -tocoferolo. Sono responsabili della stabilità ossidativa dell’olio.6. Alcoli alifatici superiori : Docosanolo, tetracosanolo, esacosanolo. Si trovano prevalentementeesterificati con acidi grassi e formano le cere che ricoprono il frutto.7. Steroli : β -sitosterolo si oppone all’assorbimento intestinale del colesterolo.Campesterolo, stigmasterolo, ∆ 5-avenasterolo.8. Metilsteroli : Obtusifoliolo, gramisterolo, citrostadienolo, isocitrostadienolo.Presenti in quantità molto basse (circa 150 ppm).9. Alcoli terpenici : Alcoli diterpenici, triterpenici, dialcoli triterpenici.Il cicloartenolo (alcool triterpenico) favorisce l’eliminazione del colesterolo in seguitoall’aumento della secrezione degli acidi biliari.Eritrodiolo ed uvaolo (dialcoli triterpenici) provengono dalla buccia.10. Vitamine : Liposolubili (A, D, PP, H).11. Pigmenti : Carotenoidi (β -carotene, luteina) responsabili delle tonalità gialle dell’olio.Clorofille (clorofilla, feofitine) responsabili delle tonalità verdi.12. Ubichinoni : Coenzima Q10 presente in quantità variabili da 0 a 40 ppm.Chimicamente costituiti da un nucleo 2,3-dimetossi-5-metilbenzochinone con una catenalaterale (in posizione 6) formata da 6 a 10 unità isopreniche.Nella frazione insaponificabile dell’olio extra-vergine di oliva sono presenti antiossidanti naturalirappresentati da caroteni, tocoferoli e sostanze fenoliche idrofiliche responsabili delle proprietàsalutistiche dell’olio extra-vergine di oliva.4
  5. 5. Mediamente la quantità di sostanze fenoliche presenti nell’olio extra-vergine di oliva oscilla tra 60 e400 mg/Kg.I composti fenolici dell’olio extra-vergine di oliva si originano durante il processo di estrazionemeccanica dell’olio (principalmente durante la frangitura e la gramolatura) a partire da glucosidicomplessi presenti nelle olive (oleuropeina e dimetiloleuropeina) grazie all’azione di enzimiidrolitici, le β -glucosidasi. Questi composti glucosidici sono anche i responsabili del saporeamaro delle olive.La composizione in sostanze fenoliche dell’olio vergine ed extra-vergine di oliva dipende damolteplici fattori, tra i quali il cultivar, il metodo di coltivazione, il grado di maturazione delladrupa, la tecnica di estrazione, la modalità di conservazione dell’olio.I composti fenolici e polifenolici dell’olio extra-vergine di oliva, detti anche biofenoli, sono statiindividuati più di 100 anni fa dal chimico italiano Canzonieri (1906)(1) e da allora le ricerche sonoaumentate portando alla conoscenza delle principali strutture chimiche (2)(3). Attualmente ibiofenoli dell’olio extra-vergine di oliva vengono distinti in cinque classi principali:1. Acidi fenolici e derivati : acido vanillico, acido caffeico, acido siringico, acido p-cumarico,acido o-cumarico, acido gallico, acido benzoico, acido p-idrossibenzoico, acido ferulico, acidocinnamico.2. Alcoli fenolici : Idrossitirosolo (3,4-DHPEA), Tirosolo (p-HPEA), 3,4-diidrossifeniletanologlucoside5
  6. 6. 3. Secoiridoidi : Oleuropeina aglicone, Oleuropeina, Ligstroside aglicone, Ligstroside4. Lignani : Acetossipinoresinolo, Pinoresinolo, Idrossipinoresinolo5. Flavonoidi : Apigenina, LuteolinaSperimentalmente è stato dimostrato che l’idrossitirosolo e le molecole che nella loro strutturapresentano gruppi ossidrilici in posizione 3 e 4 dell’anello benzenico hanno una capacitàantiossidante superiore. Inoltre, l’HT aumenta la stabilità ossidativa degli oli in fase diconservazione e manifesta una serie di proprietà salutistiche di grande interesse.Per poter estrarre le sostanze fenoliche dall’olio di oliva vengono utilizzate sostanzialmente duetecniche: l’estrazione liquido-liquido (LLE), in cui sono impiegate differenti miscele di solventi, el’estrazione su fase solida (SPE), con varie fasi stazionarie e miscele eluenti.Tutte le tecniche LLE riportate in letteratura prevedono l’utilizzo di una miscela di metanolo eacqua; l’unica differenza tra questi metodi, riguarda la quantità di acqua presente nella miscela cheva dallo 0% al 40%. In alcuni casi prima di procedere con l’estrazione LLE viene aggiunto all’oliodi oliva un solvente lipofilico che può essere l’esano (nella maggior parte dei casi) o l’etere dipetrolio o il cloroformio; tale aggiunta viene effettuata al fine di migliorare la capacità di recuperodelle sostanze fenoliche.Attualmente la maggior parte dei protocolli di LLE prevedono che l’aliquota di olio di oliva vengadisciolta in esano e poi venga aggiunta la soluzione metanolo/acqua. La miscela ottenuta vieneagitata su vortex per un minuto ed in seguito centrifugata a 3000 g per 5 minuti. Dopo la6Idrossitirosolo(3,4 diidrossifeniletanolo)Tirosolo(p-idrossifeniletanolo)Idrossitirosolo(3,4 diidrossifeniletanolo)Tirosolo(p-idrossifeniletanolo)
  7. 7. centrifugazione viene recuperata la fase idroalcolica nella quale sono presenti le sostanze fenoliche(l’estrazione viene ripetuta per 2 volte).La frazione fenolica estratta viene concentrata sotto vuoto a 35 oC mediante evaporatore rotante (es.ROTAVAPOR); questa apparecchiatura viene utilizzata comunemente per allontanare i solventi daun composto di interesse tramite evaporazione a bassa pressione.L’estratto fenolico, dopo essere stato risospeso in una soluzione metanolo/acqua, viene filtrato (confiltro da 0,45 µm) e conservato a -20 oC.L’estrazione delle sostanze fenoliche dalla matrice oleosa condotta su fase solida viene effettuatautilizzando come fase adsorbente delle cartucce C18 (Octadecil-silano) e come solvente di eluizioneil metanolo o l’acetonitrile.Dal confronto tra i due metodi utilizzati per estrarre i composti fenolici dall’olio extra-vergine dioliva sono emersi risultati contrastanti. Alcuni autori (Servili et al., 1999) (4) hanno dimostrato chel’estrazione in fase liquida condotta con metanolo/acqua è molto più efficiente nel recupero deiderivati dei secoiridoidi, mentre lo è molto meno per i fenoli semplici dell’olio extra-vergine dioliva. L’estrazione in fase solida presenta un comportamento opposto alla LLE. Tuttavia è statoosservato che sostituendo il solvente di estrazione, sia in fase liquida che solida, con aceto nitrile, irisultati cambiano nel senso che tra i due metodi non c’è alcuna differenza in termini di recuperodelle sostanze fenoliche presenti nella matrice oleosa.Dell’estratto fenolico ottenuto si può quindi determinare la concentrazione mediante metodospettrofotometrico utilizzando il reattivo di Folin-Ciocalteau. Questo metodo si basasull’ossidazione chimica dei composti fenolici da parte di una miscela ossidante costituita da acidofosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolibdico (H3PMo12O40) che, riducendosi, formano una misceladi ossidi (W8O23 e Mo12O40) colorata di azzurro che presenta un massimo assorbimento a 750 nm.Prima della lettura allo spettrofotometro si costruisce una curva di calibrazione in funzionedell’assorbanza a 750 nm di diverse soluzioni a concentrazioni crescenti di acido gallico.7
  8. 8. La concentrazione dell’estratto fenolico dell’olio extra-vergine di oliva viene calcolato medianteinterpolazione sulla retta di calibrazione.Per separare e valutare le frazioni contenute nell’estratto fenolico vengono utilizzate diversemetodiche. La tecnica più usata è la High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Fig.1).Fig. 1 Schema generale di un apparecchio HPLC.L’analisi HPLC consente la separazione dei singoli composti fenolici sulla base del diverso pesomolecolare e della differente polarità. I risultati quantitativi che si ottengono con questa tecnica nonsono direttamente confrontabili con quelli ottenuti mediante il metodo colorimetrico, che fornisceinvece informazioni relative alla componente fenolica totale.Questa tecnica cromatografica permette di separare i composti presenti in un campione sfruttandol’equilibrio di affinità tra una fase stazionaria, posta all’interno della colonna cromatografica, e una8
  9. 9. fase mobile che fluisce attraverso di essa. Le sostanze più affini alla fase stazionaria impiegano untempo maggiore per percorrere la colonna cromatografica (tempo di ritenzione) rispetto a quelle conbassa affinità per la fase stazionaria, che eluiscono prima.Nell’HPLC il campione da analizzare, caricato all’inizio della colonna cromatografica, viene spintoda una pompa attraverso la fase stazionaria utilizzando una fase mobile e applicando pressionidell’ordine delle centinaia di atmosfere. Con una microsiringa il campione viene iniettato attraversoun foro d’iniezione direttamente nella colonna o in uno strato di materiale inerte immediatamenteprecedente la colonna.Un altro metodo per introduzione del campione (il più usato in HPLC) è quello che utilizza uniniettore a spirale costituito da un occhiello metallico inserito lungo il capillare che alimenta lacolonna. In esso viene introdotto il campione, quindi, tramite una valvola, l’eluente viene incanalatonell’occhiello e cosi il campione si trova ad essere spinto nella colonna dall’eluente stesso, senzache il flusso di solvente si interrompa. La caratteristica principale del sistema di iniezione tramiteloop è l’alta riproducibilità dei volumi iniettati (Fig. 2).Fig. 2 Sistema di iniezione con loopLe colonne per HPLC sono di solito costruite in acciaio, ma esistono anche quelle in vetroborosilicato che vengono impiegate soprattutto quando si lavora a pressioni non troppo elevate. Alle9
  10. 10. due estremità delle colonne sono presenti dei setti perforati di acciaio inossidabile, o di teflon, cheservono a trattenere il materiale in essa contenuto. I setti devono essere omogenei per consentire unflusso uniforme di solvente.La lunghezza delle colonne è di solito compresa tra 10 e 30 cm, ma è possibile disporre di colonnepiù lunghe per particolari esigenze. Il diametro interno delle colonne è compreso tra 4 e 10 mm;quello delle particelle del riempimento varia tra 3,5 e 10 µm. Esistono anche modelli di colonne, direcente progettazione, più corte e sottili che permettono di ridurre il tempo di analisi ed il consumodi solvente.Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all’impiego di fasi stazionarie suddivisemolto finemente allo scopo di aumentare la superficie di contatto tra fase mobile e fase stazionariaed avere un migliore impaccamento.Per ottenere un’elevata efficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelledel riempimento siano molto ridotte, per questo motivo è indispensabile applicare un’elevatapressione se si vuole mantenere una ragionevole velocità di flusso dell’eluente e quindi un tempo dianalisi adeguato.Le fasi stazionarie utilizzate per la separazione dei composti fenolici contenuti nell’olio extra-vergine di oliva lavorano in fase inversa (RP-HPLC) ovvero sono meno polari della fase mobile.Le fasi stazionarie inverse sono in genere formate da silice su cui sono legati dei gruppi non polari;tra questi quelli più spesso legati alla superficie del supporto sono i gruppi organici: -CH3, -C8H17,-C18H37. Di questi il gruppo a 18 atomi di carbonio (gruppo ottadecil) è il più frequente. I nomicomunemente usati per questo tipo di fase stazionaria sono ODS e C18.Con questo tipo di fase stazionaria non polare di solito l’eluizione viene condotta con fase mobilepolare, che è quasi sempre costituita da una miscela di un solvente polare e di uno non polare, inmodo da poterne variare la forza mediante la composizione (eluizione in gradiente di polarità). Inquesto caso le sostanze polari presenti nel campione verranno eluite per prime dalla fase mobile.10
  11. 11. Gli eluiti così ottenuti vengono sottoposti a valutazione qualitativa e quantitativa facendoli passareattraverso un rivelatore.I rivelatori più ampiamente usati per l’HPLC si basano sulla misura dell’assorbimento della luceUV o visibile da parte del campione.La variazione dell’assorbimento, registrata su carta oppure immagazzinata in un file di un computer,dà luogo ad un grafico formato da una serie di picchi che prende il nome di cromatogramma.L’analisi dei picchi cromatografici ci permette di individuare la presenza di uno specificocomponente (analisi qualitativa) e di quantificare le sostanze presenti nella miscela (analisiquantitativa). L’analisi quantitativa può essere effettuata in base al fatto che il segnale prodotto dalrivelatore è, ad ogni istante, proporzionale al flusso delle molecole eluite (cioè massa nell’unità ditempo, s = dm/dt); si deduce che la quantità totale di sostanza eluita sarà data dall’integrale m =∫ s dt cioè dall’area della curva sottesa al picco cromatografico.Il sistema di rivelazione più usato per l’identificazione delle sostanze fenoliche è quello ad“assorbimento a serie di diodi”. Nel rivelatore a serie di diodi (DAD) la luce UV proveniente da unalampada a deuterio passa attraverso una cella a flusso e poiche viene scissa nelle sue componentiattraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa ad ogni lunghezza d’ondaviene misurata simultaneamente attraverso un sistema di alcune centinaia di fotodiodi. Un computerpuò processare, registrare e mostrare gli spettri di assorbimento in continuo durante l’analisi; inoltresi possono registrare i cromatogrammi a ciascuna λ.Il rivelatore a serie di diodi risulta essere molto versatile (è possibile selezionare λche vanno da 190a 800 nm), molto sensibile (si può scegliere la λ ottimale per un analita) e piuttosto selettivo(quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la λ in modo tale da minimizzarel’assorbimento degli interferenti).11
  12. 12. Un altro tipo di rivelatore utilizzato per l’identificazione delle sostanze fenoliche presenti nell’olioextra-vergine di oliva è lo “spettrometro di massa” applicato all’HPLC (HPLC-MS). Questo misurail rapporto massa/carica (m/z) degli ioni che vengono prodotti dal campione.Per ottenere uno spettro di massa le molecole, portate in fase gassosa, vengono ionizzate in unasorgente di ionizzazione.Una delle sorgenti più comuni è quella ad “impatto elettronico” (EI) (Fig. 3) nella quale le molecolevengono bombardate con un fascio di elettroni ad alta energia. Anche se nella sorgente ionicavengono prodotti contemporaneamente sia ioni positivi che negativi, viene scelta solo una polarità elo spettro consisterà o di soli ioni positivi o di soli ioni negativi. Le molecole non ionizzate e iframmenti neutri vengono allontanati dal sistema di pompaggio dello strumento.Fig. 3 Ionizzazione ad impatto elettronico.Gli spettri di massa di ioni positivi sono quelli più comunemente misurati con la tecnica EI, datoche il numero di ioni negativi generati è decisamente minore rispetto a quello degli ioni positivi.Questi ultimi vengono guidati nell’analizzatore mantenendo la sorgente ionica ad un potenzialepositivo rispetto a quello dell’analizzatore e focalizzando il fascio ionico mediante opportunipotenziali applicati ad un sistema di lenti situate tra la sorgente e l’analizzatore. Il ruolo12
  13. 13. dell’elettrodo repulsore, al quale viene applicato un potenziale positivo, è quello di provocarel’espulsione degli ioni dalla sorgente ionica. Gli ioni negativi e gli elettroni vengono attrattisull’elettrodo collettore degli elettroni, carico positivamente.Un’altra tecnica di ionizzazione largamente usata in HPLC è l’ “Elettrospray Ionization” (ESI) (Fig.4) nella quale le frazioni in uscita dall’HPLC passano attraverso un capillare a pressioneatmosferica mantenuto ad alto voltaggio. L’alto voltaggio disperde il flusso del liquido e lotrasforma in tante piccole goccioline altamente caricate e del diametro di alcuni µm. L’evaporazionedel solvente causa un’ulteriore riduzione del diametro delle gocce e quindi un aumento della densitàdi carica. L’aumento delle cariche sulla superficie delle gocce induce una forza repulsiva checulmina con una esplosione coulombiana, che riduce ulteriormente il diametro delle gocce.Questo processo continua fino a che le gocce non sono abbastanza piccole da permettere allo ionedell’analita di passare nella fase gassosa. Per facilitare la formazione delle gocce in uscita dalcapillare può essere aggiunto un flusso nebulizzato di azoto. In alcuni casi, per facilitare il processodi evaporazione del solvente, all’ingresso del capillare viene applicato un flusso di azoto anidro.Fig. 4 Elettrospray ionizationIl campione, ionizzato mediante esplosione coulombiana, viene posto nelle condizioni ottimali peressere analizzato.13
  14. 14. L’analizzatore di massa separa gli ioni sulla base dei loro valori m/z. I più comuni analizzatori sonoil “filtro di massa a quadrupolo” e la “trappola ionica”, dove avviene l’immagazzinamento degliioni nello spazio compreso tra l’elettrodo anulare e l’elettrodo di chiusura terminale.Il campo elettrico oscillante espelle sequenzialmente gli ioni con valori m/z crescenti.L’accoppiamento HPLC-MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60) ma soltanto dalla metàdegli anni ’70 sono apparse le prime pubblicazioni scientifiche.Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si utilizzano solventi moltodiversi, in funzione del tipo di analisi (es. acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi disolvente in HPLC sono molto più elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Peraccoppiare le due tecniche sono necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi devonoconsentire anche la vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.Anche se l’HPLC-MS permette di ottenere ottimi risultati viene poco utilizzata per compiere analisidi tipo routinario sui composti fenolici presenti nell’olio extra-vergine di oliva, questo perché sitratta di apparecchi molto costosi e di difficile gestione.Per tale motivo si preferisce impiegare l’HPLC accoppiata al rivelatore UV dal momento che questosistema ha una facile gestione e consente di ottenere buoni risultati a bassi costi.BIBLIOGRAFIA1. F. Canzonieri. Gazz. Chim. Ital. 1906, 36, 372.14
  15. 15. 2. C. Cantarelli. Sui polifenoli presenti nella drupa e nell’olio di oliva. Riv. Ital. Sost. Grasse.1961, 38: 69-72.3. G.F. Montedoro, C. Cantarelli. Indagine sulle sostanze fenoliche presenti nell’olio di oliva.Riv. Ital. Sost. Grasse. 1969, 46, 115-124.4. Servili M., Baldioli M., Mariotti F. Montedoro G.F. Phenolic composition of olive fruit andvirgin olive oil: distribution in the costitutive parts of fruit and evolution during oil mechanicalextraction process. Acta Horticulturae 474 (1999) 609-619.Valutazione biochimica e biologico molecolare del valore antiossidante deicostituenti minori e dell’impatto sulla bioenergetica cellulare15
  16. 16. La Dieta Mediterranea è associata ad una più bassa incidenza di tumori (prostata, polmone, laringe,ovaio, seno, colon), malattie cardiovascolari, malattie neurodegenerative, invecchiamento precoce,tutte condizioni associate a stress ossidativo (1-6) e quindi a produzione di ROS, specie reattivedell’ossigeno.Le fonti di ROS nell’organismo sono diverse: la catena respiratoria, la fagocitosi, la sintesi diprostaglandine, il sistema citocromo P450. In tutti questi processi una piccola quota di ossigenosfugge alla normale utilizzazione portando alla formazione di composti instabili e altamente reattivi(ROS).A livello cellulare circa il 5% del metabolismo dell’ossigeno si realizza attraverso reazioni diriduzione in cui si assiste al trasferimento di un solo elettrone e alla formazione a cascata di diverseforme radicaliche endogene (ROO●, ●O2-, ●OH) ed esogene (NO●, ●ONO-2), che principalmentesi situano intorno alla struttura mitocondriale ma possono distribuirsi anche in vari distretti cellulari(7) (8).L’organismo umano ha sviluppato sofisticati meccanismi allo scopo di mantenere l’omeostasiredox, aumentando l’eliminazione dei radicali o bloccandone la produzione. Essi comprendonodifese antiossidanti endogene (enzimatiche e non) e difese esogene, per lo più rappresentate daantiossidanti assunti con la dieta (9-11) tra i quali i polifenoli naturali sono stati studiati per la lorocapacità di modulare diverse attività cellulari.I polifenoli agiscono principalmente donando radicali idrogeni a radicali perossidi (ROO•) che siformano nelle fasi iniziali di ossidazione lipidica. Si forma così un radicale stabile (A•) attraverso lareazione: ROO• + AH →ROOH + A• . In questo consiste l’attività antiossidante delle sostanzefenoliche presenti nell’olio vergine ed extravergine di oliva.Numerosi studi sono stati condotti sulle proprietà antiossidanti di tali sostanze, ed è emerso che laconcentrazione totale dei composti fenolici, espressa come polifenoli totali, è strettamente correlatacon lo shelf-life dell’olio stesso.16
  17. 17. Le cellule rispondono allo stress ossidativo attivando la trascrizione di geni implicati nella rispostaantiossidante la cui espressione è regolata dal fattore trascrizionale Nrf2 (nuclear related factors 2).Nrf2 in condizioni basali è sequestrato nel citoplasma da Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), una proteina del citoscheletro che possiede alcuni residui di cisteina confunzione di “sensore” (12). Lo stress ossidativo, modificando tali cisteine, induce il distacco diNrf2 che può così migrare nel nucleo (13) e legarsi agli elementi di risposta antiossidante oantioxidant responsive elements (ARE), sequenze geniche localizzate nel sito del promotore dialcuni geni indotti da stress ossidativo e chimico.Nrf2 svolge un ruolo critico nella regolazione dell’espressione dei geni che codificano per lafamiglia delle GST (enzimi di fase 2), per l’NAD(P)H chinone ossidoreduttasi (14), per altri enzimidella fase 2 (l’UDP glucoronil-trasferasi 1A6 e l’aldeide reduttasi) e per proteine antiossidanti qualil’emeossigenasi 1 (HO-1), la superossido dismutasi, la catalasi, la glutatione perossidasi e latioredossina (14).Il meccanismo con cui lolio doliva aumenta lattività degli enzimi antiossidanti sembra esserelegato ad un aumento dellattività di Nrf2. Topi knock-out per Nrf2 esposti a irradiazione toracicasimile a quella di pazienti con cancro, vivono circa 35 in meno rispetto ai topi con una normaleespressione genica di Nrf2 (15). Un recente studio su modelli animali ha osservato una correlazionetra il consumo a lungo termine di olio doliva (4,5 mesi), aumento dei livelli di Nrf2 e di prodottigenici ad esso associati, GST, γ-GCS, NQO1 (16).In pazienti ad elevato rischio di malattie cardiovascolari il consumo di olio doliva è associato a piùalti livelli plasmatici di antiossidanti, riduzione della proteina C reattiva (hs-CRP) e peso corporeo,fattori di rischio per tali malattie (17).Tra i differenti composti fenolici presenti nell’olio di oliva, l’idrossitirosolo (HT) è quellomaggiormente studiato poiché possiede proprietà antiaterogeniche.17
  18. 18. Studi in vivo, in modelli animali di aterosclerosi indotta, hanno mostrato un miglioramento delprofilo lipidico ematico dopo somministrazione di HT e una riduzione nello sviluppo di lesioniaterosclerotiche (18). L’HT inibisce l’espressione superficiale di molecole di adesione pro-aterogeniche come ICAM-1, VCAM-1 ed E-selectina in cellule endoteliali umane isolate dacordone ombelicale (19). In cellule endoteliali vascolari l’HT stimola la proliferazione cellulare,promuove la riparazione delle ferite, protegge le cellule dal danno indotto da ossidanti attraverso ipathways ERK1/2 e PI3K/Akt, che portano all’attivazione di Nrf2 e induzione di HO-1(emeossigenasi-1) (20). In cellule monocitiche THP-1 il trattamento con HT riducesignificativamente la produzione di NO e la formazione di ROS indotta da LPS, determinando unaumento dei livelli di GSH in cellula (21).Assunto con la dieta, l’HT viene assorbito e in parte metabolizzato a livello epatico e intestinale inglucuronide coniugato e in alcol omovanillico (HVA).L’HT e i suoi metaboliti si distribuiscono, attraverso il circolo sanguigno, nei vari organi,concentrandosi preferenzialmente a livello renale prima di essere escreti. L’HT e il suo metabolitaHVA sono in grado di proteggere le cellule renali (LLC-PK1) dal danno ossidativo indotto dal H2O2inibendo la perossidazione lipidica, attraverso una modulazione dei segnali cellulari implicati nellarisposta allo stress ossidativo. Il pretrattamento con HT protegge i lipidi di membrana dall’azioneossidante del H2O2. L’HVA mostra un’azione meno efficace (ma comunque significativa) dell’HTnel conservare l’integrità della membrana.Tra le varie proteine coinvolte nella risposta allo stress ossidativo sono particolarmente importantile MAPK (come ERK e JNK) e la proteina chinasi B/Akt (Akt/PKB), i cui pathways regolano lasopravvivenza o la morte cellulare. Il H2O2 è capace di attivare o disattivare queste proteine,interferendo con le vie di segnalazione che queste controllano. I due fenoli (maggiormente HTrispetto ad HVA) proteggono la cellula dalla morte e inibiscono i cambiamenti di fosforilazionedelle proteine ERK1/2, JNK e Akt/PKB indotti dal H2O2.18
  19. 19. È molto probabile, quindi, che l’effetto protettivo degli antiossidanti naturali, così come dell’HT edell’HVA, in sistemi biologici più complessi e in vivo, sia il risultato di diversi meccanismid’azione che contrastano in modo diretto o indiretto l’azione dell’agente ossidante. L’HT hamostrato un’elevata azione protettiva; l’HVA, benché meno attivo, ha mostrato comunqueun’attività antiossidante significativa a concentrazioni biologicamente rilevanti. Questo dato rivesteuna particolare importanza biologica. Infatti l’HT in vivo, anche se in parte metabolizzato in HVA,dovrebbe conservare la sua attività.Wartela et al. (22) dimostrano una differente attività antiossidante di idrossitirosolo e tirosolo (TY)in cellule di mammella. L’HT è uno scavenger più efficiente di radicali liberi rispetto al TY, maentrambi non riescono a influenzare la proliferazione cellulare, le fasi del ciclo cellulare e l’apoptosiin cellule epiteliali mammarie umane (MCF10A) o in cellule tumorali di mammella (MDA-MB-231e MCF7). L’HT riduce i livelli di ROS in cellule MCF10A ma non in cellule MCF7 e MDA-MB-23,mentre concentrazioni molto elevate di TY sono necessarie per diminuire il livello di ROS in celluleMCF10A.L’HT, inoltre, previene i danni ossidativi del DNA in tutte le linee cellulari di seno, pertanto, per lasua attività antiossidante e la sua protezione contro il danno ossidativo al DNA in cellulemammarie, potrebbe contribuire ad una minore incidenza di cancro al seno nelle popolazioni checonsumano olio di oliva vergine (22).L’HT, a lungo considerato soltanto un potente antiossidante, in realtà è in grado di agire comenutriente a target mitocondriale fornendo un nuovo meccanismo dellefficacia della DietaMediterranea nel ridurre il rischio di diverse malattie tra cui malattie cardiovascolari, cancro,diabete e obesità.E’ noto che la malattia cardiovascolare è la complicanza più comune e più grave del diabete edell’obesità e, poiché la respirazione mitocondriale svolge un ruolo fondamentale nel metabolismodel glucosio, una disfunzione mitocondriale è associata a diabete e obesità (23-25).19
  20. 20. Hao et al. hanno dimostrato, in adipociti murini 3T3-L1, che il trattamento con HT porta ad unmiglioramento della funzione mitocondriale poiché ne stimola la biogenesi (26). L’HT promuovel’espressione della proteina PPARGC1α, regolatore chiave della biogenesi mitocondriale e dei suoibersagli a valle, Nrf1, Nrf2 e il fattore di trascrizione mitocondriale Tfam.Inoltre, l’HT incrementa il mtDNA e promuove l’espressione di proteine del complessomitocondriale I, II, III, IV e V; up-regola lespressione di proteine e di geni legati all’ossidazionedegli acidi grassi (PPARα, PPARγ, CPT1), l’adipogenesi e la funzione mitocondriale, e riduce ilcontenuto in acidi grassi liberi (FFA).L’HT promuove la biogenesi mitocondriale: up-regola AMPK ed eNOS, stimola lespressione diPPARGC1α e di Tfam, rispettivamente coattivatore e fattore di trascrizione chiave coinvolti nellabiogenesi mitocondriale. Inoltre l’HT aumenta i livelli di proteina mitocondriale dei complessi I, II,III e V, up-regola l’espressione del gene UCP2, bersaglio di PPARGC1α, coinvolto nella funzionemitocondriale (27).Oltre alla classica azione antiossidante sono state descritte anche azioni pro-ossidanti dei polifenoli,che possono, quindi, avere effetti opposti sui processi fisiologici cellulari di base. Se da un lato,come antiossidanti, possono migliorare la sopravvivenza cellulare, dall’altro, come pro-ossidanti,possono indurre apoptosi, necrosi o arresto della proliferazione (28).E generalmente accettato che i composti fenolici dellolio di oliva possono esercitare la loro attivitàdi prevenzione del cancro, agendo sia come composti anti-iniziazione che come composti anti-promozione/progressione (29). Uno dei possibili meccanismi anti-promozione/progressione èrappresentato dalla capacità dei fenoli dellolio di oliva di interferire con la proliferazione elapoptosi delle cellule tumorali.Lidrossitirosolo ortodifenolo (3,4-diidrossifeniletanolo (3,4-DHPEA)), è abbondantemente presentenell’olio di oliva come composto sia libero che legato alla forma dialdeidica dellacido elenolicolegata al 3,4-DHPEA (3,4-DHPEA-EDA), e come isomero dell’oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-20
  21. 21. EA) (30). Il 3,4-DHPEA inibisce la proliferazione ed induce l’apoptosi in diverse linee cellularitumorali (29) (31-35).Tuttavia, i risultati ottenuti su cellule tumorali derivate da differenti organi sono in disaccordo.In cellule di leucemia promielocitica (HL60) il trattamento con 100 µM di 3,4-DHPEA inibisce lacrescita e induce una massiccia apoptosi (34) (36), altera la progressione del ciclo cellulare,inibendo la transizione in fase G1-S, e modifica lespressione di proteine regolatrici del ciclocellulare riducendo l’espressione della chinasi ciclina-dipendente 6 (CDK6) e aumentandol’espressione di inibitori delle CDK (p21WAF1/Cip1 e p27 Kip1) (35).Un comportamento diverso è stato riportato per cellule di cancro al seno della linea MCF-7 eSKBR3, che risultano resistenti al trattamento con 100 µM di 3,4 -DHPEA (37) e richiedono altaconcentrazione di fenolo (MCF-7, 324 µM) per osservare un effetto sullapoptosi e sullaproliferazione (38). Altri autori riportano che cellule MCF-7 sono resistenti all’azione pro-apoptotica di 3,4-DHPEA (400 µM), effetto legato allassenza di caspasi-3 in queste cellule (39).In netto contrasto, con i dati sopra riportati, è lo studio di Goulas et al. in cui è stato dimostrato chele cellule MCF-7 sono molto sensibili all’attività antiproliferativa di 3,4-DHPEA, dove iltrattamento con 12,5 µM riduce del 50% la crescita cellulare (40). Inoltre, è stato recentementedimostrato che 3,4-DHPEA è in grado di inibire la proliferazione indotta dall’estradiolo in celluletumorali di seno MCF-7 interferendo con l’attivazione di ERK 1/2 (41).Contrastanti risultati sono stati ottenuti anche su cellule di cancro del colon HT-29, che risultanoresistenti all’effetto antiproliferativo di 3,4-DHPEA fino a concentrazione pari a 400 µM (42); inaltri studi è stato però riportato che queste cellule sono sensibili all’effetto pro-apoptotico aconcentrazioni tra 200-400 µM (31) (39).Nella linea cellulare di tumore del colon Caco2, il trattamento con 3,4-DHPEA (50-100 µM)provoca una riduzione della crescita cellulare sia per laccumulo di cellule nella fase G2 del cicloche per linibizione della fosforilazione di ERK1/2 (32).21
  22. 22. Infine, è stato riportato che cellule di melanoma umano M14 rispondono al trattamento con 3,4-DHPEA solo a concentrazioni superiori a 600-800 µM (33).Recentemente è stato dimostrato che le proprietà anti-proliferative e pro-apoptotiche dell’HT, sucellule HL60, sono mediate da un’attività pro-ossidante che consiste nella generazione di perossidodi idrogeno nel mezzo di coltura cellulare (43).Il rilascio di H2O2 è stato descritto anche per altri composti fenolici di origine vegetale, sia quandotestati come miscele complesse, come quelli derivati dai semi di uva (44), mele (45), tè e vino (46),sia quando usati come composti purificati, come l’acido gallico, la quercetina (47), lascorbato (48),e l’epigallocatechina gallato (49).È possibile che gli effetti esercitati da 3,4-DHPEA sulle diverse linee cellulari siano dovuti alla suacapacità di rilasciare H2O2 nel mezzo di coltura. Perciò le diverse risposte possono dipendere dallacapacità delle cellule di eliminare H2O2 attraverso specifici enzimi, quali catalasi e glutationeperossidasi.Vi è una diretta correlazione tra l’aumento del consumo di ossigeno durante l’esercizio e laproduzione di radicali dell’ossigeno. Basse e fisiologiche concentrazioni di ROS sono richieste perla normale produzione di energia nel muscolo scheletrico, ma alti livelli di ROS (come ad esempioin seguito ad un esercizio eccessivo) promuovono disfunzioni nel processo di contrazione, conconseguente debolezza muscolare e fatica (50). Questo accumulo provoca uno stress ossidativo, conuna conseguente attivazione del processo di autofagia, nel muscolo e induzione della fissionemitocondriale. Quindi il mitocondrio ha un ruolo fondamentale nella regolazione dell’autofagia nelmuscolo scheletrico e nei processi che portano ad atrofia muscolare (51).Nei ratti, l’atrofia del muscolo (indotta dall’autofagia) e la fissione mitocondriale vengono bloccatedalla supplementazione con HT; nei ratti sottoposti a esercizio eccessivo l’HT induce la fusionemitocondriale, aumenta l’attività funzionale del complesso I e II apportando effetti benefici sulleperformance fisiche ed effetti rilevanti su varie patologie correlate a disfunzioni mitocondriali (52).22
  23. 23. E’ ampiamente descritto in letteratura, inoltre, che l’iperglicemia porta ad una over-produzione diradicali liberi e ad una glicazione non-enzimatica delle proteine, che hanno un effetto deleterio sudifferenti organi. Oleuropeina e idrossitirosolo, hanno effetti ipoglicemici, ipolipidemici eantiossidanti in ratti diabetici, in cui si osserva una diminuzione delle attività antiossidanti (inparticolare della SOD e CAT) e un innalzamento dei livelli di TBARS. La somministrazione dicomposti fenolici in tali ratti ripristina, in modo dose-dipendente, i sistemi antiossidanti e porta adun abbassamento significativo dei livelli di TBARS.Studi epidemiologici hanno dimostrato che l’alimentazione può costituire un importante fattore diprotezione ambientale nei confronti delle malattie cardiovascolari e neoplastiche. Rivestono unaparticolare importanza i prodotti vegetali, frutta, verdura, olio di cui è ricca la Dieta Mediterranea.Studi scientifici degli ultimi anni hanno chiarito che i polifenoli presenti nell’olio extravergine dioliva, in primis l’idrossitirosolo, sono in grado di combattere i radicali liberi attraverso duemeccanismi principali: riescono a stabilizzare direttamente le molecole radicaliche attraverso lasottrazione di un elettrone; in secondo luogo, attivano meccanismi intracellulari che promuovonol’innalzamento dei livelli degli antiossidanti fisiologicamente presenti nelle cellule.Un aspetto nuovo della ricerca, che sta emergendo dalle pubblicazioni degli ultimi anni, è che ipolifenoli agiscono anche nella prevenzione del danno mitocondriale, apportando notevolimiglioramenti in termini di vitalità dei mitocondri, resistenza a sostanze tossiche ed eventi lesivi.Da questi dati si evince come i prodotti ricchi di polifenoli, come l’olio, oltre che contrastarel’azione dannosa dei radicali liberi possono anche riportare energia nel nostro organismo, favorendola risoluzione di situazioni di stanchezza intensa dovuta alla compromissione dell’equilibrioossidativo e alla diminuzione dell’efficienza dei meccanismi di creazione dell’energia.23
  24. 24. BIBLIOGRAFIA1. Bosetti C et al. Food groups and laryngeal cancer risk: a case control study from Italy andSwitzerland. Int J Cancer, 2002a; 100:355–360.24
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  30. 30. Valutazione clinica del potere salutistico dell’olio extra-vergine di olivaUna strategia che sta acquisendo particolare importanza nel nostro tempo, in cui le malattiecardiovascolari stanno affliggendo tutto il mondo nonostante l’uso di nuovi e potenti farmaci (1), èl’approccio preventivo dietetico che va sotto il nome di “Dieta Mediterranea”.Questa è basata su osservazioni prodotte sin dal 1950 che dimostrano una bassa incidenza dimalattia coronarica in popolazioni residenti del Mediterraneo come Grecia e Sud Italia, che hannoaderito ad uno stile dietetico tipico mediterraneo.Queste popolazioni seguivano una dieta ricca in olio extravergine di oliva (il maggiore grassodietetico) insieme a un moderato consumo di vino rosso. Sia l’olio d’oliva che il vino rosso sonoricchi in antiossidanti polifenolici. Gli acidi grassi insaturi e i polifenoli dell’olio d’oliva sembranocontribuire alla prevenzione dell’aterosclerosi, attraverso una riduzione dei fattori di rischiocardiovascolari.La Dieta Mediterranea è caratterizzata da un consumo elevato di olio extravergine di oliva comeprincipale fonte di grasso, cereali, verdure e cibi di origine vegetale, frutta fresca (ricca inantiossidanti naturali), pesce (ricco in acidi grassi poli-insaturi omega3), un moderato consumo divino rosso e un consumo ridotto di carne, prodotti caseari, uova e dolci (2).Fino agli anni 60, le persone che abitavano in certe regioni del Mare Mediterraneo avevano livelli dimalattia cronica tra i più bassi del mondo, e allo stesso tempo presentavano le aspettative di vita piùalte (3). Questo ha promosso un interesse nello stile dietetico mediterraneo.Una spiegazione non sta certamente nel livello di istruzione, lo stato finanziario o la sanità, poichètutti gli indicatori socio-economici in questi paesi sono spesso più bassi dei paesi industrializzati,dove al contrario l’incidenza delle malattie coronariche è più alta (4).Ancel Keys condusse osservazioni preliminari per iniziare uno studio cooperativo riguardoall’epidemiologia della malattia cardiovascolare (CHD), chiamato ‘Seven Countries Study’, in cui30
  31. 31. studiò 12770 uomini di età compresa tra i 40 e i 59 anni, di Finlandia, Grecia, Italia, Giappone,Olanda, Stati Uniti e Jugoslavia (5).Sono state misurate ampie differenze tra i tassi di prevalenza di CHD tra le coorti standardizzate peretà in seguito a evidenze elettrocardiografiche di infarti miocardici precedenti, che erano piùfrequenti in USA e Finlandia rispetto a Yugoslavia, Grecia, Italia e Giappone. Tra 12529 uomini nonaffetti da CHD all’inizio dell’esame, in 5 anni di esperimenti, i tassi di incidenza di malattiacardiovascolare standardizzati per età differivano largamente tra le coorti studiate; l’estremo piùalto era rappresentato dalla Finlandia e quello più basso da Giappone e Grecia. L’esame dei fattoridi rischio più importanti conosciuti in quel tempo hanno dimostrato che il fumo, una vita sedentaria,e il peso corporeo non spiegavano le differenze tra le coorti nell’incidenza di malattiacardiovascolare. Queste differenze erano strettamente correlate ai valori di colesterolo sierico e allecalorie dietetiche fornite dai grassi saturi (2).Sorprendentemente è stata trovata una correlazione inversa tra i tassi di incidenza di CHD e lapercentuale media delle calorie derivate dagli acidi grassi monoinsaturi, come indice del consumodell’olio di oliva, indicando così per la prima volta il ruolo cardioprotettivo dell’olio di oliva.In un recente studio prospettico su una coorte Greca di 22043 adulti, l’European ProspectiveInvestigation into Cancer and Nutrition (EPIC) study, è stato mostrato che, dopo 44 mesi di follow-up, una maggiore aderenza alla dieta mediterranea era inversamente correlata con la mortalità totalee in particolare con la mortalità da CHD, indipendentemente da sesso, fumo, livello di istruzione,indice di massa corporea, e attività fisica. La relazione diventava più forte con l’età, riflettendoquindi una maggiore e cumulativa esposizione ai fattori della dieta (6).Prove di alimentazione hanno confermato studi osservazionali, osservando un effetto benefico delladieta mediterranea, e in particolare dell’olio extravergine di oliva, nella prevenzione primaria esecondaria di CHD.31
  32. 32. Lo studio PREvencion con DIeta MEDiterranea (PREDIMED) (7) è un esperimento di prevenzioneprimaria lanciato nel 2003 7, in corso, multicentrico, randomizzato e controllato, in cui 7500pazienti asintomatici con un elevato rischio cardiovascolare sono stati assegnati in modo casuale atre gruppi di intervento: due gruppi hanno seguito una dieta mediterranea supplementata con oliovergine di oliva (1 L/settimana) o con un mix di noccioline (30 g/giorno), e un gruppo ha ricevutoindicazioni a ridurre tutti i tipi di grasso in accordo con le linee guida dell’ American HeartAssociation (dieta a basso contenuto di grassi) (8).Sono stati osservati dei cambiamenti benefici nei fattori di rischio cardiovascolare principali (lipidiplasmatici, glucosio, pressione arteriosa) e nelle concentrazioni plasmatiche di biomarkerinfiammatori (interleuchina[IL]-6, VCAM-1 e ICAM-1) in entrambi i gruppi di intervento di tipomediterraneo a tre mesi (7) e confermati a 1 anno (9).Inoltre è stato osservato dopo tre mesi, in entrambi i gruppi che seguivano la Dieta Mediterranea,una down regolazione dei biomarker dell’attivazione immunitaria cellulare correlati all’aterogenesi,così come l’espressione delle molecole di adesione e del ligando pro-infiammatorio CD40 su LcT emonociti (10), suggerendo così che la Dieta Mediterranea potrebbe influenzare in modosignificativo il processo dell’adesione stabile dei monociti circolanti e dei LcT alle celluleendoteliali durante l’infiammazione, un evento precoce cruciale correlato allo sviluppodell’aterosclerosi.Entrambe le diete Mediterranee sono state efficaci nell’indurre la regressione dell’aterosclerosi nellacarotide, come valutato dalla misurazione dello spessore dell’intima-media (IMT), dopo 1 anno diintervento su soggetti con valori elevati di IMT (11).Quindi, poichè la Dieta Mediterranea è associata ad un’incidenza ridotta della CHD, c’è stato ungrande interesse nella valutazione dei composti bioattivi trovati negli alimenti capaci di ridurre ilrischio di malattia cronica. Tra i composti bioattivi alimentari, i fitochimici mediterranei hannoattirato un notevole interesse scientifico. Questi sono composti derivati dal metabolismo secondario32
  33. 33. di piante e vegetali (12), probabilmente sintetizzati per preservare l’integrità della pianta dallecontinue minacce degli stress ambientali. Inoltre, questi composti contribuiscono alla resistenza amicrorganismi e insetti, alla pigmentazione e alle caratteristiche organolettiche come sapore earoma.Da un punto di vista chimico, sono composti fenolici con una struttura aromatica e uno o più gruppiidrossilici. I fenoli con due o più gruppi idrossilici (polifenoli) presentano una capacità antiossidanteelevata in vitro, mentre i fenoli con un gruppo idrossilico hanno una capacità ridotta o assente (13).Esistono più di 8000 strutture fenoliche, che variano da molecole semplici fino a compostialtamente polimerizzati, i tannini. Sono state definite più di 10 classi di composti polifenolici sullabase della struttura chimica (14).Sebbene i composti fenolici sono presenti teoricamente in tutte le piante, il loro livello nella dietadipende dal tipo e dalla quantità di cibi vegetali consumati. In particolare, le olive e l’olio di oliva,sono particolarmente ricchi di composti fenolici con proprietà antiossidanti e attività biologica inpiante, animali e nell’uomo (15). L’olio di oliva, in particolare l’olio derivante dalla primaspremitura, meglio conosciuto come olio extra-vergine, ha un alto contenuto di polifenoli con unpotente potere antiossidante (15).Essi costituiscono una miscela complessa di composti tra cui l’idrossitirosolo, il tirosolo, l’acido 4-idrossifenilacetico, l’acido protocatecuico, l’acido siringico, l’acido vanillico, l’acido caffeico el’acido p-cumarico. La concentrazione della frazione fenolica nell’olio di oliva varia in base allecultivar, al clima, e al grado di maturazione del frutto, con concentrazioni sopra gli 800 mg/kgosservate nell’olio extravergine di oliva (16).Delle varie componenti fenoliche dell’olio di oliva, l’idrossitirosolo sembra essere il più importante(17).Esso è presente in forma libera e anche come costituente di molecole complesse comel’oleuropeina. L’idrossitirosolo e il suo derivato oleuropeina hanno forti proprietà antiossidanti33
  34. 34. legate alla loro struttura ortodifenolica, come mostrato in sistemi senza cellule (18) (19) e in modellianimali (20).Lo studio umano più completo sui fenoli dell’olio d’oliva e sulla prevenzione cardiovascolare è loStudio dell’Effetto dell’Olio d’Oliva sul Danno Ossidativo nelle Popolazioni Europee(EUROLIVE), un multicentrico, randomizzato, incrociato, intervento di sperimentazione clinica chemira a valutare, in 200 volontari sani, l’effetto del regolare consumo di tre differenti olii (25mL/giorno), ossia con contenuto di polifenoli basso (2.7 mg/kg di olio di oliva), medio (164 mg/kg)e alto (366 mg/kg), sui lipidi plasmatici e sui marker circolanti di stress ossidativo, come fattori dirischio cardiovascolare.I risultati mostrano che i fenoli dell’olio di oliva sono significativamente associati a più basseconcentrazioni di marker di stress ossidativo circolanti e a un miglioramento del profilo lipidico(aumento dei livelli di HDL, riduzione del rapporto colesterolo totale/HDL e riduzione dei livelli ditrigliceridi) (21).Altre recenti linee di evidenza nell’uomo indicano che l’olio di oliva e le sue componenti isolate,come i polifenoli, migliorano la pressione sanguigna (22), la disfunzione endoteliale valutata comedilatazione flusso mediata (23), e il profilo emostatico (24).E’ stato ipotizzato che gli effetti benefici dell’olio di oliva potrebbero essere dovuti allamodulazione di geni implicati nella proliferazione, nelle vie antiossidanti e infiammatorie.Recentemente, Camargo et al. (25) hanno analizzato se la frazione fenolica dell’olio d’oliva esercitaun effetto a livello trascrizionale in vivo, mediante l’utilizzo di tecniche di analisi dell’espressionegenica. A questo scopo, è stata eseguita un’analisi microarray dell’espressione genica postprandiale,dopo assunzione di olio di oliva vergine ad alto (398 mg/Kg di olio di oliva) e basso (70 mg/Kg diolio di oliva) contenuto di fenoli, su cellule mononucleate di sangue periferico di 20 pazienti consindrome metabolica.34
  35. 35. L’assunzione di olio d’oliva ad alto contenuto di polifenoli ha modificato l’espressione di molti genicorrelati con l’obesità, la dislipidemia e il diabete mellito di tipo 2. Alcuni geni tra questi, sonoimplicati nei processi infiammatori tra cui il fattore di trascrizione nucleare NFκB, il complessoproteico attivatore AP-1, le citochine, le proteine chinasi attivate dai mitogeni (MAPKs) o le vieacido arachidonico/eicosanoidi.Il consumo di olio di oliva ad alto contenuto di polifenoli, vale a dire olio extravergine, ha repressol’espressione di molti geni pro-infiammatori e pro-aterosclerotici, promuovendo così un profilomeno infiammatorio in cellule mononucleate di sangue periferico (25). Questi risultati concordanocon studi precedenti che mostrano che una dieta Mediterranea ricca in olio vergine di oliva riduce larisposta infiammatoria di cellule mononucleate di sangue periferico, rispetto a diete arricchite conburro e noci o diete Occidentali (26).In un altro studio di nutrigenomica 90 volontari sani sono stati divisi in tre gruppi: il primo haseguito la dieta Mediterranea tradizionale arricchita con olio di oliva vergine, il secondo la dietaMediterranea tradizionale con olio di oliva lavato contenente un minore contenuto di polifenoli (55e 328 mg/kg rispettivamente), e un terzo gruppo controllo che ha seguito la dieta abituale (27).I risultati hanno mostrato che, l’olio di oliva più ricco in polifenoli riduce l’espressione di geniaterosclerosi-correlati implicati nel processo infiammatorio, nello stress ossidativo e nel danno alDNA in cellule mononucleate di sangue periferico.Studi epidemiologici, studi di intervento e risultati biochimici e metabolici, forniscono proveconvincenti dell’esistenza di benefici cardiovascolari dell’olio di oliva, soprattutto quando siverificano effetti sinergici tra i nutrienti.L’olio di oliva, nel suo complesso, può essere considerato un alimento funzionale, con effettiprotettivi nei confronti dei fattori di rischio cardiovascolare, come stress ossidativo, LDLcolesterolo, ipertensione, diabete.35
  36. 36. Inoltre, i polifenoli dell’olio d’oliva modulano direttamente la risposta della parete vascolare agliinsulti pro-aterogeni inibendo l’espressione di geni implicati nell’attivazione endoteliale emonocitica.Queste componenti agirebbero direttamente sulla superficie vascolare riducendo l’espressione dimolecole di adesione e la successiva interazione con i monociti, e contribuirebbe anche alla stabilitàdella placca attraverso una riduzione del rilascio di metalloproteinasi.Questi risultati mostrano come i nutrienti, e in particolare l’olio extravergine di oliva, possonoinfluenzare l’espressione genica (28).Il consumo di cibi ricchi di fenoli, come frutta e verdura, sono importanti strategie per laprevenzione della malattia cardiovascolare, in aggiunta all’uso di strategie farmacologiche.36
  37. 37. BIBLIOGRAFIA1. Saini HK, Xu YJ, Arneja AS, Tappia PS, Dhalla NS. Pharmacological basis of different targetsfor the treatment of atherosclerosis. J Cell Mol Med. 2005; 9(4): 818-39.2. Keys A. Mediterranean diet and public health: personal reflections. Am J Clin Nutr. 1995; 61(6Suppl): 1321S-3S.3. Keys A. Coronary heart disease in seven countries. 1970. Nutrition. 1997; 13(3): 250-2;discussion 49, 3.4. Nestle M. Mediterranean diets: historical and research overview. Am J Clin Nutr. 1995; 61(6Suppl): 1313S-20S.5. Keys A. Coronary heart disease in seven countries. Circulation. 1970; 41(1): 1-211.6. Trichopoulou A, Costacou T, Bamia C, Trichopoulos D. Adherence to a Mediterranean diet andsurvival in a Greek population. N Engl J Med. 2003; 348(26): 2599-608.7. Estruch R, Martinez-Gonzalez MA, Corella D, Salas-Salvado J, Ruiz-Gutierrez V, Covas MI, etal. Effects of a Mediterranean-style diet on cardiovascular risk factors: a randomized trial. AnnIntern Med. 2006; 145(1): 1-11.8. Krauss RM, Eckel RH, Howard B, Appel LJ, Daniels SR, Deckelbaum RJ, et al. AHA DietaryGuidelines: revision 2000: A statement for healthcare professionals from the NutritionCommittee of the American Heart Association. Circulation. 2000; 102(18): 2284-99.9. Urpi-Sarda M, Casas R, Chiva-Blanch G, Romero-Mamani ES, Valderas-Martinez P, Salas-Salvado J, et al. The Mediterranean diet pattern and its main components are associated withlower plasma concentrations of tumor necrosis factor receptor 60 in patients at high risk forcardiovascular disease. J Nutr. 2012; 142(6): 1019-25.37
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  41. 41. pregi e difetti dell’olio extravergine di olivaLanalisi sensoriale valuta le caratteristiche di un prodotto alimentare grazie ai nostri organi disenso. Essa sfrutta la capacità degli organi sensoriali di reagire a stimoli di origine chimica,chimico-fisica e fisica. I quattro gusti fondamentali sono lamaro, il dolce, il salato e lacido, lacombinazione di questi gusti base ci danno le infinite sfaccettature gustative.La punta della lingua ricca di papille fungiformi è maggiormente stimolata dalle sostanze "dolci";ai suoi lati prevalgono le papille filiformi che percepiscono in maniera preponderante lesensazioni di "salato"; dietro queste, le papille foliate prediligono l’aspro", mentre la base dellalingua ricca di papille circumvallate reagisce maggiormente in presenza di sostanze "amare".L’olfatto svolge una funzione importantissima nell’individuazione dei difetti, e viene utilizzatonon per via diretta, tramite l’inalazione dei profumi dell’olio, ma soprattutto per via retronasaledurante l’assaggio.Il gradimento edonistico di un olio extra vergine di oliva dipende dalle sue caratteristichesensoriali. La preferenza sensoriale di un olio è legata a caratteristiche o attributi ritenuti positividi aspetto, di aroma, di sapore e di “flavor” (inteso come la sensazione che coinvolge gusto eolfatto).Nella valutazione organolettica degli oli di oliva il senso del gusto viene utilizzato solo perlaccertamento della nota amara, attivando le papille gustative presenti nel fondo della lingua. Lezone sensibili al salato e al dolce non vengono stimolate perché nellolio non sono presenti sali ezuccheri. La sensazione di dolce che viene indicata dagli assaggiatori in realtà è dovutaallassenza assoluta di amaro. Anche la zona sensibile allacido non viene attivata perché gli acidiliberi contenuti nellolio hanno un peso molecolare troppo elevato.La qualità degli oli dipende dalla varietà delle olive, dal grado di maturazione delle olive, dalterreno, dalle tecniche agronomiche, dall’ irrorazione e dai metodi di raccolta. Dipende anche dai41
  42. 42. modi e dai tempi di conservazione delle olive prima della lavorazione, dai sistemi di estrazione,dalla modalità di stoccaggio delle olive e dalla conservazione degli oli.La qualità riconosciuta agli oli extravergini è la risultante di due diversi ordini di indagine: da unaparte, le analisi chimico-fisiche, intese ad accertare la reale composizione in termini percentualidella materia grassa ed il suo grado di acidità; dallaltra, lesame organolettico, che giudica loliodal punto di vista delle sue caratteristiche visive, olfattive, e di gusto e ne valuta pregi e difetti.Le principali caratteristiche organolettiche dellolio riguardano il colore (che si riconosce con lavista), lolfatto e il gusto-olfatto. Se l’olio deriva da olive immature avrà sfumature sul verde, daolive mature sfumature sull’oro, da olive molto mature sfumature oro pallido. Questecaratteristiche dipendono dai composti naturalmente presenti nel frutto e dai composti che siformano per attivazione di processi di alterazione dellolio.Responsabili del colore sono le clorofille ed i caroteni. Le prime conferiscono il colore verde,mentre i caroteni fanno assumere una colorazione giallo-arancio; i responsabili dell’olfatto sono ivolatili, cioè alcoli alifatici, alcoli triterpenici e diterpenici ed esteri. I responsabili del gusto sonotutti gli acidi grassi ed i polifenoli.NellAllegato XII "Valutazione organolettica dellolio di oliva vergine" del regolamento C.E.E. n,2568/91 si stabilisce che un olio deve essere sottoposto allassaggio per determinarne, mediantepunteggio detto "punteggio organolettico", la categoria merceologica di appartenenza. Questavalutazione viene fatta da un gruppo di assaggiatori selezionati, istruiti ed allenati, seguendo unaspecifica metodologia analitica standardizzata (Panel Test, Fig 1).42
  43. 43. Fig.1 Panel TestPanel test è un termine inglese che significa “gruppo di persone che si riuniscono per esprimereun giudizio”. Lindagine statistica sulle soglie personali di percezione ha permesso di accertareche gruppi di 10 persone, scelte a caso in una popolazione, presentano una soglia media di gruppoche è ripetitiva, cioè analoga a quella di un altro gruppo di altre 10 persone della stessapopolazione; ossia gruppi di 10 individui, presentano una soglia media di gruppo che può essereritenuta rappresentativa della soglia dellintera popolazione e, pertanto, tale gruppo può essereutilizzato come uno strumento di misura che dia risultati validi per tutta la popolazione.Lanalisi sensoriale o organolettica dellolio doliva ha unimportanza rilevante nel giudizio dellaqualità finale del prodotto. Infatti, un olio che non sia accettabile da un punto di vistaorganolettico, può essere declassato.Le analisi sono svolte presso i laboratori della Camera di commercio e di altri Enti, oppure, se ilproduttore dolio commercia ingenti quantità, in commissioni interne allazienda stessa. Lecommissioni sono formate da un capo panel e da un minimo di otto ad un massimo di dodiciassaggiatori per minimizzare lerrore; lassaggio è svolto in cabine separate affinchè gliassaggiatori non si influenzino tra loro.Il Panel Test si svolge in modo che gli assaggiatori esprimano il loro giudizio sulle caratteristichesensoriali dell’olio indipendentemente l’uno dall’altro. Il capo panel deve possedere una solidaformazione ed essere un esperto nei vari tipi di olio; è inoltre responsabile della sua43
  44. 44. organizzazione, del funzionamento, della preparazione, della codificazione e della presentazionedei campioni agli assaggiatori, nonché del compendio dei dati e del loro trattamento statistico. Ilcapo panel seleziona gli assaggiatori e provvede al loro addestramento e al controllo del lorooperato, in modo da garantire il mantenimento di un adeguato livello attitudinale. Gliassaggiatori, per le prove organolettiche dellolio di oliva, devono essere prescelti e addestrati infunzione della loro abilità a distinguere tra campioni simili, in conformità con la guida delconsiglio oleicolo internazionale per la selezione, laddestramento ed il controllo degliassaggiatori qualificati di olio di oliva vergine. Gli assaggiatori di un Panel devono seguire uncorso di idoneità fisiologica all’assaggio guidato da un Capo Panel con un preciso estandardizzato esame. Gli assaggiatori idonei devono seguire un corso di 20 sedute di assaggio altermine delle quali è possibile iscriversi negli appositi Albi Regionali. Al termine dellassaggio ilcapo panel si occuperà di effettuare una media tra i voti dati dai vari assaggiatori in un foglio diprofilo , scartando quelli che siano eccessivamente incongruenti con gli altri (Fig 2).Fig. 2 foglio di profilo attuale fornito agli assaggiatori nel valutare le caratteristicheorganolettiche dell’olio.Ogni assaggiatore facente parte del panel deve odorare, poi assaggiare lolio sottoposto ad esame,44
  45. 45. contenuto nel bicchiere di assaggio, per analizzarne le percezioni olfattive e gustative; deve poiappuntare nel foglio di profilo a sua disposizione lintensità alla quale percepisce ciascuno degliattributi negativi e positivi (Fig. 2). Le intensità di percezione sia dei difetti positivi che negativivengono misurate con un righello ed espresse in centimetri (da 0 a 10 cm) (Fig. 2). Il giudiziofinale è dato dalla mediana dei risultati e viene rappresentato graficamente come ad esempio nelcaso riportato nella figura (Fig. 3).Fig. 3 Rappresentazione grafica dei risultati riportati nel foglio di profiloColui che analizza non deve essere a conoscenza né della provenienza né del produttore, perevitare favoreggiamenti, non deve avere mal di testa, raffreddore, non deve fumare né bere caffè,non deve né mangiare né masticare caramelle, poiché questi potrebbero variare il giudiziogustativo del campione.Nel caso in cui fossero percepiti attributi negativi non enumerati, questi devono essere indicatialla voce "altri" impiegando il o i termini che li descrivono con la maggior precisione possibile.Fondamentale nell’analisi sensoriale è l’addestramento dell’assaggiatore a riconoscere i pregi ed idifetti di un olio.Le caratteristiche costruttive della cabina di assaggio sono dettagliatamente spiegate neldocumento COI/T.20/Doc. n°6/Rev.1 del 18 giugno 1987 cui rimanda l’allegato XII del45
  46. 46. Regolamento CE 2568/91. Si specifica, inoltre, che l’ambiente dovrà essere gradevole, isolato dafonti di rumore o di inquinamento odoroso, mantenuto a temperatura (20-22°C) ed umidità (60-70% ) ideali.Ogni degustatore dispone di un tavolo di colore bianco, di una sedia, di una sputacchiera conmateriale assorbente di fondo, e di una scheda dove riporterà le sue impressioni. I bicchieridevono essere di vetro scuro in modo da impedire la valutazione visiva del colore. Il colore più omeno giallo e/o verde dell’olio, infatti, non è collegato direttamente alla sua qualità e perciòpotrebbe distrarre l’assaggiatore nell’analisi.Il diametro del bicchiere è maggiore alla base e si restringe nella parte superiore per favorire laconcentrazione degli aromi verso il naso.Al momento della presentazione in cabina, il bicchiere deve contenere 15 ml di olio ed esserecoperto da un vetro di orologio che eviti la dispersione dei composti volatili, dal momento cheil campione di olio viene scaldato alla temperatura di 28° C per favorire la volatilizzazione deicomposti aromatici.L’insieme delle diverse percezioni sensoriali consente di formulare il giudizio finale che dovràtenere conto anche dell’ armonia complessiva delle sensazioni provate.Alla fine del test di valutazione, ciascun assaggiatore compila la relativa scheda, esprime ungiudizio sulla presenza e sull’intensità dei pregi (fruttato, amaro, piccante) e degli eventuali difetti(rancido, muffa, riscaldo, avvinato, metallico, ecc, vedi sotto riportati).Qualche anno fa l’analisi organolettica si effettuava mediante tabella di valutazione in cui aciascuna voce si doveva attribuire un punteggio (Fig. 4). Alla fine dell’analisi il Capo Panelfaceva la media aritmetica, stabilendo il punteggio ottenuto.46
  47. 47. Fig. 4 Tabella precedente di valutazione della qualità degli oli.Questa scheda, denominata scheda numerica o strutturata, è oggi utilizzata solo per i concorsidegli oli e per le certificazioni DOP. Il Reg. 796/2002 ha invece introdotto nella valutazioneorganolettica degli oli di oliva lo strumento statistico della mediana (Fig. 2).La classificazione dellolio avviene confrontando il valore della mediana dei difetti e dellamediana del fruttato con gli intervalli di riferimento. Poiché i limiti di questi intervalli sono statistabiliti tenendo conto dellerrore del metodo, sono considerati assoluti. Quindi la scheda per laclassificazione degli oli vergine è cambiata, in quanto attualmente si utilizza un’altra schedachiamata Foglio di profilo (istituita appunto con il Regolamento 796/2002) in cui non compaionopiù i punteggi, ma ciascun descrittore di pregi o dei difetti è affiancato a un segmento lungo 10cm non graduato in cui l’assaggiatore mette una crocetta in corrispondenza dell’intensitàpercepita (Fig. 2).Essa presenta 6 diciture per i difetti, oltre ad una voce con la dicitura “Altri” in cui è possibileinserire uno dei difetti non elencati nella scheda ma codificati dal regolamento.Per quanto riguarda i pregi è molto più semplice in quanto compaiono solo tre diciture: fruttato,amaro,piccante.In genere le operazioni effettuate durante l’assaggio di un olio sono le seguenti:47
  48. 48. 1. Versare lolio in un apposito bicchierino di vetro scuro (il regolamento stabilisce una quantitàpari a circa 15 ml). Il campione va mantenuto a 28°C in modo da percepire al meglio lecaratteristiche organolettiche. Il bicchiere durante il riscaldamento e prima dell’assaggio vamantenuto coperto con l’apposito coperchietto (in vetro o altro materiale neutro).2. Annusare il campione cercando di captare tutte le sensazioni gradevoli o sgradevoli;3. Assumere lolio aspirando dellaria con una suzione prima lenta e delicata, poi più vigorosa, inmodo da vaporizzarlo nel cavo orale, portandolo a diretto contatto con le papille gustative;4. Fare riposare un poco la bocca, muovendo lentamente la lingua contro il palato;5. Riaspirare con la lingua contro il palato e labbra semi-aperte;6. Espellere lolio.Lassaggio tecnico deve essere effettuato seguendo alcune norme generali di comportamento:a) Non fumare almeno 30 minuti prima dellassaggiob) Non usare alcun profumo, sapone o cosmetico il cui odore persista al momento della provac) Non ingerire alcun altro alimento, almeno unora prima dellassaggiod) Accertarsi che le condizioni psico-fisiche dell’assaggiatore siano positive, tali da noncompromettere lanalisi.Normalmente le ore ottimali per le prove sono considerate quelle del mattino e comunque quelleprecedenti i pasti. Se gli assaggi sono molteplici, devono essere distanziati da un intervallo dialmeno 15 minuti. Per pulire la bocca è raccomandato l’uso di un pezzettino di mela: una voltamasticato dovrà essere sputato. Si deve poi procedere ad un risciacquo con acqua pura atemperatura ambiente.La valutazione prevede un esame olfattivo secondo il quale l’assaggiatore prende il bicchierecoperto, lo inclina e lo rigira per bagnare il più possibile la superficie interna del bicchiere;dopodiché odora il campione con inspirazioni lente e intense cercando di captare tutte lesensazioni gradevoli o sgradevoli per un tempo che non deve eccedere i 30 secondi. Un esame48
  49. 49. gustativo: il regolamento indirizza l’assaggiatore a considerare il cosiddetto ‘flavor’, cioè lasensazione congiunta olfattiva – gustativa - tattile.L’assaggiatore assume lolio (circa 3 ml) aspirando dellaria con una suzione prima lenta edelicata, poi più vigorosa, in modo da vaporizzarlo in tutto il cavo orale, portandolo a direttocontatto con le papille gustative e percependo per via retronasale anche le componenti volatiliaromatiche.Nell’ordine concentra l’attenzione sugli stimoli amaro e piccante (l’amaro potrebbe essereoccultato dal piccante), tenendo conto anche delle sensazioni tattili (fluidità e pastosità), diprurigine o bruciore o astringenza. Al termine espelle il campione.Il colore dell’olio non è determinante nel giudizio organolettico. Tuttavia è un parametroimportante nella tipicità degli oli (ad esempio è codificato in certi disciplinari D.O.P.) e puòvariare dal giallo paglierino al verdognolo e al verde intenso.Colorazioni più grigiastre, rossicce, rosse, brunastre indicano invece scarsa consistenza edenotano difetti dovuti ad ossidazione o alterazione chimica da raggi infrarossi o ultravioletti.Un colore verde intenso indica che l’olio è ricco in clorofilla e può venire da olive acerbe, damacinazione eccessiva delle bucce o da centrifugazione spinta.La fluidità può essere assunta come indice di tipicità dell’olio. E’ legata alla densità del prodotto,che dipende principalmente dalla composizione più o meno ricca in acidi grassi saturi, o viceversain acidi grassi poliinsaturi.La limpidezza deriva da un’ottima decantazione o da filtraggio. Una leggera velatura opalescenteè caratteristica degli oli nuovi non filtrati, o può essere dovuta anche a temperature troppo basse(già a partire dai 16°C iniziano a formarsi in sospensione dei cristalli di stearina).Il fruttato è l’insieme delle sensazioni olfattive caratteristiche dellolio ottenuto da frutti sani efreschi, verdi o maturi, percepite per via diretta e/o retronasale. Lattributo fruttato si definisceverde quando le sensazioni olfattive ricordano quelle dei frutti verdi, caratteristiche dellolio49
  50. 50. ottenuto da frutti verdi. Lattributo fruttato si definisce maturo quando le sensazioni olfattivericordano quelle dei frutti maturi, caratteristiche dellolio ottenuto da frutti verdi e da frutti maturi.Si definisce fruttato un olio che ha sapore e aromi simili a quelli delloliva matura; sebbeneappena prodotti tutti gli oli appaiano fruttati, in molti casi questa caratteristica è destinata ascomparire dopo pochi mesi. Autenticamente fruttato è invece quello che mantiene questo aromainalterato nel tempo. Il fruttato può essere tenue, di media intensità o intenso.L’amaro è il sapore elementare caratteristico dellolio ottenuto da olive verdi o invaiate. L’intensità di questo attributo dipende molto dal grado di maturazione delle olive. Oli estratti daolive verdi saranno ricchi di fenoli e quindi molto amari, oli estratti da olive mature sarannopoveri di fenoli.Il piccante è la sensazione pungente caratteristica di oli prodotti allinizio della campagna,principalmente da olive ancora verdi, che può essere percepita in tutta la cavità boccale, inparticolare in gola. Il carciofo è un sapore che ricorda quello del carciofo crudo assai gradevole efresco. Si dice verde un olio giovane, fresco, fruttato, leggermente erbaceo. Tutti questi sonoattributi positivi di un olio.In diversi passaggi del ciclo produttivo dell’olio si può incorrere in eventi che determinano unpeggioramento della qualità con l’insorgere di alterazioni che si riscontrano all’assaggio comesensazioni sgradevoli o difetti.Difetti che si generano nell’olio durante la produzione delle olive sono il secco, il gelato, il verme.Il difetto e inevitabile nelle annate siccitose in quanto si viene ad avere la predominanza delnocciolo sulla polpa. Il difetto di “secco” è avvertibile al gusto con la sensazione di legno e di“astringenza” e deriva da olive siccitose. Il difetto di “gelato” si verifica quando si portano amolire le olive che hanno subito una gelatura.Gli oli con difetto di “gelato” il più delle volte presentano anche il “secco” poiché, in effetti,avviene anche una disidratazione della drupa. E’ evidente che per evitare questo difetto bisogna50
  51. 51. raccogliere le olive prima di gelate o nevicate.Il difetto di “verme” si genera quando le olive molite sono fortemente attaccate dalla moscaolearia. Difetti che si generano durante la lavorazione delle olive sono il riscaldo, l’avvinato,la muffa e il metallico.Il difetto di “riscaldo” si può generare a seguito di uno stoccaggio errato/prolungato delle olive;una pratica diffusa che può generare questo difetto è quello di portare le olive nei frantoi in sacchidi plastica. Le olive come tutti i frutti, continuano il loro metabolismo anche dopo la raccolta,quindi, stoccarle in recipienti che non consentono la traspirazione (sacchi di plastica o grossimucchi) fa sì che si verifichi un riscaldamento della massa che porta al difetto suddetto. Questodifetto, avvertibile sia con l’olfatto sia al gusto, si può evitare mediante l’uso di cassette forate.Il difetto di “avvinato” è l’evoluzione naturale del “riscaldo”, poiché, nelle condizioni di elevataumidità e in assenza di ossigeno, gli zuccheri presenti nelle olive fermentano, dando origineall’acido acetico (aceto) che, diluendosi nell’olio, conferisce ad esso il caratteristico odore/saporedi aceto.La muffa è il difetto dovuto all’errato e prolungato stoccaggio delle olive. Si verifica in presenzadi elevata temperatura e umidità che comporta, nel giro di 4-5 giorni, l’inizio dello sviluppo dellemuffe che conferiscono all’olio il caratteristico odore/sapore di “chiuso” .Il “metallico” , invece, lo possiamo considerare un difetto minore, in quanto lo si riscontra conpiù difficoltà. Questo difetto è dovuto all’uso di nuovi macchinari poco puliti e sgrassati. Oppuresi può generare a seguito di un prolungato stoccaggio dell’olio in contenitori di latta in bandastagnata, come quelli che si usano generalmente per il trasporto dell’olio.Vi sono poi difetti che si generano nell’olio durante la conservazione: la morchia e il rancido.Il difetto di morchia si genera a seguito di prolungato stoccaggio dell’olio sui fanghi di deposito,costituiti da residui di polpa e acqua di vegetazione. Per evitare questo difetto bisogna avere labuona abitudine di travasare l’olio.51
  52. 52. Il difetto di rancido, invece, dall’odore/sapore inconfondibile, è quello che deriva dall’ossidazionedei grassi e ci indica indirettamente l’età di un olio.Questo difetto infatti si genera quando si esaurisce l’effetto protettivo degli antiossidanti,naturalmente presenti nell’olio (polifenoli, tocoferoli, etc..).I difetti citati sono solo quelli che si riscontrano con più facilità . Ve ne sono altri che si verificanosolo di rado, come il difetto di “ terra”, “ foglia” , “ fiscolo” , etc., ad ogni modo sempre da evitarese vogliamo che il nostro olio sia classificato extravergine.Gli olii, ai sensi del Reg. CE 1513/01 in vigore dal 1 Novembre 2003, sono classificati in:a) olio extra vergine di oliva: la mediana dei difetti è pari a 0 e la mediana del fruttato è superiorea 0; è olio di oliva vergine la cui acidità libera, espressa in acido oleico, è uguale o inferiore allo0,8%;b) olio di oliva vergine: la mediana dei difetti è superiore a 0 e inferiore o pari a 2,5 e la medianadel fruttato è superiore a 0; olio di oliva vergine la cui acidità libera, espressa in acido oleico, nonsupera il 2 %;c) olio di oliva vergine corrente: olio di oliva vergine il cui punteggio organolettico è uguale osuperiore a 3.5, la cui acidità libera espressa in acido oleico è al massimo di 3,3%;d) olio di oliva lampante: la mediana dei difetti è superiore a 3,5 ; oppure la mediana dei difetti èinferiore o pari a 3,5 e la mediana del fruttato è pari a 0; olio di oliva vergine la cui aciditàespressa in acido oleico è superiore a 2% (solo per raffineria).Non sono oli di oliva vergini:a) olio di oliva raffinato: olio di oliva ottenuto dalla raffinazione di oli di oliva vergini, la cuiacidità libera espressa in acido oleico non può eccedere 0,3%;b) olio di oliva composto da oli di oliva raffinati e oli di oliva vergini: olio di oliva ottenuto da untaglio di olio di oliva raffinato e oli doliva vergini diversi dallolio lampante, la cui acidità liberaespressa in acido oleico non può eccedere 1%;52
  53. 53. c) olio di sansa di oliva greggio: olio ottenuto dalla sansa delle olive mediante estrazione consolventi o processi fisici;d) olio di sansa di oliva raffinato: olio ottenuto dalla raffinazione di olio di sansa di oliva greggio,con un tenore di acidità libera, espressa in acido oleico, non superiore a 0,3%;e) olio di sansa di oliva: olio ottenuto da un taglio di olio di sansa doliva raffinato e di oli di olivavergini diversi dallolio lampante, con un tenore di acidità libera, espressa in acido oleico, nonsuperiore a 1%.Se lolio di oliva preso in esame rispetta i parametri chimico-fisici, i relativi limiti analitici, erispetta anche il punteggio della valutazione organolettica previsti dal Regolamento CEE n.2568/91, ovvero mediana del fruttato >0 e mediana del difetto = 0, può essere etichettato comeextravergine di oliva. Altrimenti verrà declassato in olio vergine o addirittura in olio di olivalampante.Un olio di buona qualità è caratterizzato quindi dall’aroma di “fruttato di oliva”, un odore fresco egradevole che ricorda l’oliva, l’erba appena falciata ed eventuali note di foglia di pomodoro, dicarciofo, di altri vegetali, di frutti quale la mela verde o i frutti di bosco. Assaggiandolo, poi, dàuna leggera sensazione gustativa amara e/o piccante.Queste sensazioni sono dovute alla presenza di composti fenolici naturali, antiossidanti cheproteggono l’olio durante la conservazione. Tali antiossidanti svolgono una importantissimaazione anche in “vivo”, proteggendo le nostre cellule dall’invecchiamento e dallo “stressossidativo” (bloccano i radicali liberi). L’amaro-piccante (“olio che pizzica in gola”), quando noneccessivo, è quindi un importante pregio dell’olio.Un olio di cattiva qualità presenta, invece, odori sgradevoli (“difetti”). Uno dei più comuni difettidell’olio è quello di “rancido” dovuto alla ossidazione per effetto dell’aria. L’olio rancido presentaun sentore che ricorda la noce, il grasso di prosciutto ingiallito, fino ad un odore di vernice ed èmolto frequente negli oli vecchi e mal conservati.53
  54. 54. Tra i difetti di origine fermentativa, frequenti sono quelli di “avvinato - inacetito” (odore chericorda il vino o l’aceto) “di muffa” (odore che ricorda la muffa che si è sviluppata sulle olivemarce) o di “riscaldo” e “morchia” (odore che ricorda la salamoia ed i formaggi). Altri difettisono quelli di “terra” (odore che ricorda la terra bagnata), di “cotto”, di “acqua di vegetazione” edi “metallico”.Tutti questi odori possono essere memorizzati facilmente con la guida di unassaggiatore esperto. Al gusto, un olio vecchio o difettato evidenzia spesso un gusto piatto. Lamancanza assoluta dell’amaro e del piccante, collegata al difetto di rancido, è un chiaro indice delfatto che l’olio ha ormai subito un processo degradativo irreversibile ed ha perso le sue proprietà ela sua qualità.Procedure per la produzione dell’olio extravergine di olivaL’Italia possiede un importante patrimonio olivicolo poiché la sua posizione geografica hafavorito lo sviluppo di molte varietà di olivi, ognuna delle quali ha trovato l’ambiente ideale per54
  55. 55. fruttificare (1) e nessun altro paese possiede tante varietà autoctone di olivi (circa 538) (2).L’Italia detiene il primato di oli che hanno ricevuto il prestigioso riconoscimento da partedell’Unione Europea, in quanto ben 36 prodotti si possono fregiare del marchio DOP.La qualità dell’olio, che si ricava dalla lavorazione delle olive in frantoio, dipende dalla qualità edallo stato di maturazione delle olive, ma anche da altri fattori connessi con le operazioni diraccolta e di post-raccolta. Quando si parla di qualità dell’olio ci si riferisce alle caratteristichechimiche, chimico-fisiche e organolettiche che il prodotto possiede e che si stabilizzano nei valoristabiliti dalla normativa nazionale, comunitaria e internazionale.Per quanto riguarda l’olio vergine d’oliva, vige, per i paesi dell’Unione Europea, il Regolamento(CE) n.1513/2001 del Consiglio del 23 Luglio 2001 (3) che stabilisce: “Gli oli d’oliva vergini: glioli ottenuti dal frutto dell’olio soltanto mediante processi meccanici o altri processi fisici, incondizioni che non causano alterazioni dell’olio e che non hanno subito alcun trattamento diversodal lavaggio, dalla decantazione, dalla centrifugazione e dalla filtrazione, esclusi gli oli ottenutimediante solvente o con coaudiuvanti ad azione chimica o biochimica o con processi diriesterificazione a qualsiasi miscela con oli di altra natura”.Le olive maturano solitamente in ottobre, se di varietà precoce, o in dicembre e gennaio, se piùtardive. Il momento ottimale per la raccolta varia in base al tipo di olivo, oltre che alle condizioniclimatiche stagionali e alla tecnica colturale utilizzata. Si parla di maturazione fisiologica, checoincide con la pigmentazione nera o nera-violacea dell’epidermide.Durante la maturazione delloliva si ha un graduale aumento della percentuale di olio ed unaprogressiva diminuzione di acqua. È quindi importante che la raccolta avvenga direttamentedall’albero, al giusto punto di maturazione e con i metodi più idonei; inoltre è importantetrasportare le olive in giornata all’oleificio affinché siano poste rapidamente in lavorazione. Inrealtà non esiste un’indicazione assoluta dello stato ottimale di maturazione; esse si raccolgonoquando si ha una percentuale alta di frutti invaiati e minima di frutti verdi, senza aspettare che le55
  56. 56. olive cadano naturalmente poiché, in quel caso, fornirebbero oli con elevata acidità e con unprofilo sensoriale difettato. Quindi l’indice di invaiatura aiuta nella stima del migliore momentodi raccolta. È necessario rispettare l’integrità del frutto, il distacco dalla pianta può determinaretraumi e lesioni incidendo negativamente sulle caratteristiche organolettiche dell’olio.La raccolta può quindi avvenire manualmente o meccanicamente; il metodo migliore è scelto inbase all’ambiente in cui si opera, alle caratteristiche dell’oliveto e del suolo oltre che del cultivar.Le olive cadono spontaneamente sulle reti stese sul terreno staccandosi dallalbero quando sonoeccessivamente mature, ciò determina un decadimento delle qualità organolettiche enutrizionali dellolio. Esso è formato da trigliceridi che, oltre un certo livello di maturazionedella polpa, vengono degradati dagli enzimi cellulari; si assiste così al distacco degli acidigrassi dal glicerolo e ad un conseguente aumento dellacidità libera. Quanto minore èl’acidità tanto migliore sarà l’olio. Quindi, la raccolta dopo caduta spontanea è un metodoeconomico ma non sempre consigliabile. I metodi più utilizzati per la raccolta delle olivesono la pettinatura e la scrollatura.Nella pettinatura, i rami degli alberi vengono pettinati con dei grossi rastrelli che staccano ledrupe, qualche foglia senza incidere sulla struttura arborea. Vengono posti dei teli sotto gli oliviper facilitare la raccolta delle olive cadute.La scrollatura viene fatta con dei bracci meccanici che avvolgono il fusto e i grossi rami dellolivopercuotendoli in modo blando e favorendo la caduta spontanea delle drupe. Questa tecnica nonincide troppo sulla struttura dellalbero, che subisce comunque uno stress importante.L’abbacchiatura è un metodo che veniva molto utilizzato in passato e che consiste nel percuotere irami degli alberi con delle grosse pertiche lesionando però i ramoscelli più giovani, a cui saràaffidata la fruttificazione nellanno successivo. Perciò viene danneggiata la produttivitàdelluliveto e le olive più mature possono rompersi nellimpatto con la pertica o con il terreno.Un metodo di raccolta ottimo è la brucatura a mano perché, raccogliendo le olive a mano, si56

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