4. Deaminasi Basa
Beberapa basa nukleotida penyusun
DNA dapat dihilangkan secara spontan
(alami) atau menggunakan bahan
kimia
Deaminasi basa DNA akan
menyebabkan mutasi gen karena ada
kesalahan pasangan DNA
Deaminasi adenin → hipoxantin
Deaminasi guanin → xantin
Deaminasi sitosin → urasil
6. Bahan Kimia Penyebab Deaminasi Basa
Hidroxilamin (NH2OH)
• Memodifikasi gugus C dengan
gugus hidroksil (OH), sehingga
akan berpasangan dengan A,
bukan dengan G
• Menyebabkan perubahan
pasangan GC-menjadi-AT
• In vitro (digunakan untuk
memutasi DNA murni atau virus)
• Tidak bisa memasuki sel
• Perbaikan DNA oleh enzim uracil-
N-glycosylase
7. Bahan Kimia Penyebab Deaminasi Basa
-)
Bisulfit (HSO3
• Deaminasi sitosin menjadi urasil (pH dan suhu tertentu)
• Biasanya terjadi pada untai tunggal DNA
• Digunakan untuk site-directed mutagenesis
• Basa C yang sudah dikonversi menjadi basa U akan terdeteksi sebagai basa T , sedangkan basa T yang
termetilasi akan terdeteksi sebagai basa C
8. Bahan Kimia Penyebab Deaminasi Basa
Asam Nitrat (HNO2)
• Menghilangkan gugus amino dari basa A dan G
• Menyebabkan perubahan maupun penghilangan dari
pasangan basa GC-menjadi-AT dan AT-menjadi-GC
• Bisa deaminasi basa G, C, dan A
(1) HNO2 deaminasi guanin untuk produksi xantin, yang memiliki kesamaan situs
pasangan basa dengan G. Tidak ada mutasi yang terjadi.
(2) HNO2 deaminasi sitosin untuk produksi urasil, yang menimbulkan transisi
ikatan CG-menjadi-TA.
(3) HNO2 deaminasi adenin untuk produksi hipoxantin, yang berpasangan dengan
sitosin, yang menimbulkan transisi ikatan AT-menjadi-GC.
10. Perbaikan DNA Akibat Deaminasi Basa
DNA glikosilase
• Memecah ikatan glikosil di
antara basa nukleotida dan
gula yang rusak
• Bekerja sesuai mekanisme
replikasi DNA
• Enzim AP endonuclease dapat
memotong posisi dekat basa
pirimidin (C/T) maupun purin
(A/G). Setelah memotong
bagian 3’OH, akan digunakan
sebagai primer kemudian DNA
polimerase I akan sintesis DNA
baru dengan basa normal.
AP liase –
menghilangkan basa
dan memotong DNA
pada bagian 3’OH
AP endonuklease
– memotong
bagian gula 5’P
DNA yang hilang
12. Perbaikan DNA Akibat Deaminasi Basa
5-metilsitosin
• Metiltransferase (transfer gugus
metil setelah DNA disintesis)
• Fungsi: melindungi DNA dari
pemotongan enzim endonuclease
restriksi dan meregulasi ekspresi
gen pada organisme tingkat tinggi
• Kesalahan pasangan basa GT
akibat deaminasi dari 5-
metilsitosin tidak ditemukan pada
untai DNA yang baru
5’CCWGG3’
3’GGWCC5’
AT/TA
5’CmCWGG3’
3’GGWCm Dcm C5’
13. Mekanisme 5-metilsitosin (very short-patch repair)
Vsr endonuklease (gen vsr) mengenali
kesalahan pasangan basa (GT)
Pengenalan Vsr endonuklease membentuk
celah (nick) pada untai tunggal DNA
Basa T dihilangkan dan DNA polimerase I
mensintesis untai DNA tersebut dengan
pasangan basa yang tepat (basa C)
• Hanya memperbaiki kesalahan pasangan basa GT
• Penggunaan perbaikan dengan cara Vsr terbatas, hanya terjadi apabila metilasi
tidak terjadi pada sekuens DNA tersebut
• Gen vsr terletak pada downstream dari Dcm metilase
15. Pendahuluan
• ROS (Reactive Oxygen Species) menggambarkan
adanya molekul reaktif dan radikal bebas yang
berasal dari molekul oksigen
• ROS sangat merugikan bagi organisme aerob
• ROS merupakan produk dalam transfer elektron
pada mitokondria
• Oksigen rentan pada pembentukan radikal ?
atom oksigen memiliki 2elektron yang tidak
berpasangan dalam suatu orbit yang terpisah
dari kulit elektron terluarnya
16. Pertahanan sel terhadap ROS
• Superoxide dismutase (SOD)
– First discovered ROS metabolizing enzyme
– Several metal containing SODs characterised (Cu, Mn & Zn)
• Catalase - Peroxidase
– Catalase Promote disportionation of H2O2
– Peroxidase use H2O2 to oxidize number of compounds
17. Mutasi akibat ROS & Protein Untuk Perbaikan
8-oxoG • 8-oxoG merupakan 7,8-dihydro-8-oxoguanine yang
teroksidasi
• 8-oxoG merupakan salah satu lesi yang paling
mutagenik
• Radikal bebas menyebabkan DNA termutasi spontan
karena DNA polimerase III mispair dengan adenin
• Untuk mengurangi mutasi spontan (efek mutagenik)
akan diproduksi enzim mutM, mutY, dan mutT
20. Alkilasi
• Penambahan gugus alkil (CH3, CH3CH2, dll) pada basa atau fosfat DNA.
• Gugus yang reaktif: N7 pada guanin, N3 pada adenin, O4 pada timin, O6 pada
guanin.
• Agen pengalkilasi:
– Etil Metanasulfonat (EMS, gas mustard nitrogen), Metil Metanasulfonat (MMS) dan N-metil-
N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG/MNNG).
– Reagen elektrofilik (contoh: cisplatin)
– Metil klorida, Metil urea (diproduksi alami)
23. Mekanisme Perbaikan: N-glikosilase Spesifik
• Mekanisme perbaikan N-glikosilase
spesifik
– Basa yang teralkilasi dibuang dengan N-glikosilase
spesifik
– Rantai DNA apurinik/apurimidinik
dipotong dengan endonuklease AP.
– DNA polimerase I meresintesis rantai DNA.
• Jenis N-glikosilase
• TagA (three methladenine gycosylase A)
menghilangkan basa 3-metiladenin dan
beberapa basa teretilasi dan termetilasi
terkait.
• AlkA, kurang spesifik, tidak hanya
menghilangkan 3-metiladenin dari DNA
juga menghilangkan basa teralkilasi lain
seperti 3-metilguanin dan 7-metilguanin.
24. Mekanisme Perbaikan: Metil Transferase
• Mekanisme:
– Mentransfer metil atau gugus alkil lain dari basa yang berubah dalam DNA ke
mereka sendiri.
– Setelah transfer, protein menjadi inaktif dan langsung didegradasi.
– Memperbaiki kerusakan pada O4 timin dan O6 guanin.
• Jenis metil transferase :
– Ada (alkil transferase I)
– Ogt (alkil transferase II)
25. Mekanisme Perbaikan: AlkB dan AidB
• Mekanisme perbaikan AlkB:
– Oksidasi gugus metil pada 1-metiladenin dan 3-metilsitosin ke
formaldehid, melepasnya dan menggantikan dengan basa
normal.
• Mekanisme perbaikan AidB belum diketahui. Diduga
mencegah kerusakan alkilasi dengan melindungi DNA dan
merusak agen pengalkilasi DNA yang akan mencapai DNA
target.
26. Mekanisme Perbaikan: Respon Adatif
• Produk gen-gen ini secara normal disintesis dalam jumlah sedikit,
tetapi mereka diproduksi dalam jumlah yang lebih besar jika sel
dipaparkan ke agen alkilasi.
• Respon adaptif gen berperan untuk resistensi agen pengalkilasi yang
mentransfer gugus metil ke DNA, sementara resistensi terhadap agen
pengalkilasi yang mentransfer gugus yang lebih panjang (seperti etil)
pada DNA lebih dikarenakan sistem perbaikan eksisi.
27. Regulasi Respon Adatif
• Gen yang merupakan bagian
dari respon adaptif: ada
(bagian dari operon
bersama alkB), aidB, alkA
dan alkB.
• Protein Ada (aktivator
transkripsi) memiliki dua
asam amino yang gugus
metilnya dapat dipindahkan,
yaitu sistein-321 (asam
amino ke-321 dari ujung N
terminal dan sistein-38
(asam amino ke-38 dari
ujung N terminal).
30. Sistem Perbaikan UV
-Ultraviolet (UV) radiation:
-Uncontrollable environmental factor
that alters DNA sequences
-Type of electromagnetic radiation that has a
shorter wavelength than that of the visible light.
-Three types of UV radiation:
- UV-A (400nm-315nm): found in black lights
- UV-B (315nm-280nm): most dangerous type
- UV-C (280nm-200nm): germicidal
32. Cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) dan 6-4
photoproducts(6-4 PPs)
-Lesi pada DNA disebabkan karena paparan UV
-Memungkinkan mengakibatkan terjadinya
kanker pada kulit
-Memicu apoptosis karena paparan UV (sel
kekurangan NER)
-Bisa menghambat replikasi dan transkripsi
-Namun tetap ada perbaikan DNA
33. Two major photoproducts account for nearly all of
the UV induced DNA damage are:
a) Cyclobutane pyrimidine dimer- 75% of the UV
induced damage. Formed by introducing 2 new
bonds between adjacent pyrimidines (C & T) on
the same DNA strand.
b) (6-4) photoproducts- Remaining of the UV
induced damage. Formed by introducing a bond
between the c-6 atom of one pyrimidine & the
c-4 atom of atoms of adjacent pyrimidine on the
same DNA strand.
Largely supplanted by oligonucleotide-directed and PCR mutagenesis as well as recombineering
Site-directed mutagenesis = mutasi yang diinginkan
Ada primer sbuatan yang akan menyebabkan mutasi.
Mutasi bisa terjadi: mutasi titik, perubahan beberapa basa, delesi, insersi.
Untai tunggal primer diperpanjang menggunakan DNApol.
Gen mengkode gen yang termutasi dan dikenalkan ke dalam sel iang sebagai vektor dan juga kloning.
Mutan yang terseleksi akan terlihat pada saat dilakukan DNA sekuensing.
The reaction in which sodium bisulfite catalyzes the deamination of
cytosine residues occurs in three steps.
The bisulfite ion first adds to the double bond of cytosine via a covalent linkage to C-6.
Results is 5,6-dihydrouracil 6-sulfonate.
Form uracil.
-- controlled by pH and temperature
AP – apurinic or apyrimidinic site
Ensuring that cells that inherit the gene to methylate the C in CmCWGG/GGWCmC also usually inherit the ability to repair the mismatch correctly if it is deaminated
mutM merupakan N-glikosilase spesifik yang menghilangkan basa 8-oxoG
mutM merupakan respon terhadap stress oksidatif
Untai yang didepurinisasi dipotong dengan enzim endinuklease AP, didegredai oleh exonuklease, resisntesis DNA oleh polimeraase I
mutY merupakan N-glikosilase spesifk untuk menghilangkan basa adenin yang berlawanan dengan 8-oxoG,
Memperbaiki C untuk mencegah mutasi
muT berfungsi mencagah 8-oxoG memasuki DNA
8-oxoG tidak hanya mengoksidasi guanin tapi juga dapat berinteraksi engan dGTP membentuk 8-oxoGTP
Mendegradasi 8-oxoGTP menjadi 8-oxoGMP hingga tidak terjadi sintesis DNA
Structures of DNA duplexes showing the presence of lesions (in green) such as CPD (a), 6-4PP (b), and 6-4 Dewar dimer (c). Hydrogen atoms are not shown, prepared from PDB entries 1TTD [24], 1CFL [25], and 1QKG [26] using PyMol. (version 1.1r1)
Photoreactivation: incidence of ultraviolet radiation (UVR) results in pyrimidine lesion (thymine dimer), which is recognized by a photoreactivating enzyme “photolyase”. The light energy (>380 nm) is trapped by the antenna molecules of photolyase (such as MTHF/8-HDF/FMN) and transfers them to catalytic cofactor FADH− which becomes excited and transfers energy to the pyrimidine dimer in the form of e−, splitting the CPD into two monomeric unit, and then electron is transferred back to the flavin molecule.
8-oxoG repair in E. coli and human cells. E. coli MutT, MutM, MutS, MutY, and Nei (Endo VIII) are involved in defending against the mutagenic effects of 8-oxoG lesions (structure is shown in the inset). The human functional homologs of MutT, MutM, MutY, MutS, and Nei are hMTH, hOGG1, hMYH, hMutS-alpha, and hNEIL1, respectively. The MutT/MTH protein hydrolyzes 8-oxo-dGTP (dGoTP) to 8-oxo-dGMP (dGoMP) and pyrophosphate (reaction 1). GO (Go) in DNA can be derived from oxidation of guanine or misincorporation of dGoTP during replication. The MutM/OGG1 glycosylase removes GO adducts while it is paired with cytosine (reactions 2, 4, and 7). Nei/NEIL1 can function as a backup for MutM/OGG1 to removes GO from GO/C. When C/GO is not repaired by MutM/OGG1, adenines are frequently incorporated opposite GO bases by DNA polymerase III or POLdelta/epsilon during DNA replication. A/GO mismatches are repaired to C/GO by the MutY/MYH-dependent or MutS/MutS-alpha-dependent pathway (reaction 3). When dGoTP is incorporated opposite adenine during DNA replication, MutY/MYH repair on GO/A can cause more mutation (reaction 5) while GO/A repair by MutS/MutS-alpha and Nei/NEIL1 can reduce mutation (reaction 6). This figure is adapted from Lu et al. (9) with permission from Humana Press Inc.
