1. Л~3?3¥-Г
На правах рукописи
ПОПОВА Виктория Викторовна
ВЛИЯНИЕ СЕЛЕНА И ЦИНКА НА РОСТ
SPIRVLINA PLATENSIS И ОПТИМИЗАЦИЯ
ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ
03.00.23 - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва -2004
лУи '
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

2. Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН
в Отделе молекулярных основ внутриклеточной регуляции и биотехнологии
фотоавтотрофных биосинтезов, г. Москва
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:
доктор биологических наук Пронина Наталия Александровна
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук,
профессор
доктор биологических наук,
профессор
Градова Нина Борисовна
Иванов Виктор Борисович
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова,
Биологический факультет, кафедра «Физиология микроорганизмов»
Защита состоится « в /О часов на заседании
диссертационного совета ДМ212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047,
Москва, Миусская пл., д.9) в tyfy3> .
С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ
имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «J y>^/w/>>£ 2004 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, у/M>z^e/^
ДМ212.204.13 и-
"«^Г— Шакир И.В.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследования последних лет показывают, что
обеспеченность жителей многих регионов России микроэлементами значительно
снижается (Скальный, 1999; Тутельян и др, 2002). Это обусловлено истощенностью
почв, вызванной неправильным ведением сельскохозяйственных работ, глобальным
изменением окружающей среды, а также ухудшением качества продуктов питания. В
то же время повысившийся уровень стресса в результате загрязнения окружающей
среды и особенностей стиля жизни современного человека увеличивает его
потребности в некоторых питательных компонентах. Другими словами, для
сохранения питательной ценности продуктов человечество встало перед
необходимостью их балансировки, в том числе с помощью биологически активных
добавок, полученных из натуральных растительных источников.
В последнее время в качестве таких источников используются
фотосинтезирующие одноклеточные организмы (Richmond, 1986; Borowitzka and
Borowitzka, 1988; Цоглин и Габель, 2000), среди которых наиболее перспективной,
следует считать цианобактерию Spirulina platensis. Во-первых, сравнительный анализ
биохимического состава микроводорослей показал преимущество S. platensis перед
многими фотосинтезирующими организмами (Трубачёв и др., 1976; Richmond, 1986).
Во-вторых, пластичность метаболизма микроводорослей позволяет управлять
качеством биомассы путем направленного изменения условий культивирования и
использовать их для транспорта в организм физиологически важных элементов в
биологически активной форме (Клячко-Гурвич, 1966; Семененко, 1985). И, в-третьих,
S. platensis является чрезвычайно устойчивой к воздействию стрессовых факторов и
способна накапливать микроэлементы в количествах, являющихся летальными для
других микроорганизмов (Упитие, 1983).
В настоящее время несомненный интерес представляют эссенциальные
микроэлементы селен и цинк, которые требуются для осуществления важнейших
физиологических процессов в организме человека. При дефиците этих
микроэлементов в организме возникают хронические заболевания желудочно-
кишечного тракта, дерматиты, анемия, карликовость, половое недоразвитие,
онкологические заболевания, катаракта и другие заболевания.
Цель и задачи исследования. В данной работе для нас представляло интерес
исследовать внутриклеточное накопление селена и цинка в клетках Spirulina platensis с
целью изучения устойчивости цианобактерии к этим элементам и поиска путей
оптимизации их накопления в органических соединениях для получения биомассы,
обогащенной данными микроэлементами.
г ~i
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

4. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучение влияния различных концентраций селена и пипка на рост S. platensis;
2. Исследование биохимического состава S. platensis при росте на
• модифицированных средах, обогащенных селеном и цинком;
3. Исследование способности клеток S. platensis накапливать селен и цинк;
4. Исследование включения селена и цинка в состав органических соединений
•--• клетки;
" 5. Оптимизация условий культивирования, позволяющих получить биомассу с
высоким содержанием микроэлементов.
Научная новизна. Определены оптимальные и предельно допустимые
концентрации Se(IV) при культивировании 5. platensis IPPAS В-256. Впервые
исследовано влияние Se(IV) на биохимический состав S. platensis. Впервые детально
изучена зависимость между внутриклеточным содержанием Se(IV) и его содержанием
в среде и показано, что клетки S. platensis не способны лимитировать накопление
селена вплоть до гибели культуры. Впервые показано, что высокие концентрации
Se(IV) вызывают значительное снижение цитоплазматического рН. Новыми являются
данные о зависимости накопления цинка от стадии культивирования, на которой
вносился элемент'. Впервые показано, что цинк может включаться в состав
лииофильпых соединений циапобактерии. Впервые показано различие в накоплении
ципка па свету и в темноте.
Научно-практическое значение. Полученные результаты ммут быть
применены в биотехнологии при производстве биологически активных добавок к пище
человека и животных, в парфюмерной промышленности для получения различных
косметических средств но уходу за кожей, в пищевой промышленности для обогащения
продуктов микроэлементами. Также полученные результаты могут быть использованы для
дальнейших исследований защитных механизмов цианобактериалыюй клетки на
воздействие повышенных концентраций тяжелых металлов и токсических элементов.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были
представлены: на конференции "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000;
1-ом Международном симпозиуме "Биотехнология - народному хозяйству", Москва, 2000;
конференции «Автотрофпые микроорганизмы», Москва, 2000; 1-ой и 2-ой
Международных конференциях «Актуальные проблемы инноваций с
нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов»,
Москва, 2001, 2003; Международной конференции «Достижения биотехнологии на
благо будущего человечества», Самарканд, Узбекистан, 2001; Международном
симпозиуме «Растения под влиянием стресса окружающей среды», Москва, 2001;
Международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология», Москва, 2001;
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

5. 5-ой Европейской конференции «Биотехнология микроводорослей», Потсдам, Германия,
2003; 5-ом Съезде Всероссийского Общества Физиологов Растений, 11еша, 2003.
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12
работ, включая патент РФ, в которых отражены основные положения диссертации.
Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор
литературы, Объекг и методы исследований, Результаты и обсуждение, Заключение,
Выводы, Список литературы. Работа изложена на 91 странице машинописного тсксга,
включает 14 рисунков и 4 таблицы, список литературы содержит 201 наименование.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВЛ11ИЙ
В качестве объекта исследовании использовалась одноклеточная
термофильная нитчатая цианобактерия Spirulina platensis (Nordst.) Gcitl. IPPAS B-256
из коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им. К.Л.
Тимирязева Российской Академии Наук (IPPAS).
Культивирование циапобактерии осуществляли на среде Заррука в
стерильных условиях при круглосуточном освещений (30 Вт/м2
), непрерывном
барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 1,7-2% СОг, при 33-35°С
(Семепенко, 1991). До внесения ипокулята в среду добавляли селенит натрия н количесгес
10 - 170 мгЛ£ Для изучения влияния серы на накопление селена культуру выращивали на
модифицированной среде Заррука, содержащей 10% K2SO4 or стандартной среды.
Сульфат, нитрат и хлорид цинка вводили в питательные среды либо до внесения посевного
инокулята, либо при выходе культуры на линейную фазу в концентрациях 10-40 мг/л.
Биохимические анализы проводили на линейной стадии роста в клеточной массе,
предварительно отмытой от культуральной среды. Образцы хранили при -20°С.
Содержание белка определяли по методу Lowry (Lowry ct al, 1951).
Содержание хлорофилла измеряли спектрофотомстричсски в мстанольпых
экстрактах (Сергеенко и др., 2000).
Содержание липофильных соединений оценивали весовым методом в
пробах, экстрагированных метанолом при 60°С (Клячко-Гурвич, 1966).
Содержание углеводов определяли фенол-серным методом (Юшчко-1 уриич, 1964).
Анализ аминокислотного состава белка проводили после гидролиза
биомассы в 6 N НО на автоматическом анализаторе аминокислот- AAA 339M
(«Microtcchna», Чехия) (Коиарев, 1973).
Состав фосфорсодержащих соединении клетки и цитоцлазматический рН
определяли с помощью спектроскопии 31
Р-ядерного магнитного резонанса (31
Р-ЯМР)
на MSL-200 («Broker», Германия) как описано (Пронина и ;tp., 2002). Систры снимали
при частоте электромагнитного излучения 81 МГц с числом сканирований 3 - 5 тыс.
Цитоплазматический рН определяли, используя зависимость химического слыша пика
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

6. неорганических фосфатов цитоплазмы от рН. Для построения стандартной кривой
использовали клеточный экстракт в 6 М НС104 согласно (Kichitsu et al., 1989).
Идентификация пиков резонансных сигналов проведена согласно (Roberts, 1984).
Разрушение клеток проводили в гомогенизаторе Retsch-MM2 (Германия) в
течение 10 мин при 90000 уд/мин с использованием стеклянных бус при соотношении
бусы/суспензия 1:1.
Фракционирование бесклеточного гомогената на фракции растворимых
белков и нерастворимых клеточных компонентов осуществляли центрифугированием
при 14000 об/мин, 30 мин при 4°С.
Липофильные соединения экстрагировали метанолом при 60°.
Хроматографический анализ белков проводили с использованием колоночной
хроматографии высоко давления на колонке 1,6x50 см. В качестве матрицы использовали
Syperosa-12 («Pharmacia», Швеция). Белок элюировали с колонки фосфатным буфером,
содержащим 0,05М КН2Р04,0,15М NaCl (рН 6,8), со скоростью 2 мл/мин.
Электрофоретическое разделение белков проводили в 15%
полиакриламидном геле (Остерман, 1981).
Содержание селена определяли в биомассе или выделенных из нее клеточных
фракциях с помощью индуктивно связанной плазмы масс-спектрометрии (ИСП-МС)
по изотопу 82
Se на автоматическом анализаторе HP 4500 Series ICP-MS («Hewlett
Packard», США) (Javis et. al., 1992), а также с помощью флуориметрического метода
определения комплексов селена с 2,3-диаминонафталином (Голубкина, 1995).
Содержание цинка в культуральной среде, а также в биомассе 5. platensis или
выделенных из нее фракциях, озоленных путем мокрого сжигания в смеси азотной и
хлорной кислот, определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре («Hitachi
270», Япония).
Статистическая обработка результатов. Для получения достоверных
результатов эксперименты проводили в 2-3-х биологических и не менее, чем в 3-х
аналитических повторностях. В результатах работы представлены средние данные и
относительные стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование роста S. platensis на средах, содержащих селенит-ионы.
Исследование роста цианобакгерии показало, что в присутствии 10-20 мг/л Na2SeOj ростовые
кривые почти полностью повторяли графическую характеристику контроля (рис. 1 А).
Внесение в среду культивирования 30 и 50 мг/л селенита натрия вызывало падение скорости
роста на линейной фазе и значительное снижение максимальной плотности суспешии при
выходе кривой накопления биомассы на плато.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

7. При повышении концентрации Na2SeOj до 100 мг/л (рис. 1 Б) наблюдали те же
закономерности роста на линейной фазе, более быстрый выход на стационарную фазу при
низком значении максимальной плотности суспензии. Концентрации селенита натрия 150 и
170 мг/л особенно сильно подавляли скорость роста культуры на линейной стадии. При этом
максимальная плотность суспензии клеток на стационарной фазе не достигала 1/4 от этого
значения в контроле. В присутствии 100 мг/л селенита натрия на 11-ый день
культивирования начинался лизис клеток, а при 150 и 170 мг/л на 6-ой день.
4 12 20 28
Время, дни
Рис. 1. Влияние селенита натрия на рост Spirulinaplatensis.
Концентрации Na2SeQi в среде (мг/л):
(А) - 0 (1-конгроль), 10 (2), 20 (3), 30 (4), 50 (5).
(Б) - 0 (1-контроль), 100 (2), 150 (3), 170 (4).
8 12
Время, дни
Следует отметить, что в присутствии 100-170 мг/л Na2SeOj уже в начале
линейной фазы культивирования в среде появлялся красный осадок, а сине-зеленые
клетки цианобактерии приобретали красноватый оттенок, что связано с появлением
элементарного селена Se(0) в среде и на поверхности клеток в результате
восстановления селенита натрия.
Таким образом, 5. platensis обладает чрезвычайно высокой устойчивостью к селену,
в отличие от большинства фсгпхшлезирующих микроорганизмов (Richmond, 1986).
Изменение биохимического состава биомассы S. platensis. выращенной в
присутствии Se(IY). При анализе состава биомассы S. platensis, полученной при
культивировании цианобактерии в присутствии 10 и 20 мг/л селенита натрия в среде
не отмечено достоверных изменений в содержании основных групп веществ в расчете
на единицу сухого веса (табл. 1). Эти данные говорят о том, что селен в этих
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

8. концентрациях не оказывал существенного влияния на сдвиг белкового, липидного и
углеводного обмена и, вероятно, легко метаболизировался. Последнее подтверждается
также тем, что селенит в этих концентрациях не оказывал ингибирующего эффекта на
рост (рис. 1 А). В то же время из табл. 1 видна сильная обратная зависимость между
концентрацией селенита натрия в среде и содержанием клеточного белка и ее прямая
связь с содержанием углеводов и липидов в биомассе, что наблюдается у
цианобактерий и микроводорослей и при других стрессовых условиях (Клячко-
Гурвич, 1966; Семененко, 1985).
Таблица 1. Влияние селенита натрия на биохимический состав S. platensis
Концентрация
Na2Se03,
мг/л
0
10
20
50
100
% от сухой массы
Белок
65+7
64±6
62±7
54+3
46+3
Хлорофилл
1,04±0,1
0,77±0,05
0,70±0,05
1,10+0,08
0,90+0,08
Углеводы
17+3
19±2
16±3
22+2
24+3
Лштиды
8±1
9±1
10±1
14+1
16+1
Относительно метаболизма селена у микроводорослей известно немного.
Показано, что он включается, главным образом, в свободные аминокислоты и белки.
Являясь химическим аналогом серы, селен замещает ее в цистеине и метионине с
образованием Se-аминокислот, которые принимают участие в синтезе белка наряду с
S-аминокислотами (Bottino et al, 1984; Vandermeulen and Foda, 1988). Исследование
аминокислотного состава белка в биомассе, полученной при выращивании культуры в
присутствии 20 мг/л Na2SeC>3, показало, что селенит не оказывает существенного влияния
на изменение содержания серусодержащих кислот - цистеина и метиоюша, в которые
селен может включаться с образованием селеноаминокислот.
Влияние селенита натрия на фосфорный обмен S. platensis и
внутриклеточный рН. Для более детального изучения процесса адаптации клеток к
различному составу культуральной среды был проведен сравнительный анализ 31
Р-
ЯМР спектров клеток S. platensis, выращенных в присутствии Se(IV) и без него. Как
видно из представленных спектров (рис. 2) наблюдался значительный химический
сдвиг неорганического ортофосфата (Pi) от 2,28 р т в контроле (спектр А) до 1,55 ррт
в опыте в присутствии 100 мг/л Na2Se03 (спектр В). Этот сдвиг соответствует
сильному подкислению цитоплазмы на 1 ед. рН (от 7,17 до 6,18), что, безусловно,
связано с подавлением роста культуры (см. рис. 1 Б). Снижение ростовых параметров
в присутствии 100 мг/л Na2Se03 коррелирует также с падением сигналов фосфорных
эфиров Сахаров (пики 3-5 ррт), что указывает на ингибирование фотосинтеза. При
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

9. +10 0 -10 -20
Химический сдвиг, ррт
-30
культивировании S. platensis в
присутствии 20 мг/л, когда не отмечалось
заметных изменений в росте (рис. 1А,
кривая 3) и биохимическом составе
биомассы (табл. 1), ЯМР. , спектры
совпадали с таковыми в контроле (рис. 2,
спектры А и Б).
Рис. 2. 3,
Р-ЯМР спектры (in vivo)
S. platensis, выращенной без (А), в
присутствии 20 (Б) и 100 (В) мг/л Na2Se03.
Число сканирований 4500 (А) и 3000 (Б, В).
Исследование динамики накопления селена в клетках 5. platensis. Анализ
внутриклеточного накопления селена при культивировании S. platensis на средах с
различным содержанием Na2SeC>3 (рис. 3)
позволил установить заметное повышение
внутриклеточной концентрации Se уже при
минимальной из исследованных концентраций
селенита натрия в среде. Содержание
внутриклеточного селена находилось в прямой
зависимости от концентрации селенита в среде,
что, в свою очередь, говорит о неспособности
клеток лимитировать его накопление вплоть до
летальных величин.
При снижении в среде культивирования
в 10 раз концентрации серы (с 1,0 до 0,1 г/л
K2S04) накопление селена у
10 20 30 40 50
Содержание Se в среде, мг/л
S. platensis Рис. 3. Зависимость количества связанного
, _ S. platensis атомарного селена от
значительно возрастало (табл. 2) в расчете как к о л и ч е С тва селена, введенного в среду
на сухую массу (вдвое), так и на белок (втрое), культивирования.
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

10. При этом основная доля селена включалась в белковую фракцию, поскольку его
содержание в белке и в суммарной биомассе в расчете на единицу сухой массы
практически совпадало.
Таблица 2. Влияние количества серы в среде на накопление селена клетками S. platensis
в присутствии 20 мг/л селенита натрия
Концентрация
S,
мг/л
300
30
Содержание
белка,
мг/г
0,60±0,05
0,28±0,03
Содержание Se
В биомассе
мг/г сухой
массы
О,155±О,О08
0,306+0,02
Во фракции белков
мг/г сухой
массы
0,147±0,01
0,25б±0,03
мг/г белка
0,280±0,02
0,914+0,07
В то же время из табл. 2 видно, что при дефиците серы содержание
суммарного белка в биомассе уменьшается в 2 раза, что, безусловно, снижает
суммарное обогащение биомассы селеном и указывает на изменение ее качественного
состава. Таким образом, увеличение отношения Se/S, вероятно, глубоко угнетает
синтез белка, хотя при этом и усиливает включение селена в серусодержащие
аминокислоты, позволяя в 3.3 раза обогатить селеном белок и только в 1.5 раза биомассу.
Влияние цинка на рост S. platensis.
Внесение в среду культивирования одновременно с инокулятом 2,2 мг/л цинка в
составе гп(Шз)г не изменяло ход графической кривой роста S. platensis (рис. 4 А, кривая 2).
Снижение продуктивности культуры наблюдалось по мере увеличения содержания цинка
от 4,4 до 8,8 мг/л. В концентрациях, выровненных по содержанию цинка, ZnS04 оказывал
сходный эффект на рост культуры (рис. 4 Б). Однако рост S. platensis ингибировался уже в
присутствии 4,8 мг/л цинка в составе ZnCl2 и не наблюдался при его концентрации в среде
9,6 мг/л (рис. 4 В).
Внесение до 4,4 мг/л цинка в составе Zn(N03)2 в начале линейной стадии вызывало
некоторое стимулирование роста (рис. 5, кривые 2,3). Однако в присутствии 8,8 мг/л цинка,
внесенного в начале линейной фазы, культура погибала (рис. 5), чего не наблюдалось при
внесении такого же количества этой соли в период лаг-фазы (рис. 4 А). Сравнение
ростовых кривых рис. 4 А и 5 показывает, что при внесении цинка на линейной стадии
порог чувствительности S. platensis к этому металлу снижается.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

11. Время, сутки
Рис. 4. Влияние цинка на рост S. platensis.
Количество внесенного цинка составляло (мг/л): (А) в составе Zn(NOj)2 — 0 (1, контроль), 2,2
(2), 4,4 (3), 6,6 (4), 8,8 (5); (Б) в составе ZnS04 - 0 (1, контроль), 2,3 (2), 4,6 (3), 6,8 (4), 9,1 (5);
(В) в составе ZnCb -0(1, контроль), 4,8 (2), 9,6 (3). Соли вносили вместе с инокулятом.
Рис. 5. Влияние цинка на рост S. platensis при
внесении ZnCNChh на линейной стадии роста.
Количество внесенного цинка составляло (мг/л):
0 (1, контроль), 2,2 (2), 4,4 (3), 6,6 (4), 8,8 (5).
3 5 7 9 11
Время, сутки
Изучение биохимического состава S. platensis. выращенной в присутствии
ионов цинка. Исследование биохимического состава S. platensis показало, что
содержание тотального белка в клетках уменьшалось по сравнению с контролем при
введении в среду культивирования нитрата цинка (табл. 3).
При увеличении концентрации цинка до 8,8 мг/л содержание общего белка в
клетках сокращалось втрое по сравнению с контролем. Такое подавление биосинтеза
И
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

12. белка, вероятно, связано со стрессовым воздействием тяжелого металла на клетку.
Анализируя кривые роста (рис. 4 А) мы видим также, что эта концентрация цинка
вызывает сильное ингибирование роста культуры.
Количественное определение хлорофилла показало, что его содержание в
клетках S. platensis практически не изменялось при концентрации цинка в среде от 2,2
до 6,6 мг/л (табл. 4). В присутствии 8,8 мг/л цинка в среде содержание хлорофилла в
клетках заметно возрастало.
Табл. 3. Содержание белка и хлорофилла в клетках S. platensis при культивировании на средах,
обогащенных цинком
Содержание, % от сух.
массы
Белок
Хлорофилл
Содержание цинка в среде, мг/л
0 (контроль)
61,4±5,2
3,73±0,20
2,2
51,5±4,3
3,45±0,15
4,4
45,8±3,8
3,65±0,22
6,6
47,7±3,2
3,94±0,25
8,8
17,8±1,2
4,96+0,31
Динамика накопления цинка клетками S. platensis. Динамика накопления
цинка зависела от стадии развития культуры, на которой микроэлемент вносился в
питательную среду. При внесении цинка в среду вместе с инокулятом в
концентрациях 2,2 - 4,4 мг/л внутриклеточное накопление цинка в расчете на единицу
сухой массы происходило постепенно и достигало максимума на 4-6 день
культивирования (рис. 6 А), что соответствовало приблизительно середине линейной
стадии роста (рис. 4 А). После чего происходил достаточно быстрый вынос металла из
клетки и к 8 суткам (начало стационарной стадии роста) концентрация цинка в клетке
была практически равна его внутриклеточной концентрации в начале эксперимента.
При внесении цинка на линейной стадии роста наблюдалась быстрая аккумуляция (в
течение 1 ч) тяжелого металла с последующим быстрым выносом металла обратно в
среду культивирования (рис. б Б). Возможно, эта разница в скорости аккумуляции
металла клетками связана с различным составом клеточной оболочки на разных
стадиях роста. Также, вероятно, что при длительной адаптации цианобактерии к
избытку цинка (рис. 6 А) этот тяжелый металл каким-то образом
компартментализнруется во внутриклеточных структурах, не оказывая влияния на
ростовые процессы, а затем постепенно выводиться из клетки на поздних этапах
культивирования. При внесении цинка во время активного роста (рис. б Б) клетка
создает барьеры для транспорта элемента внутрь клетки, сорбирует металл
клеточными оболочками и далее выносит металл в среду культивирования.
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

13. 2 4 6 8
Время, сутки
10 20 40 60
Время, час
Рис. б. Динамика накопления цинка клетками S.platensis.
Культуру выращивали в присутствии Zn(NC>3)2. Соль вносили вместе с инокулятом (А) и
на линейной стадии роста (Б) в концентрациях (мг/л): 2,2 (1), 4,4 (2).
5 10
Время, сутки
| 3
IО 1 -
20 40 60
Время, ч
Рис. 7. Изменение содержания цинка в клетках S.platensis (2) и в среде
культивирования (1).
Культуру выращивали в присутствии Zn(NC>3)2 (2,2 мг/л цинка). Соль вносили
одновременно с инокулятом (А) и на линейной стадии роста (Б).
Пунктиром отмечена (3) расчетная кривая, вычисленная по формуле:
^ "~ ^ внесенного цинка ~ S* в клетке ' ^ в среде)-
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

14. При расчете содержания внутриклеточного цинка на мл суспензии (рис. 7)
видна такая же динамика его изменения, как и при расчете на единицу сухой массы
(рис. 6). Остается неясным, почему суммарное содержание цинка в среде и клетке
ниже концентрации внесенного цинка (рис. 7 А). Эти потери, представленные
расчетной кривой 3, можно объяснить тем, что цинк хелатируется какими-то
прижизнеными выделениями цианобактерии, которые теряются при отмывке клеток
после их отделения от среды.
Изменение содержания цинка в среде культивирования является зеркальным
отражением его накопления в клетках, если цинк введен на линейной стадии роста
(рис. 7 Б). При этом увеличение содержания внутриклеточного цинка полностью
коррелирует со снижением содержания металла в среде, что свидетельствует о
прочной связи цинка в клетках цианобактерии.
Влияние света на внутриклеточное накопление цинка S. platensis. Как видно
из рис. 8, клетки S. platensis способны накапливать цинк как на свету, так и в темноте.
Но если на свету клетки накапливали цинк только в течение первого часа экспозиции и
далее постепенно выводили его в среду культивирования, то в темноте наблюдалось
практически постоянное накопление цинка в течение 48 ч.
Вероятно, на свету в активно
фотосинтезирующих клетках S. platensis
индуцируются металлорегуляторные системы
(Patzer and Hantke, 2000; Outten and
O'Halloran, 2001), ограничивающие
аккумуляцию цинка и активирующие вынос
тяжелого металла в среду культивирования.
Рис. 8. Влияние света на накопление цинка
клетками S. platensis.
Культуру выращивали в присутствии 2,2 мг/л
Zn(NOj)2. Соли вносили на линейной стадии роста.
После внесения цинка в питательные среды клетки
60 экспонировали на свету (1) и в темноте (2).20 40
Время, час
Адсорбция цинка сухой биомассой S. platensis. В мертвых клетках
максимальное количество цинка накапливалось уже в первые минуты после внесения
металла в среду, как результат формирования связей металла с клеточными
оболочками. Биосорбция тяжелых металлов «неживыми» клетками установлена также
другими авторами (Kuyucak and Volesky, 1990; Sag and Kutsal, 1996).
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

15. Металлсвязывающие соединения S. platensis. При разделении биомассы
S.platensis, обогащенной цинком, на фракции было показано, что около 70% цинка
содержится в составе суммарного клеточного белка, и около 30% цинка
обнаруживалось в составе липофильных соединений. При этом две трети от
тотального белка клетки включалось во фракцию растворимых белков. В 80-е годы из
растительных организмов были выделены специфические металлсвязывающие белки
металлотионеины и фитохелатины, которые активно синтезируются в организме под
влиянием высоких концентраций тяжелых металлов (Алексеева-Попова, 1991).
Наиболее хорошо изученными на сегодняшний день являются металлсвязывающие
белки, выделенные из ряда цианобактериальных штаммов с молекулярной массой в
пределах 3-15 кДа (Turner and Robinson, 1995; Blindauer et al, 2002).
При хроматографическом разделении фракции растворимых белков было
показано, что практически весь цинк включается в белки с молекулярными массами от
3 до 15 кДа (рис. 9).
I
2
X
о
1
0,5
I
1Л' '
2*103 14,0 1,8 0,2
Молекулярная масса, кДа
а
1*103
15,0 3,0 0,8
Молекулярная масса, кДа
3 8
• 2
Рис. 9. Хроматографическое разделение белков S. platensis.
Цианобактерию выращивали на стандартной среде Заррука (А) и на той же среде при
добавлении 4,4 мг/л цинка (Б). Пунктирная линия показывает относительное содержание
цинка в расчете на единицу беяка.
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

16. Па элсктрофорсграмме видно
несколько полос, соответствующих белкам с
молекулярными массами ниже 14 кДа (рис.
10). Можно предположить, что S. platensis
также обладает способностью синтезировать
белки, связывающие тяжелые металлы, что
повышает устойчивость циаиобактериальной
клетки к стрессовому воздействию тяжелых
металлов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, Spirulina platensis, в отличие от большинства фотосинтезирующих
микроорганизмов, проявляет высокую толерантность к селигу и цинку.
Механизмы детоксикапии токсического действия селенит-ионов связаны со
способностью клеток восстанавливать Se(IV) до элементарного селена, что
ограничивает его поступление в клетку. По-видимому, это один из основных
механизмов устойчивости к селену, поскольку его накопление пропорционально
содержанию этот элемента в среде. При значительном внутриклеточном накоплении
селена обнаруживаются изменения в биохимическом составе клеток, нарушение
клеточного гомсостаза, связанного с подкисленном рН цитоплазмы, что приводит к
гибели клеток. Снижение концентрации серы в среде увеличивает включение селена в
ссрусодсржащие аминокислоты, однако, ипгибирует синтез белка.
Механизмы устойчивости цианобактерии к цинку, вероятно, связаны с
сорбцией металла клеточной стенкой, индукцией металлсвязывающих белков и
экспортом цинка из клетки в культуральиую среду. При этом динамика накопления
цинка зависит от стадии роста S. platensis, на которой металл вводился в среду.
Проведенные комплексные исследования позволяют определить оптимальные
концентрации селена и ципка для внесения в среду культивирования, которые не
вызывают ишибировалия роста культуры и изменений биохимического состава
биомассы для оптимизации внутриклеточного накопления этих элементов и получения
биомассы, обогащенной селеном и цинком.
М
кДа
25 -
14 -
Рис. 10. Электрофоретическое разделение
цинксодержащих белков S.platensis
М - маркеры молекулярной массы.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

17. выводы
1. Показано, что S. platensis чрезвычайно устойчива к действию высоких
концентраций селена и цинка. Культура сохраняет способность к росту, хотя и
сильно подавленную, при концентрациях селенита натрия в среде 170 мг/л,
нитрата и сульфата цинка 40 мг/л.
2. Показано, что содержание внутриклеточного селена находится в прямой
зависимости от концентрации селенита в среде, что, очевидно, говорит о
неспособности клеток S. platensis лимитировать накопление Se вплоть до
летальных величин.
3. Содержание селена в белке и биомассе может быть увеличено при увеличении
соотношении Se/S в культуральной среде.
4. Динамика накопления цинка зависит от стадии роста кулы-уры, на которой
элемент вносился в питательную среду и продолжительности культивирования.
Максимальное накопление цинка наблюдается через несколько суток при
внесении его вместе с шюкулятом и через несколько часов при внесении на
линейной стадии роста.
5. Показано, что практически весь селен включается в белковую фракцию. Около
70% цинка обнаруживается в составе суммарного клеточного белка S. platensis.
При этом две трети цинка включается в растворимые белки с молекулярной
массой 3-15 кДа. 30% цинка обнаруживается в составе липофильных соединений.
6. Сухая биомасса S. platensis способна сорбировать цинк.
7. В темноте клетки накапливают больше цинка, чем на свету.
8. Определение пределов концентраций Se и Zn не вызывающих изменений
биохимического состава и ингибирования роста, а также исследования динамики
накопления Zn от стадии развития культуры могут служить основой для
разработки технологического процесса получения биомассы S. platensis,
обогащенной селеном и цинком.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

18. СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Ковшова Ю.И., Милехин И.А., Лапин А.Б., Попова ВЛ., Мишина И.М., Пронина НА.
Аккумуляция микроэлементов клетками Spirulina platensis II Горизонты физико-химической
биологии: Тез. докл. - Пущино, 2000. - С. 319-320.
2. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Культивирование Spirulina
platensis на средах, обогащенных микроэлементами // Биотехнология — народному хозяйству:
Тез. докл. 1-го Межд. симп. - Москва, 2000.
3. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Габель Б,В. Способ получения
обогащенной селеном биомассы спирулины {Spirulina platensis). Патент РФ № 2199582 от 24
октября 2000г.
4. Попова В.В., Ковшова Ю.И., Пронина Н.А. Накопление селена в клетках Spirulina platensis
при культивировании на селенит содержащих средах // Автотрофные микроорганизмы: Тез.
докл. - Москва, 2000. - С. 150-151.
5. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Цоглин Л.Н. Получение биомассы Spirulina
platensis, обогащенной микроэлементами // Актуальные проблемы инноваций с
нетрадиционными растительными ресурсами и создания функциональных продуктов: Тез.
докл. 1-ой Межд. конф, - Москва, 2001. - С. 236-238.
6. Попова В.В., Тучная О.А., Пронина Н.А. Обогащение клеток Spirulina platensis цинком //
Достижения биотехнологии на благо будущего человечества: Тез. докл. Межд. конф. -
Самарканд, Узбекистан, 2001. - С.34.
7. Popova V.V., Kovshova U.I., Mazo V.K., Pronina N.A. Accumulation of trace elements by
Spirulina platensis II Plant under environmental stress: Abstr. Intern. Symp. - Moscow, 2001. - C.
227-228.
8. Nalimova A.A., Popova V.V., Pronina N.A. Enrichment of Spirulina platensis cells with Cu and
Zn // Molecular genetics and biotechnology: Abstr. Intern. Symp. - Moscow, 2001.
9. Пронина Н.А., Ковшова Ю.И., Попова В.В., Лапин А.Б., Алексеева С.Г., Баум Р.Ф.,
Мишина И.М., Цоглин Л.Н. Влияние селенит ионов на рост и накопление селена у Spirulina
platensis II Физиология растений. - 2002. - Т.49, № 2. - С. 264-271.
10. Попова В.В., Пронина Н.А. Влияние различных солей цинка на рост и биохимический
состав Spirulina platensis II Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными
растительными ресурсами и создания функциональных продуктов: Тез. докл. 2-ой Межд.
конф. - Москва, 2003.
11. Popova V.V., Pronina N.A. The influence of anions and light on the growth of Spirulina
platensis and intracellular zinc accumulation // Biotechnology of microalgae: Abstr, 5th
workshop -
Potsdam, Germany, 2003.
12. Попова В.В., Нахимова А.А., Пронина НА. Накопление эссенциальных микроэлементов
клетками Spirulinaplatensis II Тез. докл. 5-го съезда ВОФР - Пенза, 2003. -С. 321.
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

19. Издательство ЦПИ при механико-математическом факультете
МГУ им. М.В. Ломоносова,
Подписано в печать //?. 2005
Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. { О
Тираж экз. //О • Заказ $t(
Лицензия на издательскую деятельность ИД В 04059,
от 20.02.2001г.
Отпечатано с оригинал-махета на типографском оборудовании
механико-математического факультета и Франко-русского
центра им. A.M. Ляпунова.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

20. • .1573
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»