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What's hot
What's hot (11)
空気中に存在する生物派生物の捕捉による特定生物の存在確認
- 4. DNA抽出 PCR アガロース電気泳動 Positive control sample 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 4
- 5. 1匹 3匹 10匹 30匹 7日 7日 7日 7日 試料採取: 各飼育最終日(7日目)の午前中に1時間吸引により、空気浮遊物を採取、採取後フィルターは チャック付きビニール袋に入れ、さらに、シリカゲルも入れてDNA調製まで室温保存する。 実験1 1 3 10 30 飼育室の体積: 6.3m3 飼育室の温度: 18～22℃ 飼育室の湿度: 40～70％ マウス 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 5
- 6. M 0 1 3 10 30 M: 分子量マーカー 0: マウス0匹 1: マウス1匹 3: マウス3匹 10: マウス10匹 30: マウス30匹 : マウスの存在を示すシグナル マウス一匹でも、マウスのシグナルが検出されている。１０匹の実験区では、検出出来なかったが、 その理由は、DNAの抽出に問題があるかもしれません。 そこで、再度抽出しも且つPCRサイクル数を増やして、検討して見ました。 PCR: 40cycles マウス 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 6
- 7. 結果: 1, 3, 10, 30匹で明確なバンド として検出された。しかし、バンド の濃淡がないことから、PCR回数を 多いため、プラトウに達したと思わ れる。 今後、バンドに濃淡が出る程度に PCRの回数を調整する必要がある。 マウス 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 7
- 8. 30匹 0匹 7日 7日 7日 7日 飼育室の体積: 6.3m3 飼育室の温度: 18～22℃ 飼育室の湿度: 40～70％ 試料採取: 飼育最終日(7日目)の午前中に1時間吸引により、空気浮遊物を採取、採取後フィルターは チャック付きビニール袋に入れ、さらに、シリカゲルも入れてDNA調製まで室温保存する。 その後、マウス0匹を維持しながら、7日ごとに、計3回、同様にフィルターで浮遊物を集め、同様に保 存する。 実験2 0 week 1 week 2 weeks 3 weeks マウス 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 8
- 9. 0 1 2 3 C M 0: 0 week 1: 1 week 2: 2 weeks 3: 3 weeks C: control (no mouse) M: Molecular marker PCR fragment from mouse 結論: マウスがいる間はマウスのシグナルが検出される。マウスがいなくなっても、その後、少なくとも一 週間は、マウスシグナルが検出される。その理由は、マウス由来物が浮遊しているためと考えられる。し かし、マウスがいなくなって、2週間以上たつと、マウスのシグナルは検出されなくなる。 PCR: 40cycles マウス 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 9
- 10. PCR反応 Primer: [F-1] sus Tag L5/ 10spe-R2 (ブタ) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (40 cycles) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (50 cycles) 2.5％アガロースゲル 40 cycles M Dw1 1 2 3 500bp Dw1: 水 Dw2: 水 1: 8.60ng, ブタゲノム 2: 2.85ng, ブタゲノム 3: 0.95ng, ブタゲノム 50 cycles M Dw1 Dw2 2 3 Component Reaction mix (ml) 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0 primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 DW (ml) DW4(0515) 1.0 Temp (ml) DNA solution 5.0 total 20.0 ブタ／イノシシ 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 10
- 11. PCR反応 Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ブタ) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (40 cycles) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (50 cycles) 2.5％アガロースゲル 40 cycles M Dw 1 2 3 500bp Dw: 水 1: 9.15ng, ラットゲノム 2: 3.05ng, ラットゲノム 3: 1.00ng, ラットゲノム 50 cycles M Dw 2 3 Component Reaction mix (ml) 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0 primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 DW (ml) DW4(0515) 1.0 Temp (ml) DNA solution 5.0 total 20.0 ラット 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 11
- 12. ブタ／イノシシ: HEPAを用いて、野外での実証試験 420m 養豚場 60分間空気濾過 濾過量は530リットル 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 12
- 13. PCR反応 Primer: [F-1] sus Tag L5/ 10spe-R2 (ブタ) Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ラット) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (45 cycles) 2.5％アガロースゲル Dw: 水 1: 養豚場付近、抽出１ 2: 養豚場付近、抽出２ 4: 1.0ng, ラットゲノム Component Reaction mix (ml) 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0 primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 DW (ml) DW 1.0 Temp (ml) DNA solution 5.0 total 20.0 ブタのみならず、ラットも検出された 500bp ブタプライマー 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 13
- 18. PCR反応 Primer: [F-7] rat Tag L3/ 10spe-R2 (ラット) 95C 9min, 95C 30sec 68C 30sec (55 cycles) 2.5％アガロースゲル 500bp Dw: 水 1: 食堂、反応１ 2: 食堂、反応２ 3: 東城寺、反応1 4: 東城寺、反応2 5: 1.00ng, ラットゲノム Component Reaction mix (ml) 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 10.0 primer F [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 primer R [2pmol/ml] 4pmol/20ml 2.0 DW (ml) DW 1.0 Temp (ml) DNA solution 5.0 total 20.0 55 cycles M Dw 1 2 3 4 5 結果 ・食堂、東城寺とも2連の反応で行った。 (各サンプルとも抽出は1本、反応は2本で行った。） どちらも、2本中1本（#2, #4)にシグナルを検出した。 →食堂、東城寺ともラットは存在するが、極めて少ない。 食堂: 1分子／20ml 2分子／40ml 12分子／530リットル空気 東城寺: ２分子／20ml 4分子／40ml 24分子／530リットル空気 ラットDNAの検出 ２回目のトライアル
- 19. ラットの検量線 プライマー 4pmole プライマー 8pmole
- 21. シロアリの種類と被害 • イエシロアリは水を運ぶ能力があり、松材を好み、屋根裏まで 被害が及んでいる場合があります • ヤマトシロアリは、雨漏りがある場合は屋根裏部分まで被害が 及ぶことがあります。柱の背割れに蟻道を形成して、2階部が 被害を受けることがあります。 • アメリカカンザイシロアリは、湿気とは関係なく、直接、2階 部分に侵入し被害を及ぼすことがあります。 • ダイコクシロアリは、乾燥にきわめて強く、水がなくても生活 ができるので、乾燥状態の木材でも生息が可能です。
- 24. ヤマトシロアリ Reticulitermes speratus kyushuensis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1219676367 イエシロアリ Coptotermes formosanus https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_015800.1 アメリカカンザイシロアリ Incisitermes minor https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_037511.1 ダイコクシロアリ Cryptotermes domesticus 配列情報なし 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 24 シロアリのミトコンドリアDNA配列情報
- 28. DNA抽出 １．フィルターをDNA抽出液に入れる。 ２．プロテネースK、56Cで1時間処理する。 ３．フェノール・クロロフォルム液を加え、上層を取得する。 ４．クロロフォルムで洗浄後、イソプロパノール沈殿をする。 ５．沈殿をDWに溶解する。 PCR反応 Primer: Cfor-F/Cfor-R (イエシロアリ) 95C 9min (1cycle), 95C 20sec 66C 20sec 72C 30sec (45cycles), 72C 5min (1cycle) 2.5％アガロースゲル Dw: 水 Ma60: 吉村先生の飼育室で60分吸引したマスクで 回収したDNA Ge1: 現場1で60分吸引したマスクで回収したDNA Ge2: 現場2で60分吸引したマスクで回収したDNA
- 32. A邸 経過年 シロアリゲノム数 0 10 1 15 2 10 3 100 4 300 5 15 シロアリ駆除
- 34. DNAデータベース未登録の生物種検出の試み 標的生物種について、DNAデータベースを用いて、プライマーを設計し、PCRを行うが、PCR産物が検出され なかった場合、通常の方法では、この段階で断念せざるを得ない。(その生物種のゲノム配列情報がない。) 生物には、一般に、DNAとしては、核ゲノムとミトコンドリアゲノムがある。生物を検出す るには、細胞当たり、コピー数を多い配列(ミトコンドリア、反復配列)を用いることにより、 高感度に検出することが出来る。また、生物種に特異的でなくてはならない。 新規考案方法 ①標的生物から、DNAを高純度に精製する ②NGSでランダムにシークエンス解析する。目標40億塩基 ③アッセンブルを行う。 出力例 > 245361 594 1580 ATCTGGTCGCGCTCGGCATCGCTATGGCGCGCATCGAAATGGATCAC...... Id番号 長さ Kmerのマップ数 KMERS is the number of KMERS that mapped to the sequence during assembly ④コピー数の多い配列を選択するため、Kmerのマップ数/長さ の大きいものを選 択し、且つ、アセンブルされた配列の長さが５００塩基以上のものを抽出する。 そして、そこからプイラマーを作成する。
- 37. A工場 チャタテムシ駆除 経過年 チャタテムシゲノム数 0 10 1 15 2 10 3 100 4 300 5 15
- 39. トコジラミについて • トコジラミ（床虱、学名：Cimex lectularius、英語: Bed bug） とは、吸血性の寄生昆虫である。「シラミ」と命名されている が、シラミ目ではなく、カメムシ目トコジラミ科の昆虫で捕食 性のカメムシであるマキバサシガメ科などに近縁である。トコ ジラミ科の昆虫は全て吸血性であるが、そのほとんどは主に鳥 類やコウモリ類を宿主とする[1]。一方で本種および近縁種のタ イワントコジラミ（台湾床虱。学名：Cimex hemipterus。別 名、ネッタイトコジラミ、ネッタイナンキンムシ、熱帯南京 虫）のみが、ヒトを主な吸血源とする。 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 39
- 40. Cimex lectularius/Cimex hemipterus Cimex lectularius 登録されている配列は２種類 Cimex hemipterus 登録されている配列は５２種類 これらの配列を基に、それぞれの種を区別し、同種内では、全ての亜 種を検出するプライマーセットを作成 中国/米国 米国 2020/11/20 つくば遺伝子研究所 40
- 42. PCR条件 Primer: Cime-HF22/Cime-HR22（熱帯トコジラミ） Cime-LF25/Cime-LR25（日本トコジラミ） Template Dw 10倍希釈To (x10), Yo (x10), Ne (x10), Am (x10), Ma (x10), Ku (x100) 95C 9min (1cycle), 95C 20sec 66C 20sec 72C 30sec (35cycles), 72C 5min (1cycle) 2.5％アガロースゲル M Dw To Yo Ne Am Ma Ku M 500bp M:マーカー Dw: 水 To: 東京の一般住宅で採取したトコジラミのDNA Yo: 実験室トコジラミのDNA Ne: 熱帯トコジラミのDNA Am: アメリカで採取したトコジラミのDNA Ma: マルカメムシのDNA Ku: クサギカメムシのDNA M Dw To Yo Ne Am Ma Ku M Cime-HF22/Cime-HR22 Cime-LF25/Cime-LR25 124bp 156bp
- 46. Aホテル 経過月 トコジラミの検出ゲノム数 0 10 1 15 2 10 3 100 4 300 5 0 駆除