Exome解析入門

3. E xo m e 解析フロー I I 罹患 I 罹患 I 非罹患 QC QC QC サンプルごとの Mapping Mapping Mapping 解析 SNV/Indel SNV/Indel SNV/Indel 共通非罹患者と共通する多型を除く疾患関連遺伝子疾患関連変異の候補の探索セグメントゲノム重複(segmental duplication)の領域を除く Common SNP, HomoのSNVは避ける Mutation typeで絞り込む実験的に検証 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 3

4. E xo m e 解析フロー【サンプルごと解析】 QC 1. QCleaner ： Fastqファイルをフィルタリング 1. BWA ：マッピング Mapping 2. Picard ：重複リードの除去 1. GATK ：リアラインメント： Recalibration ： SNV/Indel検出 SNV/Indel ：フィルタリング 2. QuickAnnotator ：アノテーション付与 3. snpEFF ：アノテーション付与/集計 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 4

5. E xo m e 解析フロー【疾患関連遺伝子の探索】サンプル間 BEDtools ：罹患者に共通する多型を抽出共通 BEDtools ：非罹患者と共通する多型を除外疾患関連 BEDtools ：セグメントゲノム重複(segmental duplication)領域の変異の候補多型を除外 Linuxコマンド：Common SNP, HomoのSNVは避ける絞り込み Mutation typeで絞り込む実験的に検証 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 5

6. サンプルごとの解析【コマンド】 1. QCleaner ： Fastqファイルをフィルタリング ※自社開発のプログラムです。 QC $ perl qcleaner.pl --i1 $FILE1.fastq --i2 $FILE2.fastq --o1 $FILE1.clean.fastq --o2 $FILE2.clean.fastq --qp 20,80 --n 10 -- trim 20 --length 20 --log $FILE.qc.log FASTQ形式にマッチするかチェックデータクオリティチェック（FastQC） Mapping Illumina CASAVA filter [Y] を除去クオリティ20未満が80%以上のリードを除去クオリティ20未満の末端をトリム未知の塩基(N)が多いリード除去 SNV/Indel 配列長が短いリード除去片側のみのリードを除外データクオリティチェック（FastQC） Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 6

7. サンプルごとの解析【コマンド】 1. QCleaner ： Fastqファイルをフィルタリング QC ※公開ツールを組み合わせても同じ処理を行えます。下記のコマンドは、一部のコマンドです。・データチェック $ fastqc --nogroup -o ./ -f fastq $FILE1.fastq $FILE2.fastq Mapping ・クオリティ20以上の塩基が80%未満のリードを削除 $ fastq_quality_filter -i $FILE1.fastq -o $FILE1.qual.fastq -q 20 -p 80 -Q 33 -v ・ペアのリードを抽出 $ cmpfastq.pl $FILE1.fastq $FILE2.fastq SNV/Indel 出力ファイル SRR290592_1.qual.fastq-common.out SRR290592_1.qual.fastq-unique.out※１ SRR290592_2.qual.fastq-common.out SRR290592_2.qual.fastq-unique.out ※１ ※ １使用しないという選択肢もありますが、シングルエンドとしてマッピングするということもできます。 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 7

8. サンプルごとの解析【コマンド】 1. Qcleaner ： Fastqファイルをフィルタリング QC Mapping Sequence length : 90 %GC : 44 SNV/Indel 処理後／処理前残存割合リード数 62,157,419 ／ 62,167,318 99.98% 塩基数 5,594,167,710 ／ 5,595,058,620 99.98% Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 8

9. サンプルごとの解析【コマンド】 1. BWA ：マッピング QC ※ リファレンス GRCh Build37 ＋デコイ配列 Version 5 Mapping デコイ配列とは？ヒトWhole Genome Sequencing Cloneを「ヒトゲノム＋ヒトヘルペスウイルスHHV-4 」にマッピングして、よくマップできなかったものを集めたものサイズ：合計35.4Mb、N50=22.9kb 特徴： 50%はサテライト配列またはシンプルリピート、20%はレトロトランスポゾン用途： ① リファレンスゲノムにデコイを入れてマッピングすることにより、SNP検 SNV/Indel 出精度が上がる ② 構造変異の検出精度が上がることも期待される Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 9

10. サンプルごとの解析【コマンド】 1. BWA ：マッピング QC ・マッピング／SAMをBAMに変換／ソート $ bwa aln -t 6 genome_hs37d5cs.fa $FILE1.clean.fastq -f $FILE1.sai $ bwa sampe -r "@RG¥tID:$FILE¥tSM:$FILE¥tPL:Illumina" -n 3 Mapping -N 10 -a 500 genome_hs37d5cs.fa $FILE1.sai $FILE2.sai $FILE1.clean.fastq $FILE2.clean.fastq | samtools view -Sb - | samtools sort - $FILE.sorted ※オプション -a INT maximum insert size [500] -n INT maximum hits to output for paired reads [3] -N INT maximum hits to output for discordant pairs [10] SNV/Indel ※RG（read groups） platform (PL) および sample (SM)が必要 PLの例：454, LS454, Illumina, Solid, ABI_Solid, CG (all case-insensitive) 解析ツールGATKに入力するBAMファイルに、RGタグの記述がないとエラーが出る Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 10

11. サンプルごとの解析【コマンド】 1. BWA ：マッピング QC ・ BAMファイルのインデックス作成 $ samtools index $FILE.sorted.bam ・マッピング率算出 $ samtools idxstats $FILE.sorted.bam | awk '{a += $3; b += Mapping $4} END {print "mapping=",a,",unmapping=",b,"mapped ratio=", a/(a+b)}' ※ samtools idxstatsを実行すると下記のような画面が標準出力されます染色体染色体の塩基数 mapped unmapped chr1 249250621 10967229 76642 chr10 135534747 4339778 29214 ： SNV/Indel chr9 141213431 4480449 38793 chrM 16571 1769 13 chrX 155270560 2441946 15933 chrY 59373566 519445 7890 * 0 0 1296678 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 11

12. サンプルごとの解析【コマンド】 2. Picard ：重複リードの除去 QC $ java -jar MarkDuplicates.jar I=$FILE.sorted.bam O=$FILE.sorted.redup.bam METRICS_FILE=jeter.metrics REMOVE_DUPLICATES=true ASSUME_SORTED=true VALIDATION_STRINGENCY=SILENT Mapping ※BAMファイルを操作する上で、便利なコマンド・BAMファイルの中身を表示する $ samtools view $FILE.sorted.redup.bam | less ・必要な領域を抜き出す $ samtools view -b $FILE.sorted.bam chr3:24148647-24546266 > $FILE.chr3.sorted.bam SNV/Indel Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 12

13. サンプルごとの解析【コマンド】 1. GATK QC ※入力ファイルを確認 ① マップされていないリードと、そのペアのリードは除く $ samtools view -b -F 12 $FILE.sorted.redup.bam > $FILE.sorted.redup.f12.bam Mapping ② ソートは、数字が大きくなる順番にする $ java -jar ReorderSam.jar I=$FILE.sorted.redup.f12.bam O=$FILE.kary.redup.f12.bam REFERENCE=genome_hs37d5cs.fa ③ RG（read groups）情報を入れる $ java -Xmx10G -jar AddOrReplaceReadGroups.jar I=$FILE.kary.redup.f12.bam O=$FILE.kary.bam SO=coordinate RGID=$FILE RGLB=$FILE RGPL=Illumina RGPU=run RGSM=$FILE SNV/Indel ④ インデックス作成 $ samtools index $FILE.kary.bam Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 13

14. サンプルごとの解析【コマンド】 1. GATK QC 1-1. リアラインメント・リアラインメントする対象領域を抽出 $ java -Xmx10G -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R genome_hs37d5cs.fa -I $FILE.kary.bam -o $FILE.intervals ※ Intervalファイルの中身： chr1:1191423-1191507 Mapping chr1:1192263-1192295 chr1:1197640-1197641 chr1:1198376-1198377 chr1:1198661-1198795 chr1:1203212-1203259 chr1:1213787-1213788 chr1:1217938-1217939 chr1:1222267 chr1:1222468-1222474 chr1:1225488-1225489 SNV/Indel ：・リアラインメント $ java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R genome_hs37d5cs.fa -I $FILE.kary.bam -targetIntervals $FILE.intervals -o $FILE.realigned.bam Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 14

15. サンプルごとの解析【コマンド】 1. GATK QC 1-1. リアラインメント・ペアエンド情報修正 $ java -Xmx10G -jar FixMateInformation.jar I=$FILE.realigned.bam O=$FILE.realigned.fix.bam SO=coordinate VALIDATION_STRINGENCY=SILENT TMP_DIR=$FILE Mapping 1-2. Recalibration ・Recalibrationで入力するファイル作成 $ java -Xmx10G -jar GenomeAnalysisTK.jar -T CountCovariates -cov ReadGroupCovariate -cov QualityScoreCovariate -cov CycleCovariate -cov DinucCovariate -I $FILE.realigned.fix.bam -R genome_hs37d5cs.fa -nt 6 - recalFile $FILE.recal_data.csv --knownSites:name,VCF db3np135-All.vcf ・ Recalibration実行／インデックス作成 SNV/Indel $ java -jar GenomeAnalysisTK.jar -I $FILE.realigned.fix.bam -R genome_hs37d5cs.fa -T TableRecalibration -l INFO -recalFile $FILE.recal_data.csv -log $FILE.new_qual.log --out $FILE.realigned.alnRecal.bam $ samtools index $FILE.realigned.alnRecal.bam Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 15

16. サンプルごとの解析【コマンド】 1. GATK QC 1-3. SNV/Indel検出 $ java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -R genome_hs37d5cs.fa -I $FILE.realigned.alnRecal.bam -o $FILE.gatk.snv.vcf $ java -Xmx10G -jar GenomeAnalysisTK.jar -T UnifiedGenotyper -glm INDEL - R genome_hs37d5cs.fa -I $FILE.realigned.alnRecal.bam -o $FILE.gatk.indel.vcf ※ -glm /--genotype_likelihoods_model SNP, INDEL, BOTH から選べる。デフォルトはSNP Mapping 1-4. フィルタリング $ java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T VariantFiltration -R genome_hs37d5cs.fa -V $FILE.gatk.snv.vcf -o $FILE.gatk.snv.fil.vcf -- clusterWindowSize 10 --filterExpression "DP < 3 || QUAL < 20 || SB > - 0.1" --filterName "HARD_TO_VALIDATE" $ java -jar ${GenomeAnalysisTK} -T VariantFiltration -R genome_hs37d5cs.fa -V 3_gatk/$FILE.gatk.indel.vcf -o SNV/Indel $FILE.gatk.indel.fil.vcf --filterExpression "QUAL < 20 || SB > -0.1 || MQ0 > 4 || DP < 3" --filterName "HARD_TO_VALIDATE" ※ VCFファイルのFILTER列に、条件を通過した場合“PASS”、そうでない場合は “filterName”が記入される ※オプション DP：Approximate read depth; some reads may have been filtered SB：Strand Bias QD：Variant Confidence/Quality by Depth HRun：Largest Contiguous Homopolymer Run of Variant Allele In Either Direction Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 16

17. サンプルごとの解析【コマンド】 2. QuickAnnotator ：アノテーション付与 ※自社開発のプログラムです。 QC $ java -Xmx10G -jar QuickAnnotator.jar -q vcf -g refGene.txt -s refGeneMrna.fa -o $FILE.gatk.snv.fil.anno $FILE.gatk.snv.fil.vcf ※公開ツールを組み合わせても同じ処理を行えます。下記のコマンドは、一部のコマンドです。・ Annovar Mapping ※データベースをダウンロードする必要があります入力ファイルに変換 $ perl convert2annovar.pl -format vcf4 $FILE.gatk.snv.fil.vcf > $FILE.gatk.snv.fil.avlist アノテーションを付与 SNV/Indel $ perl summarize_annovar.pl --buildver hg19 $FILE.gatk.snv.fil.avlist humandb -outfile $FILE.gatk.snv.fil --ver1000g 1000g2012feb --verdbsnp 135 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 17

18. サンプルごとの解析【コマンド】 2. QuickAnnotator ：アノテーション付与 QC ※公開ツールを組み合わせても同じ処理を行えます。下記のコマンドは、一部のコマンドです。・ Annovar ①SegDup ⑨LJB_SIFT_Pred ②ESP5400_ALL ⑩LJB_PolyPhen2 Mapping ③1000g2012feb_ALL ⑪LJB_PolyPhen2_Pred ④dbSNP135 ⑫LJB_LRT ⑤AVSIFT ⑬LJB_LRT_Pred ⑥LJB_PhyloP ⑭LRT_MutationTaster ⑦LJB_PhyloP_Pred ⑮LRT_MutationTaster_Pred SNV/Indel ⑧LJB_SIFT ⑯LJB_GERP++ Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 18

19. サンプルごとの解析【コマンド】 3. snpEFF ：アノテーション付与/集計 QC $ java -Xmx10G -jar snpEff.jar eff -c amelieff.config -i vcf -o vcf -noLog hg37.63 $FILE.gatk.snv.fil.vcf > $FILE.gatk.snv.fil.vcf.snpeff.vcf ※データベースをダウンロードして、configファイルにその位置情報を書きます下記の文は、snpEffsnpEff_v2_1_core/snpEff_2_1/snpEff.configの一部です。 Mapping # Databases are stored here # E.g.: Information for 'hg19' is stored in data_dir/hg19/ # # Note: Since version 2.1 you can use tilde ('~') as first character to refer to your home directory #--- data_dir = ~/snpEff/data/ # Databases are stored here SNV/Indel # E.g.: Information for 'hg19' is stored in data_dir/hg19/ # # Note: Since version 2.1 you can use tilde ('~') as first character to refer to your home directory #--- data_dir = /home/db/snpEff Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 19

21. サンプルごとの解析【結果】リファレンス処理内容 I I 罹患 I 罹患 I 非罹患 QC マッピング率（%） 98.90 98.46 98.61 重複リード除外後（%） 98.63 98.12 98.35 SNV 196,600 196,784 169,939 デコイなしフィルタリング後のSNV 157,072 155,763 141,000 Indel 14,576 14,467 13,565 Mapping フィルタリング後のIndel 12,999 12,918 12,142 マッピング率（%） 98.68 98.73 98.31 重複リード除外後（%） 98.36 98.46 98.00 SNV 182,832 185,580 157,593 デコイありフィルタリング後のSNV 146,695 147,652 131,720 Indel 13,956 13,998 12,909 SNV/Indel フィルタリング後のIndel 12,635 12,638 11,710 ※デコイありのフィルタリング後の多型の数は、デコイ配列上に検出された多型を除外しています。 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 21

23. 疾患関連遺伝子の探索サンプル間 1. BEDtools ：罹患者に共通する多型を抽出共通 $ intersectBed -a II-case.gatk.snv.fil.vcf -b I- case.gatk.snv.fil.vcf -u > case.vcf II 罹患 I 罹患 87,306 疾患関連 147,695 147,652 変異の候補 2. BEDtools ： 1に対して、非罹患者と共通する多型を除外 $ intersectBed -a case.vcf -b I-control.gatk.snv.fil.vcf -v > target.vcf 絞り込み I 非罹患 131,720 実験的に 87,306 15,470 検証 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 23

24. 疾患関連遺伝子の探索 3. Linuxコマンドで絞り込み／遺伝子ごとに集計サンプル間共通 15,470 ← セグメントゲノム重複(segmental duplication)領域以外のSNV 12,945 ← 最も近傍の遺伝子が、1k以内に位置するSNV 疾患関連 10,466 変異の候補 ← HeteroのSNV 5,816 2875遺伝子（複数の変異を持つ遺伝子は693個） ← 1000人ゲノムプロジェクトでALTアリル頻度が1%以下のSNV 絞り込み 204 170遺伝子（複数の変異を持つ遺伝子は10個） ← nonsynonymous SNV 32 実験的に検証候補として29遺伝子（複数の変異を持つ遺伝子は2個）を抽出 Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 24

25. NGSデータ解析サーバー販売中！！データ解析パイプラインおよびリファレンスゲノム情報がプリインストールされています。今回ご紹介した解析は、下記のサーバーで実施しました。サンプルあたりの実行時間は約8時間です。 OS CentOS 6 64bit CPU Intel Core i7-3930K [3.20GHz/6Core] メモリ 64GB SSD 64GBｚ（OS用） HDD 2TB ｘ 4台（RAID10）（データ用） bwa, SAMtools, FastQC, BEDtools, ソフトウェア自社開発ソフトなど Copyright © Amelieff Co. Ltd. All Rights Reserved. 25

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