Download luận văn thạc sĩ ngành sinh học thực nghiệm với đề tài: Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều, cho các bạn làm luận văn tham khảo Nhận viết luận văn đại học, thạc sĩ trọn gói, chất lượng, LH ZALO=>0909232620 Tham khảo dịch vụ, bảng giá tại: https://baocaothuctap.net

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
VÕ THỊ THU GIANG
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN
VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
TP. Hồ Chí Minh - 2019

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
VÕ THỊ THU GIANG
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN
VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn 1: TS. NGUYỄN VĂN KHOA
Hướng dẫn 2: TS: LÊ THỊ ÁNH HỒNG
TP. Hồ Chí Minh - 2019

3. i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu ứng dụng enzym
tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép
quả điều” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn nhiệt tình của thầy
TS. Nguyễn Văn Khoa và cô TS. Lê Thị Ánh Hồng. Đây không phải là bản sao
chép của bất kì một cá nhân, tổ chức nào. Các kết quả thực nghiệm, số liệu,
nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh
giá.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình
bày ở luận văn này.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019
Người cam đoan
Võ Thị Thu Giang

4. ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy TS. Nguyễn Văn Khoa và cô TS.
Lê Thị Ánh Hồng đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu
và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới và Viện Công
nghệ Hóa học, thầy cô giảng viên và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo
điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa học.
Tôi xin cảm ơn đến tất cả bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động
viên và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, làm việc
và nghiên cứu.
Và cuối cùng, tôi xin dành những tình cảm trân trọng nhất cho những
người thân trong gia đình đã luôn động viên và giúp tôi vượt qua những khó
khăn trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu.
Võ Thị Thu Giang

5. iii
DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BYT: Bộ Y Tế
NN&PTNT: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
EC: Cộng đồng Châu Âu (European Community)
FAO: Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
(Food and Agriculture Organization of the United Nations)
IWSR: Phân tích thị trường đồ uống của Anh
NT: Nghiệm thức
OIV: Tổ chức Rượu vang và Rượu Quốc tế
QCVN: Quy Chuẩn Việt Nam
S1: Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1)
S2: Saccharomyces uvarum 664 (S2)
SBD: Sabouraud
TCVN: Tiêu Chuẩn Việt Nam

6. iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều……………………… .9
Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều........................27
Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến
hoạt tính của enzym tanase. ............................................................................27
Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase. .......................28
Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại
tanin trong dịch ép quả điều............................................................................29
Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men. ..................................30
Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính. ..31
Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở
dịch ép quả điều...............................................................................................32
Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic....................................33
Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng............................................37
Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm............................................38
Bảng 3.1: Một số các chỉ tiêu dinh dưỡng trong dịch ép quả điều ban đầu...40
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến quá trình thủy phân tanin bằng
enzym tanase trong thời gian 30 phút. ............................................................42
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase đến tách loại tanin........43
Bảng 3.4: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch quả điều sau quá trình tách
loại tanin..........................................................................................................47
Bảng 3.5: Kết quả phân tích ANOVA đến quá trình hình thành cồn trong lên
men chính........................................................................................................54
Bảng 3.6: Tác động các yếu tố đến quá trình hình thành độ cồn theo phần
mềm JMP.........................................................................................................55

7. v
Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra thực nghiệm từ thông số của...............................58
Bảng 3.8: Kết quả một số chỉ tiêu ở sản phẩm rượu vang điều......................60
Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ở rượu vang điều............60

8. vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1: Cây điều. ........................................................................................... 3
Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới....................................................... 5
Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm .......... 6
Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam ................................... 6
Hình 1.5: Quả điều. ........................................................................................... 8
Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch....................................... 8
Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin.......................................................11
Hình 1.8: Phản ứng thủy phân gallotanin. ......................................................11
Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic..............................................................12
Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase................................13
Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít………………………24
Hình 3.1: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nồng độ khác nhau….45
Hình 3.2: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nhiệt độ khác nhau.....46
Hình 3.3: Dịch ép quả điều trước và sau xử lý bằng enzyme tanase và gelatin.
.........................................................................................................................48
Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae
K1 V1116 (S1). ...............................................................................................49
Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces uvarum 664
(S2)..................................................................................................................49
Hình 3.6: Sự biến thiên o
Brix..........................................................................51
Hình 3.7: Sự biến thiên độ cồn........................................................................51
Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axit tổng số trong quá trình lên men chính.
.........................................................................................................................52
Hình 3.9: Sự biến đổi giá trị pH trong quá trình lên men chính. ....................52

9. vii
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của 3 yếu tố khảo sát đến độ cồn tạo
thành trong không gian 3 chiều.......................................................................55
Hình 3.11: Kết quả tối ưu hóa ba yếu tố ảnh hưởng theo phần mềm JMP.....56
Hình 3.12: Kết quả các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình lên men..................58
Hình 3.13: Rượu vang điều.............................................................................59
Sơ đồ 3.1: Giản đồ phân tích HPLC xác định axit gallic trong dịch ép quả điều
trước và sau khi thủy phân bằng enzym tanase...............................................44
Sơ đồ 3.2: Quy trình sản xuất rượu vang điều……………………………….61

10. viii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢN, SƠ ĐỒ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU........................................................................................................... 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. CÂY ĐIỀU................................................................................................. 3
1.1.1. Khái quát về cây điều........................................................................... 3
1.1.2. Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều ................................ 5
2. QUẢ ĐIỀU.................................................................................................... 7
1.3. TANIN .....................................................................................................10
1.3.1. Định nghĩa..........................................................................................10
1.3.2. Phân loại và cấu trúc ......................................................................10
1.4. ENZYM TANASE...................................................................................12
1.4.1. Định nghĩa và tính đặc hiệu ..............................................................12
1.4.2. Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase .................12
1.4.3. Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym..................13
1.5. GELATIN.................................................................................................14
1.5.1. Định nghĩa..........................................................................................14
1.5.2. Tính chất ............................................................................................14
1.5.3. Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin...............................................15
1.6. RƯỢU VANG..........................................................................................16

11. ix
1.6.1. Giới thiệu chung về rượu vang ..........................................................16
1.6.2. Phân loại rượu vang ..........................................................................16
1.6.3. Tình hình sản xuất rượu vang ............................................................18
1.6.3.1. Trên thế giới ................................................................................18
1.6.3.2. Ở Việt Nam...................................................................................18
1.6.4. Cơ chế lên men rượu vang.................................................................19
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ....................................20
1.6.5.1. Nấm men ......................................................................................20
1.6.5.2. Ảnh hưởng của pH ......................................................................21
1.6.5.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy..............................................21
1.6.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ...............................................................21
1.6.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường ..................................................22
1.6.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ etanol....................................................22
1.6.6.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men................................................22
1.6.6.8. Ảnh hưởng của CO2 ....................................................................23
Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....24
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.........................................24
2.1.1. Thời gian ............................................................................................24
2.1.2. Địa điểm.............................................................................................24
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................................24
2.2.1. Dịch ép quả điều ................................................................................24
2.2.2. Enzym tanase .....................................................................................24
2.2.3. Gelatin................................................................................................25
2.2.4. Vi sinh vật..........................................................................................25

12. x
2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................25
2.3.1. Môi trường .........................................................................................25
2.3.2. Hóa chất .............................................................................................25
2.3.4. Dụng cụ và thiết bị.............................................................................26
2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU....................................................................26
2.4.1. Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu...........26
2.4.2. Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả điều và
hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin .............................26
2.4.3. Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở dịch ép
quả điều đến hiệu suất tách loại tanin. ........................................................28
2.4.5. Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men thích hợp
cho quá trình lên men dịch ép quả điều .......................................................29
2.4.6. Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang điều
......................................................................................................................30
2.4.7. Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều.....................................32
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................32
2.5.1. Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal .................32
2.5.2. Xác định hàm lượng polyphenol........................................................33
2.5.3. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)
......................................................................................................................34
2.4.4. Xác định năng lực khử.......................................................................34
2.5.5. Xác định hiệu suất tách loại tanin......................................................35
2.5.6. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (o
Brix) ..................................35
2.5.7. Xác định pH .......................................................................................35
2.5.8. Xác định hàm lượng axit tổng số.......................................................35

13. xi
2.5.9. Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu .......................36
2.5.10. Xác định độ cồn trong rượu .............................................................36
2.5.11. Đánh giá cảm quan...........................................................................37
2.5.12. Xử lí số liệu......................................................................................38
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................39
3.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU
BAN ĐẦU.......................................................................................................39
3.2. KHẢO SÁT THỦY PHÂN TANIN BẰNG ENZYM TANASE ...........41
3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁCH LOẠI TANIN BẰNG GELATIN ........45
3.4. MỘT SỐ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ
ĐIỀU SAU XỬ LÝ.........................................................................................47
3.5. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ NẤM MEN
THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN ................................................48
3.5.1. Kết quả xác định môi trường và thời điểm dừng ở quá trình nhân
giống nấm men.............................................................................................48
3.5.2. Kết quả lựa chọn nấm men để lên men rượu vang điều ....................50
3.6. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN...................................................54
3.7. XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG ĐIỀU ............59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH..........................................................................61
KẾT LUẬN..................................................................................................62
KIẾN NGHỊ .................................................................................................63
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................64
PHỤ LỤC........................................................................................................71

14. 1
MỞ ĐẦU
Cây điều (đào lộn hột) có tên khoa học Anacardium occidentale, là cây
trồng sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc khu vực cận xích
đạo, nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao. Ở Việt Nam, điều là cây kinh tế vườn quan
trọng trong cơ cấu cây trồng của các tỉnh phía Nam như: Bình Phước, Đồng
Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận, Gia Lai, Bình Định...với tổng diện tích
thu hoạch hơn 300 nghìn hecta [1]. Theo ước tính năm 2017, lần đầu tiên nước
ta vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế giới với tổng sản lượng
xuất khẩu đạt hơn 360 nghìn tấn hạt điều và giá trị đạt hơn 3 tỷ đô la Mỹ [2].
Quả điều gồm hạt điều và cuống điều (hay còn gọi là quả điều giả, trong
dân gian gọi là quả điều, ở đề tài này cũng gọi là quả điều). Theo các nghiên cứu
tại Ấn Độ, Brasil, Nigeria hàm lượng vitamin C trong dịch ép quả điều đạt tới
219 mg/100mL cao gấp 5 lần cam, 12 lần so với dứa [3,4]. Dịch ép quả điều còn
chứa hàm lượng cao các hợp chất tanin, polyphenol là các hợp chất kháng oxy
hóa tự nhiên rất có lợi cho sức khỏe giúp ngăn ngừa ung thư và phòng chống
các vi khuẩn gây viêm dạ dày [3]. Thế nhưng khi đến mùa thu hoạch hạt điều
được giữ lại để chế biến, quả điều bị vứt bỏ, nguyên nhân do chứa hàm lượng
tanin (250-470 mg/100mL) cao gây chát, sít lưỡi và khô rát vòm họng khi sử
dụng. Theo thống kê, cứ khoảng 8-10 tấn quả điều sẽ thu về khoảng 1 tấn hạt
điều thô, như vậy lượng quả điều đang bị bỏ hiện nay của nước ta ước khoảng
2,5-3 triệu tấn [5].
Quả điều rất giàu dinh dưỡng, có khả năng kháng oxy hóa cao là bạn của
sức khỏe, nhưng đang bị vứt bỏ vừa gây ô nhiễm môi trường, vừa lãng phí. Nếu
loại bỏ được vị chát tận dụng được nguồn nguyên liệu quả điều, mang nhiều ý
nghĩa to lớn. Theo các nghiên cứu trước đây, để tách loại hàm lượng tanin
thường sử dụng gelatin, casein, lòng trắng trứng, tinh bột gạo, tinh bột sắn…
nhằm tạo kết tủa protein-tanin loại ra khỏi dung dịch [4]. Phương pháp truyền
thống này có nhược điểm là tiến hành ở nhiệt độ cao 60-80o
C làm mất đi các
vitamin B, C có trong dịch quả điều. Đồng thời tanin cũng là một polyphenol
hữu ích bị loại hẳn ra khỏi dịch ép, làm giảm hàm lượng polyphenol hữu ích và

15. 2
khả năng kháng oxy hóa của dịch ép quả điều ban đầu. Dịch ép sau xử lý thu
được chế biến các loại đồ uống như: nước giải khát, nước lên men,...vẫn còn vị
quá chát và sít lưỡi. Do vậy, ở nước ta vẫn chưa có nơi nào sản xuất rượu/nước
uống dinh dưỡng từ dịch ép quả điều. Ngược lại các loại nước uống được lên
men từ các loại quả cho độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, tốt cho sức khỏe
như: kích thích tiêu hóa, giảm stress…thì đang được ưa chuộng và mang lại
nhiều giá trị kinh tế.
Từ lý do trên đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân
tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều” được thực hiện
nhằm mục đích nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa enzym tanase và gelatin để
xử lý tách loại tanin hiệu quả, giảm vị quá chát và tăng hàm lượng polyphenol
ở dịch sau xử lý, nhằm làm nguồn nguyên liệu bổ dưỡng tạo ra đặc sản của địa
phương, giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập cho người nông dân.
* Mục tiêu đề tài
Xác định điều kiện tối ưu của enzym tanase và gelatin trong quá trình
thủy phân và tách loại tanin đạt hiệu suất cao nhất nhưng vẫn giữ được dinh
dưỡng trong dịch ép quả điều.
Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang điều từ dịch ép quả điều sau khi
tách loại tanin.
* Ý nghĩa khoa học
Sử dụng enzym tanase để thủy phân tanin thủy phân trong dịch ép quả
điều là nghiên cứu rất mới, vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam
và thế giới sử dụng enzym này cho dịch ép điều.
Sử dụng kết hợp phương pháp sinh hóa (enzym tanase và gelatin) đã xử
lý tanin hiệu quả cao, giảm vị chát nhưng vẫn giữ được hàm lượng dinh dưỡng
trong dịch quả điều.
* Ý nghĩa thực tiễn
Tận dụng nguồn nguyên liệu đang bị vứt bỏ tạo thành sản phẩm có ích
giúp làm giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập cho nông dân, góp phần
đa dạng hóa sản phẩm cho ngành điều.

16. 3
Hình 1.1: Cây điều.
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐIỀU
1.1.1. Khái quát về cây điều
Phân loại thực vật:
Giới: Thực vật (Plantae)
Ngành: Thực vật có hoa (Angiospermae)
Lớp: Hai lá mầm thực sự (Eudicots)
Phân lớp: Phân lớp Hoa hồng (Rosids)
Bộ: Bồ hòn (Sapindales)
Họ: Đào lộn hột (Anacardiaceae)
Chi: Đào lộn hột (Anacardium)
Loài: Đào lộn hột (Anacardium occidental)
Cây điều (hình 1.1) có tên khoa học là Anacardium occidentale Linn.,
còn được gọi là cây đào lộn hột có nguồn gốc từ Brasil-khu vực Nam Mỹ. Cây
có đặc tính gỗ tốt, gây hiệu ứng cảnh quan. Quả có chứa các thành phần dinh
dưỡng tốt cho sức khỏe con người (vitamin, khoáng, hàm lượng polyphenol,...)
và có thể ăn được nên nhanh chóng được phổ biến rộng rãi trên khắp thế giới.
Điều là cây công nghiệp lâu năm có tuổi thọ lên tới 40 năm tuổi; cây
thường cho năng suất ổn định trong giai đoạn từ 10 đến 20 năm sau khi trồng.
Cây điều có thể sinh trưởng và phát triển từ vĩ độ 25o
Bắc đến 25o
Nam nhưng
vùng sản xuất chủ yếu từ vĩ độ 15o
Bắc đến 15o
Nam. Độ cao so với mặt nước
biển của vùng đất trồng phụ thuộc vào vĩ độ, địa hình và vùng khí hậu nhưng
thích hợp nhất là dưới 600 m so với mặt nước biển. Độ dài ngày và thời gian
chiếu sáng không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển, cây có thể sống
từ 5-45o
C nhưng nhiệt độ trung bình thích hợp nhất là khoảng 27o
C. Đồng thời
cây điều thích nghi với lượng mưa hàng năm biến động từ 400-5000 mm, thích
hợp nhất là 1000-2000 mm và ở cây cần ít nhất 2 tháng khô hạn hoàn toàn để
phân hóa mầm hoa. Độ ẩm tương đối ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát
triển ở cây điều, tuy nhiên nếu độ ẩm quá cao trong thời kỳ ra hoa có thể làm
gia tăng bệnh thán thư ở cây do bọ xít và muỗi gây ra. Trong khi đó độ ẩm

17. 4
tương đối thấp kết hợp với gió nóng sẽ gây khô bông và rụng quả non. Đất
trồng cây điều thích hợp nhất là các loại đất giàu chất hữu cơ, pH từ 6,3-7,3
không thích hợp với các loại đất ngập úng, nhiễm phèn, mặn, hay đất có tầng
canh tác mỏng [6].
Cây điều phát triển tốt ở những nơi có ánh sáng mạnh, thân cao khoảng
từ 3-8 m, trong điều kiện sinh trưởng tốt cây có thể cao tới 10 m. Thân và cành
cây thường có nhiều mủ, cành thường phát sinh theo chiều ngang, tán cây có
dạng hình dù. Rễ cây điều thuộc loại rễ cọc, các rễ ngang phát triển mạnh, ăn
sâu vào trong đất để tìm kiếm chất dinh dưỡng. Khi trồng nơi đất tơi xốp thì
chỉ cần sau 2 đến 3 tháng, cây có thể cắm sâu xuống 80 cm, sau khi trồng được
5 tháng, rễ cây ăn sâu vào đất tới 2 m. Tùy vào loại đất và khả năng sinh trưởng
của cây, bộ rễ có thể ăn sâu hàng chục mét. Vì vậy mà cây có khả năng chịu
hạn rất tốt, có thể sinh trưởng bình thường trong mùa khô từ 5-6 tháng. Bộ lá ở
cây thường tập trung ở đầu cành, lá thường có chiều dài từ 10-20 cm, chiều
rộng từ 5-10 cm, cuống lá ngắn. Phiến lá khá dày với những đường gân nổi rõ
đặc biệt là mặt dưới, khi còn non lá điều thường có màu đỏ hoặc hơi xanh nhạt,
khi già lá chuyển sang màu xanh đậm. Bộ tán của cây điều thường rất rộng, khi
cây trưởng thành thì bộ tán có thể rộng đến 5 m tính từ gốc [6].
Cây điều thường ra hoa vào lúc kết thúc mùa mưa chuẩn bị chuyển sang
mùa khô. Hoa điều có cả hoa đơn tính và hoa lưỡng tính, mọc thành từng chùm,
số lượng hoa mỗi chùm có khoảng từ vài chục hoặc hàng trăm. Hoa điều thường
có màu vàng hoặc trắng có 5 cánh, đối với hoa đực chỉ có nhị đực còn hoa
lưỡng tính thì có tới 8 đến 10 nhị đực và 1 nhụy cái. Thông thường thì chỉ có 1
nhị đực ở hoa lưỡng tính phát triển đầy đủ các chức năng và có khả năng tung
phấn. Hoa điều thường mọc ở đầu cành, bao gồm cả hoa đực lẫn hoa lưỡng
tính. Hoa thường chỉ thụ phấn bằng côn trùng hoặc gió, nở vào buổi sáng nhưng
trong lúc hoa đang nở có xuất hiện mưa thì bao phấn sẽ không thể nứt ra để
phấn rớt vào nên quá trình thụ phấn sẽ không xảy ra khiến mất mùa. Cây điều
sau 2-3 năm trồng mới thì bắt đầu trổ hoa, thời gian ra hoa thường kéo dài
khoảng 3 tháng [6].

18. 5
1.1.2. Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều
+ Trên thế giới [7]:
Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới.
(Nguồn: Various trade and government, 2016).
Trong những năm gần đây, hạt điều đã qua chế biến trở thành mặt hàng
cao cấp ngày càng được ưa chuộng và tiêu thụ mạnh trên khắp thế giới như:
Mỹ, Anh, Pháp, Nhật Bản,... Theo thống kê của FAO, hiện nay có 32 quốc gia
trồng điều với tổng sản lượng hạt điều thô trên toàn thế giới từ 1.500-1.600
ngàn tấn. Nhưng cây điều sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc
khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới - nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao, do vậy việc
canh tác cây điều được phân bố chủ yếu ở các nước (hình 1.2): Ấn Độ, Brasil,
Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Philippin, các nước ở Tây Phi và Đông Phi…
Sản lượng điều toàn cầu ở giai đoạn 2015-2016 đạt gần 3,25 triệu tấn hạt
điều tươi. Từ hình 1.3, có thể thấy rằng Tây Phi đứng đầu về sản lượng điều
toàn cầu (45%), tiếp theo là Ấn Độ (22%), Việt Nam (12%), Đông Phi (9%)
sau đó ở các nước: Brasil, Indonesia, Campuchia...Trong số những quốc gia sản
xuất và chế biến điều lớn nhất thế giới như: Ấn Độ, Brasil và Việt Nam… Việt
Nam lần đầu tiên vươn lên là nước chế biến và xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế
giới, chiếm thị phần trên 60% tổng giá trị xuất khẩu hạt điều toàn cầu, xếp trên
cả Ấn Độ và Brasil. Sản lượng chế biến đạt 1,65 triệu tấn hạt điều thô; xuất
khẩu 391.000 tấn nhân điều, đạt kim ngạch xuất khẩu 3,52 tỷ USD, tăng 7,8%
về lượng so với năm 2017. Với năng lực chế biến lớn nước ta phải nhập khẩu
điều thô từ các nước châu Phi, Campuchia… Trong đó các quốc gia thuộc khu
vực châu Phi sản lượng điều chế biến rất ít, hơn 90% lượng điều thô của các

19. 6
quốc gia thuộc khu vực này đều được xuất khẩu sang Việt Nam, Ấn Độ, Brasil.
Hiện nay các quốc gia châu Phi đang có nhiều nỗ lực nhằm gia tăng năng lực
chế biến hạt điều.
Theo số liệu của INC Global Statistics Review, nhu cầu về hạt điều nhân
trên thế giới giai đoạn 2009-2016 khá cao khoảng 6,1%, trong khi sản lượng
điều nhân thế giới giai đoạn 2005-2006 chỉ đáp ứng được khoảng ½ nhu cầu.
Nhu cầu tiêu thụ hạt điều chế biến qua nhiều thập niên ngày một gia tăng do ở
hạt điều mang lại hàm lượng dinh dưỡng và năng lượng cao. Cụ thể, các quốc
gia có mức tăng trưởng tiêu thụ nhanh nhất gồm: Liên Bang Nga, các nước
Trung Đông và Canada với lượng tiêu thụ điều nhân lần lượt là 15,6%, 8,7%
và 5,6%.
Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm
2015-2016 (nguồn: Various trade and government, 2016).
+ Ở Việt Nam
Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam
(nguồn Bộ NN&PTNT, 2017).

20. 7
Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tổng diện
tích trồng điều ở nước ta khoảng 337 nghìn hecta. Trong đó tỉnh Bình Phước
có hơn 134 nghìn hecta đang được sử dụng canh tác điều, chiếm khoảng 40%
diện tích trồng điều cả nước, cùng với đó là khoảng hơn 200 doanh nghiệp và
400 hộ kinh doanh tham gia vào khâu chế biến và xuất khẩu hạt điều. Điều đó
làm cho tỉnh này trở thành “thủ phủ” điều của cả nước [8].
Theo Tổng Cục Hải Quan Việt Nam, kết quả thống kê giá trị xuất khẩu
hạt điều của Việt Nam tăng qua các năm. Cụ thể, giá trị xuất khẩu năm 2007
đạt 654 triệu USD, năm 2008 đạt 920 triệu. Đến năm 2010, nước ta xuất khẩu
80.000 tấn hạt điều, đạt 1.136 triệu USD tăng đến 26% giá trị và 6% số lượng
so các năm trước. Thống kê của FAO năm 2017, cả nước chế biến hơn 1,6 triệu
tấn nguyên liệu nhưng nguồn cung trong nước chỉ đáp ứng được 220 nghìn tấn,
phần còn lại phải nhập khẩu và doanh thu vượt mốc 3,5 tỷ USD/năm, lần đầu
tiên vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều lớn nhất thế giới. Trong các năm gần
đây Mỹ trở thành thị trường xuất khẩu lớn nhất chiếm 34% lượng điều xuất
khẩu, theo sau là Trung Quốc (14%), Hà Lan (13%), Úc, Anh, Canada và một
số nước khác (hình 1.4). Theo Hiệp Hội Điều Việt Nam, nước ta được dự đoán
sẽ có doanh thu xuất khẩu điều liên tục tăng trong những năm tới đây [2].
2. QUẢ ĐIỀU
Ở cây điều sau khi hoa được thụ phấn thành công thì quả thật (hạt điều)
sẽ phát triển kích thước rất nhanh trong vòng 1,5 tháng đạt kích thước tối đa.
Từ đó quả ngừng phát triển chuyển sang phình to phần cuống quả tạo thành quả
giả, ở quả điều thường có hai phần là quả giả và quả thật (hình 1.5).
Quả thật (gọi là hạt điều) thường chỉ chiếm 10-15% khối lượng quả. Hạt
điều thường có dạng hình hạt đậu lớn, lớp vỏ ngoài thường có màu xám xanh
khi còn tươi và sau quá trình phơi khô sẽ chuyển sang màu nâu. Hạt điều thường
nhẵn có trọng lượng từ 3-5 g, để lấy được nhân hạt điều cần loại bỏ lớp vỏ hạt
(lớp vỏ hạt này thường chiếm tới 70% khối lượng hạt và có vỏ dày đến 2,5-3
mm), vỏ hạt cũng được chia làm 4 phần để bao bọc lấy nhân. Ngoài cùng là vỏ
ngoài rất dai và cứng, tiếp đến là vỏ giữa khá xốp, vỏ giữa thường chiếm 30%
trọng lượng vỏ, đây là phần chứa dầu của hạt điều. Để lấy được nhân điều chúng

21. 8
ta cần loại bỏ lớp vỏ này nhưng nó có chứa chất urushion rất độc với da người.
Cuối cùng là vỏ trong rất cứng sau đó mới đến lớp vỏ lụa mỏng bên ngoài bao
bọc lấy phần nhân màu trắng. Nhân điều có chứa nhiều dầu, chất béo, có hương
vị thơm ngon, vị bùi béo nên được sử dụng nhiều trong việc chế biến các loại
thực phẩm giàu dinh dưỡng [9].
Quả giả (thường gọi là quả điều) chiếm trọng lượng rất lớn từ 85-90%
khối lượng toàn quả, có dạng hình quả lê, khi chín thường có màu hồng hoặc
màu vàng, chiều dài khoảng 3-20 cm, chiều rộng từ 3-12 cm trọng lượng thường
từ 30-50 g. Ở quả điều chứa rất giàu đường (glucose, fructose), vitamin, khoáng
và một số axit amin, phenolic, axit hữu cơ, chất chống oxy hóa và được xem
như nguồn cung cấp năng lượng (bảng 1.1). Tuy nhiên ở quả chứa nhiều hàm
lượng tanin gây vị chát gắt, se khít vòm họng khi sử dụng nên sau thu hoạch
hạt điều hầu hết quả điều bị vứt bỏ (hình 1.6) [9].
Hình 1.5: Quả điều.
Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch.

22. 9
Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều [4].
STT Hợp chất Thành phần Đơn vị Giá trị
1 Đường
Sucrose, maltose, raffinose g/100g 6,3-9,9
Glucose, fructose g/100g 6,24-9,8
2 Vitamin Vitamin C mg/100mL 126-372
3 Khoáng
Ca, P, Fe mg/L 0,9-21,4
K Mg/L 1,53
Mg, Zn, Na mg/L 16-105
4
Axit, amino
axit...
Alanin, phenylalanin, serin, leucin,
axit glutamic, axit aspartic, proline,
mM 0,88-3,36
5
Axit gallic, axit protocatechuic,
lutein, zeinoxanthin, b-cryptoxanthin
mg/100mL 215-412
6 Polyphenol
Tanin g/100mL 0,22-0,58
Carotene mg/100g 0,03-0,74
7 Axit tự nhiên axit mallic, axit citric, axit lactic g/100mL 0,1-0,36
8 Tro g/100g 0,19-0,45
9 Tổng chất khô hòa tan o
Brix 7,4-12,8
Ở một số nước đã tận dụng quả điều để tạo ra các sản phẩm có ích nhưng
vẫn còn vị chát, mang lại giá trị kinh tế chưa cao như:
+ Ở Venezuela, quả được dùng làm thực phẩm như: ăn tươi, sử dụng trong
các tiệc cocktail quả nhiệt đới nhằm giúp làm tăng hàm lượng vitamin C [10].
+ Các loại mứt được chế biến từ quả điều nổi tiếng ở Brasil như: doce
emcalda (trái hầm nhừ trong xiro), doce (giống doce emcalda nhưng ở dạng cô
đặc), caju cristalizado (thịt trái đông lạnh tạo hình viên bi và được bao đường
bên ngoài), caju ameixa (trái được nấu và cô đặc đến khô trong xiro) và thạch.
Ngoài ra dịch quả được bổ sung mật ong để tạo thành loại nước ép từ quả điều.
Theo nghiên cứu về tính ổn định của sản phẩm, cho thấy sản phẩm đáp ứng tốt
các giá trị cảm quan trong suốt thời hạn sử dụng và đáp ứng thị hiếu người tiêu

23. 10
dùng. Tuy nhiên hàm lượng vitamin C có phần giảm mạnh ở cuối quá trình bảo
quản [10].
+ Tại Nigeria, 60% dịch điều được phối trộn với 40% nước ép cam cho sản
phẩm có chất lượng về hương và vị rất tốt [11].
Ngoài việc được sử dụng làm thực phẩm, người dân đã sử dụng quả điều
chín để diệt lăng quăng (bọ gậy). Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, chất
axit có trong quả đã ngăn cản quá trình sinh lý của ấu trùng muỗi làm cho chúng
bị chết. Ngoài ra dư lượng bã từ các ngành công nghiệp sản xuất nước ép quả
điều được sử dụng như một dạng bột trái cây thay thế cho bột mì trong các công
thức chế biến bánh quy. Giá trị pH, hàm lượng chất xơ và protein có sự thay
đổi đáng kể khi thay thế bằng bã quả điều và nhận được sự chấp nhận tốt từ
phía người tiêu dùng. Do đó, bã quả điều là một nguồn nguyên liệu giúp đa
dạng hóa các loại bánh và bổ sung một nguồn chất dinh dưỡng phù hợp [12].
1.3. TANIN
1.3.1. Định nghĩa
Tanin hay tannoit là một hợp chất polyphenol có trong thực vật, có khả
năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử
khác như: các amino axit, alkaloit... Phân tử lượng tanin phần lớn nằm trong
khoảng 500-5000 Da có trong vỏ, gỗ, lá và quả của những cây như: sồi, sú, vẹt,
thông, đước, chè…[13,14].
1.3.2. Phân loại và cấu trúc [15]
Cấu trúc hóa học của tanin rất phức tạp và không đồng nhất, tanin có thể
chia làm 2 loại chính: tanin thủy phân (tanin pyrogallic) và tanin ngưng tụ (tanin
pyrocatechic).
Tanin thủy phân là những este của gluxit, thường là D-glucose làm lõi
trung tâm với một hay nhiều axit trihiđroxibenzen cacboxylic. Khi thủy phân
bằng axit hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra glucose, hamamelose…
phần không phải đường là các axit thường gặp như: axit gallic được nối với
nhau theo dây nối dipeptid để tạo thành axit digallic, axit trigallic, axit ellagic,
axit luteolic… Tanin thủy phân bao gồm: Ellagitanin (hình 1.7) và Gallotanin

24. 11
(hình 1.8). Gallotanin là các tanin thủy phân đơn giản nhất có năm liên kết ester
giống nhau được, liên kết với lõi đường glucose.
Tanin ngưng tụ được tạo thành từ sự ngưng tụ các đơn vị flavan-3-ol
hoặc flavan 3,4-diol (hình 1.9), được xem là các oligomer hoặc polymer chứa
các đơn vị flavonoic (có thể chứa từ 2 đến 50 đơn vị flavonoic hoặc lớn hơn)
gắn với nhau bằng liên kết cacbon-cacbon nên không dễ bị thủy phân. Khi đó
dưới tác dụng của axit hoặc enzym thì không bị thủy phân mà tạo thành chất
đỏ tanin hay phlobaphen. Phlobaphen ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng
hợp kèm theo oxy hóa, do đó tanin pyrocatechic còn được gọi là phlobatanin.
Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin.
Gallotanin
Axit gallic
Ellagitanin
Axit hexahydroxydiphenic
Axit ellagic
Hình 1.8: Phản ứng thủy phân gallotanin.

25. 12
1.4. ENZYM TANASE
1.4.1. Định nghĩa và tính đặc hiệu [16]
Enzym tanase hay còn gọi là acyl tanin hydrolase (EC 3.1.1.20) là một
enzym thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là tanin, có khối lượng phân tử
khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc vào nguồn enzym.
Đặc hiệu phản ứng: enzym tanase chỉ có khả năng xúc tác cho phản ứng
phân cắt tanin thủy phân tạo thành chất chính là axit gallic.
Đặc hiệu cơ chất: enzym tanase chỉ lựa chọn tanin làm cơ chất trong phản
ứng xúc tác.
1.4.2. Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase [17]
Enzym này bao gồm hai chất nền là digallate và H2O, nhưng sản phẩm
chủ yếu là gallate. Cũng như protein, enzym có thể là protein đơn giản hoặc
protein phức tạp. Trên cơ sở đó phân enzym thành hai nhóm: enzym một thành
phần (enzym một cấu tử) và enzym hai thành phần (enzym hai cấu tử).
Phần protein của enzym hai thành phần được gọi là apoprotein hay
apoenenzym, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzym.
Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt
vào protein hoặc chỉ có thể lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần protein khi cho
thẩm thấu qua màng.
Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzym và coenzym được gọi là
haloenzym. Trong đó coenzym trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò
quyết định kiểu phản ứng mà enzym xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzym
đối với các yếu tố gây biến tính. Còn apoenzym có tác dụng nâng hoạt tính xúc
tác của coenzym quá quyết định đặc hiệu của enzym.
Cơ chế xúc tác của enzym tanase dựa theo thuyết của Michaelis-Menten
Flavan-3-ol Flavol-3,4-ol Catechin
Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic.

26. 13
phát triển vào năm 1913, được biểu diễn bằng sơ đồ sau:
E + S  ES  ES*  EP  E + P
Trong đó: E: enzym; S: Cơ chất (Substrate);
S*: Cơ chất hoạt hóa; P: Sản phẩm phản ứng (Product).
Trước hết, tạo phức trung gian ES, trong phức hợp này do ảnh hưởng của
enzym nên cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của
cơ chất bị phân cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ
chất bị biến đổi. Khi đó các liên kết bên trong trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng
hoạt hóa giảm, tốc độ phản ứng tăng lên [16].
Enzym tanase xúc tác phản ứng phân cắt gallotanin tạo phản ứng xúc tác
với b-1,2,3,4,6-pentagalloyl-O-D-glucopyranose tạo ra 5 phân tử axit gallic và
một phân tử glucose (hình 1.10). Từ lâu, người ta đã ứng dụng tanase để thủy
phân tanin giúp làm trong rượu vang, vì khi tanin bị oxy hóa bởi không khí sẽ
làm tăng độ đục của rượu vang. Ngoài ra sử dụng trong trà xanh tạo các axit
gallic giúp tăng hoạt tính kháng oxy hóa [18].
Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase.
1.4.3. Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [17]
Enzym tanase được tìm thấy ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm
và nước giải khát. Hiện tại, hầu hết các ứng dụng thương mại của enzym tanase
là sản xuất chè hòa tan, nơi nó được sử dụng để loại bỏ các chất hòa tan trong
nước, rượu vang, bia và cà phê có hương vị nước ngọt.
Ngoài ra tanase có vai trò quan trọng khác trong ngành thực phẩm là

27. 14
được sử dụng như chất nền để tổng hợp hóa học pyrogallol hoặc estate gallat,
dùng làm chất bảo quản. Axit gallic cũng được sử dụng trong tổng hợp enzym
của gallit propyl, chủ yếu được sử dụng như chất chống oxy hóa trong chất béo
và dầu cũng như trong đồ uống.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym:
Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng
đến hoạt tính enzym. Do bản chất hóa học của enzym là protein nên không bền
ở nhiệt độ cao bị mất hoạt tính ở nhiệt độ lớn hơn 70o
C. Ở nhiệt độ thấp, enzym
không bị mất hoạt tính mà chỉ giảm hoạt tính, khi nâng nhiệt độ trở lại nhiệt độ
tối ưu thì enzym lại hoạt động bình thường. Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên
10o
C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần cho đến 50o
C enzym bị giảm hoạt tính.
Ảnh hưởng của pH: Hoạt tính của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào pH của
môi trường. Phần lớn các enzym hoạt động khoảng pH= 4-9, trong đó trị số pH
mà tại đó enzym hoạt động mạnh nhất được gọi là pH tối ưu. Các enzym khác
nhau thường có pH tối thích không giống nhau, nó thay đổi tùy theo bản chất
hóa học, nồng độ cơ chất, nhiệt độ phản ứng và tính chất dung dịch đệm.
Ngoài ra hoạt tính xúc tác của enzym còn phụ thuộc vào sự có mặt của
các chất trong môi trường: chất hoạt hóa, chất kìm hãm và thời gian…
1.5. GELATIN
1.5.1. Định nghĩa
Gelatin là một protein được tạo bởi sự liên của hai hay nhiều axit amin
sắp xếp trên một chuỗi đường thẳng đây là hỗn hợp dị thể của các sợi polypeptit
sợi đơn và sợi đa. Mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ 300-
400 amino axit, hầu hết gelatin thương mại có khối lượng phân tử từ 15.000-
250.000 đvc [19].
1.5.2. Tính chất
Hoạt tính của gelatin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, nồng độ, thời gian và
phương pháp chế biến. Gelatin thương mại ở dạng tinh khiết, không mùi, không
vị, cứng, giòn, màu vàng rất nhạt đến hổ phách, có độ ẩm từ 9-12% và tỉ trọng
1,3-1,4.

28. 15
Tính chất gel-độ bền gel: đây là yếu tố quan trọng đánh giá chất lượng
gelatin khi đông, khả năng tạo gel được đặc trưng bằng độ Bloom. Độ Bloom
là khối lượng tính bằng gram cần thiết tác dụng lên bề mặt gel tạo bởi ống có
đường kính 14,7 mm để khối gel lún xuống 4 mm. Khối lượng gel có hàm lượng
gelatin 6,67%, được giữ ở 10o
C trong 16-18 giờ.
Độ nhớt tỉ lệ nghịch với nhiệt độ và tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch.
Dưới 25o
C, dung dịch sẽ tồn tại ở dạng gel (ngoại trừ nồng độ quá thấp). Trong
khoảng 25-29o
C, dung dịch vừa tồn tại ở dạng gel vừa tồn tại ở dạng dịch nhớt
hoặc ở dạng chất lỏng. Tại 40o
C, ở trạng thái này mạng lưới gelatin liên kết tối
đa với các polyphenol và tạo hợp chất ngưng tụ. Trên 40o
C, các phân tử gelatin
trở nên rời rạc, do mạng lưới rời rạc này nên khả năng ngưng tụ của gelatin với
các hợp chất polyphenol bị giảm, nếu có tăng nồng độ gelatin trong dung dịch
thì chúng vẫn không liên kết với nhau [19].
Tính lưỡng tính: Gelatin tồn tại trong dung dịch dưới dạng lưỡng cực có
khả năng hoạt động như một axit hay một bazơ.
Điểm đẳng điện: phân tử gelatin tích điện trong dung dịch kiềm hay axit,
chúng sẽ di chuyển trong điện trường. Ở pH mà không có sự di chuyển xảy ra
gọi là điểm đẳng điện, tại pH này dung dịch gelatin kém bền nhất và dễ kết tủa.
Theo nghiên cứu trên 2 loại gelatin (A và B), điểm đẳng điện của gelatin
loại A nằm trong khoảng pH 8-9 và phụ thuộc vào thời gian xử lý. Gelatin loại
B có điểm đẳng điện là 5,2 sau 4 tuần ngâm với nước vôi và giá trị này sẽ được
giảm dần xuống 4,8 nếu thời gian ngâm kéo dài hơn 4 tuần. Ngoài ra, điểm
đẳng điện còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dung dịch. Điểm đẳng điện
có thể xác định ở giá trị pH mà tại đó gelatin có độ kết tủa cực đại [19].
1.5.3. Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin
Các tương tác giữa tanin và gelatin là đặc tính phụ thuộc vào cấu tạo của
cả hai chất đó. Tương tác này thường dựa trên liên kết hydro, các nhóm phenolic
của tanin đóng vai trò là chất cho hydro, tạo liên kết hydro mạnh mẽ với các
nhóm carboxyl của gelatin.
Để tạo liên kết mạnh với gelatin, tanin phải đủ nhỏ để xâm nhập vào phân
tử gelatin và độ dài mạch phải đủ lớn để liên kết với chuỗi peptit tại nhiều điểm.

29. 16
Sự liên kết và tạo phản ứng kết tủa của phức chất tanin-gelatin này đạt cực đại
tại giá trị pH gần nhất với điểm đẳng điện của gelatin. Khi dung dịch có độ pH
cao sự liên kết không hình thành do ở các nhóm phenolic hydroxyl bị ion hóa
và các protein có điện tích âm thể hiện tính đẩy [19].
1.6. RƯỢU VANG
1.6.1. Giới thiệu chung về rượu vang
Rượu vang là loại thức uống có cồn được lên men từ dịch ép nho hay
dịch ép của các loại hoa quả khác nhờ hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật,
có độ cồn thường dao động từ 8,5-17% (v/v) [20].
Rượu vang có lịch sử lâu đời ở các nước phương Tây, theo các minh
chứng khảo cổ cho thấy trong các nghi lễ cổ xưa của các nước Ai Cập, Hy Lạp,
La Mã thì sự có mặt của rượu vang đóng vai trò rất quan trọng. Sản xuất rượu
vang dần dần được phát triển và đã được sử dụng phổ biến từ thế kỷ XV. Uống
rượu vang mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe vì trong thành phần chứa giàu
dinh dưỡng, mùi vị thơm ngon, làm kích thích vị giác…[21].
Các công trình nghiên cứu về lợi ích của rượu vang gần đây nhất cho
thấy uống rượu vang giúp giảm bớt nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, huyết
áp, đồng thời làm giảm mỡ máu, giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp 2
hơn là dùng bia và rượu. Khi uống một (hoặc vài) ly rượu vang trong một ngày
sẽ giảm tới 50% nguy cơ mắc bệnh tai biến mạch máu não hay đột quỵ. Phụ nữ
ở độ tuổi 20 trở lên nếu uống một (hoặc vài) ly rượu vang mỗi ngày thì bộ óc ít
bị nguy cơ suy thoái hơn so với những người không uống…[21].
1.6.2. Phân loại rượu vang [22]
Rượu vang là loại thức uống cực kì phong phú về nguồn gốc, tên gọi và
cách thưởng thức, do đó cách phân loại rượu vang cũng trở nên đa dạng. Một
vài cách phân loại rượu vang cơ bản như:
Phân loại theo lượng CO2: Theo Bùi Ái (2003), về mặt công nghệ, sản
phẩm rượu vang được chia thành hai nhóm lớn: nhóm rượu vang có gas và
nhóm rượu vang không có gas.
+ Nhóm rượu vang có gas: Rượu vang có gas tự nhiên do quá trình lên men

30. 17
tạo ra. Để giữ được gas (CO2) thường thực hiện quá trình lên men phụ trong
các chai, thùng hoặc hệ thống thùng kín và tùy thuộc vào điều kiện lên men
(nhiệt độ, thời gian) sẽ cho ra các loại rượu với mức độ chất lượng khác nhau.
Rượu vang có gas nhân tạo do nạp khí CO2 vào sản phẩm, có thể tạo ra nhiều
loại rượu vang khác nhau theo thị hiếu hoặc theo yêu cầu của thị trường tiêu
dùng.
+ Nhóm rượu vang không có gas: Rượu vang phổ thông được lên men tự
nhiên, không bổ sung cồn etylic trong quá trình công nghệ. Nhóm rượu vang
cao độ là những loại rượu vang có hàm lượng etanol cao hơn so với nhóm vang
phổ thông. Có thể dùng cồn tinh luyện để nâng cao hàm lượng etanol trong quá
trình công nghệ.
Phân loại theo màu:
+ Vang trắng: là các loại vang có màu trắng, gần như trong suốt.
+ Vang hồng: màu hồng nhẹ, làm từ nho giống vang đỏ nhưng tùy loại mà
có màu sắc khác nhau.
+ Vang đỏ: rượu có màu đỏ, thường gặp các giống nho có màu vỏ sậm.
Phân loại theo nồng độ cồn trong rượu vang:
+ Nồng độ cồn thấp: dưới 10% v/v.
+ Nồng độ cồn trung bình thấp: từ 10,5-11,5% v/v.
+ Nồng độ cồn trung bình cao: từ 11,5-14% v/v.
+ Nồng độ cồn cao: trên 14% v/v.
Phân loại theo độ ngọt:
+ Khai vị bán ngọt: Với etanol từ 14 -16% v/v và đường từ 5-12%.
+ Khai vị ngọt: Với etanol từ 15-17% v/v, đường từ 14-20%.
+ Khai vị rất ngọt: Với etanol từ 12-17% v/v, đường từ 21-35%.
Trong phạm của vi đề tài, mục tiêu là nghiên cứu chế biến rượu vang
điều không có gas thuộc nhóm vang phổ thông, có độ cồn trung bình cao
khoảng 11-14% v/v, mong muốn giữ được màu vàng nhạt của nguyên liệu.

31. 18
1.6.3. Tình hình sản xuất rượu vang
1.6.3.1. Trên thế giới [23]
Theo báo cáo của Ủy ban châu Âu (EC) cuối năm 2017, sản lượng nho
trên toàn lục địa này vào mùa vụ 2016-2017 giảm xuống mức thấp kỷ lục trong
36 năm qua, tác động nặng nề tới ngành sản xuất rượu vang của lục địa già.
Nguyên nhân là do hiện tượng thời tiết khắc nghiệt như mưa đá, sương giá xuất
hiện muộn vào mùa xuân cùng với thời tiết khô nóng của mùa hè khiến các
vườn nho tại nhiều khu vực bị hư hại. Thế nhưng ở năm 2018 có nhiều khởi
sắc, theo tổ chức rượu vang và rượu quốc tế (OIV) ước tính sản lượng rượu
vang trên toàn cầu đạt 279 triệu hectoliter (1 hectoliter tương đương 100 lít),
mức cao nhất kể từ năm 2000.
Trong đó, ở Italy thu hoạch nho trong niên vụ 2018 tăng 15% so với niên
vụ năm trước, giúp Italy trở thành nước sản xuất rượu vang lớn nhất thế giới.
Hiện nay ngành công nghiệp sản xuất rượu vang của nước Italy có 310.000
công ty và hơn 46,000 nhà sản xuất rượu vang.
Tiếp theo là Pháp với tổng sản xuất năm 2018 đạt 46,4 triệu hectoliter
(4,64 tỷ lít), trong đó rượu vang được làm từ nho hữu cơ đang ngày càng hấp
dẫn người tiêu dùng. Theo nhóm phân tích thị trường đồ uống của Anh (IWSR)
thì doanh thu rượu vang Pháp được làm từ nho hữu cơ sẽ tăng lên 17,3 triệu
thùng vào năm 2022, so với mức chỉ 4,6 triệu thùng năm 2012. Các vườn nho
trồng bằng phương pháp hữu cơ có giá thành sản phẩm là 6,14 euro/chai (7
USD/chai), cao hơn 33% so với các loại rượu truyền thống với giá 4,62
euro/chai (5,24 USD/chai). IWSR dự báo thu nhập từ rượu vang hữu cơ tại
Pháp sẽ sớm vượt mức 1 tỷ euro/năm (1,14 tỷ USD), viễn cảnh này cho thấy
mức độ ưa chuộng ngày càng tăng đối với các sản phẩm hữu cơ trên toàn cầu.
Bên cạnh hai nhà sản xuất rượu vang hàng đầu, các nhà sản xuất ở các nước
khác cũng góp phần xây dựng nền công nghiệp rượu vang như: Chi-lê, Mê-xi-
cô, Mỹ và Úc…
1.6.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu vào những
năm 80 của thế kỷ XX và được đánh dấu bằng nhãn hiệu vang “Thăng Long”

32. 19
trên thị trường nội địa với sản phẩm chủ yếu là vang ngọt từ nguyên liệu nho,
vải, dứa, mơ… Khoảng cuối năm 1999, một loại vang đỏ được lên men theo
công nghệ Pháp đã xuất hiện ở thị trường nội điạ, tạo tiếng vang mạnh với giá
thành phù hợp và đạt tiêu chuẩn Châu Âu với thương hiệu “Vang Đà Lạt”. Tên
thương hiệu được ghép từ chữ “Vang” trong từ rượu vang và tên một thành phố
du lịch nổi tiếng của Việt Nam. Sau đó số lượng các nhà máy sản xuất rượu
vang tăng lên, các chủng loại rượu vang đa dạng hơn nhưng chất lượng vẫn còn
thấp chưa cạnh tranh được với rượu vang nhập ngoại.
Theo thống kê năm 2015, ở nước ta có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và
“đóng chai” rượu vang với sản lượng 12-13 triệu lít/năm. Sản lượng đang dần
tăng trong 5 năm tới, trong đó công ty cổ phần vang Thăng Long sản xuất 10
triệu lít. Ngoài ra còn có các công ty cổ phần thực phẩm Lâm Đồng (Vang Đà
Lạt), công ty Anh Đào (Vang Anh Đào)… sản xuất các loại vang đỏ, vang trắng
và vang chát [21].
1.6.4. Cơ chế lên men rượu vang
Trong quá trình lên men rượu dưới tác dụng của các chất xúc tác sinh
học cung cấp năng lượng giúp cho tế bào vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi
chất tạo các sản phẩm. Thông thường có nhiều sản phẩm được tạo ra nhưng chủ
yếu có 4 loại chính đó là etanol, aldehyde, axit và ester được tạo thành với 2
hình thức lên men chính là lên men hiếu khí và kỵ khí [24]. Quá trình lên men
kỵ khí, cơ chất (chủ yếu là đường) trải qua chuỗi các phản ứng rất phức tạp để
chuyển hóa thành etanol dưới tác dụng của nấm men [22].
Các giai đoạn chuyển hóa đường thành rượu [25]:
+ Mục đích: để chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình tổng quát
sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 27 Kcal.
+ Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Qua một loạt chuỗi phản ứng phức
tạp với sự tham gia của hệ thống nhiều enzym, một phân tử glucose ban đầu sẽ
chuyển hóa thành hai phân tử axit pyruvic theo chu trình đường phân Embden-
Meyerhof-Parnas.
+ Giai đoạn 2 (Axit pyruvic bị decacboxyl hóa): Axit pyruvic dưới tác
dụng của enzym pyruvat decacboxylaza sẽ bị khử thành acetaldehyd và CO2.

33. 20
+ Giai đoạn 3: Acetaldehyd tiếp tục nhận H2 từ NAD-H2 tạo thành etanol
dưới tác dụng của enzym alcoldehydrogenaza của nấm men.
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
1.6.5.1. Nấm men
Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang phải có khả năng lên men
nhanh, không sinh ra các chất độc, chịu được độ cồn cao và có khả năng sinh
tổng hợp nhiều hợp chất hương đặc trưng. Loài Saccharomyces được sử dụng
phổ biến nhất [26] với các chủng thường gặp như:
Saccharomyces cerevisiae: Là loại nấm men được sử dụng phổ biến
trong lên men bia rượu (hình 1.11). Tế bào có dạng hình ovan hay elip, kích
thước (5-6)*(10-14) micromet, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và sinh bào
tử. Điểm nổi bật ở chủng nấm men này là chúng sử dụng được đường saccarose
nhờ enzym invertase tạo thành đường nghịch đảo. Tế bào nấm men chứa nhiều
vitamin (đặc biệt là B1 và B6), có khả năng chịu nhiệt cao, lên men mạnh, kết
lắng nhanh làm trong rượu, tạo ra các sản phẩm thứ cấp và tạo mùi vị đặc trưng
cho rượu vang [27].
Saccharomyces oviformis: Hình dạng và các yếu tố sinh trưởng giống ở
nấm men Saccharomyces cerevisiae (hình 1.12). Tuy nhiên, điểm khác là
Saccharomyces oviformis có khả năng lên men được dịch quả có hàm lượng
đường cao và lên men cạn kiệt đường, hình thức lên men nổi tạo thành màng
trên bề mặt dịch lên men [22].
Saccharomyces uvarum: Là một loại nấm men có ở các loại trái cây tự
nhiên, khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch malt. Về hình
thái chúng không khác với các loài khác (hình 1.13), lên men chìm và có thể
tạo ra độ cồn 12-13% (v/v) [28].
Yêu cầu đối với giống nấm men dùng để sản xuất rượu vang:
+ Có khả năng lên men cao, tạo rượu vang có hương vị thơm ngon.
+ Sử dụng đường gần như hoàn toàn.
+ Kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh.
+ Chịu được độ cồn, axit của môi trường cũng như các chất sát trùng.

34. 21
1.6.5.2. Ảnh hưởng của pH [29]
Nồng độ ion H+
trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của
nấm men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo
màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng
như chiều hướng của quá trình lên men. Khi đó pH của môi trường lên men ảnh
hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất, mức độ thẩm thấu cũng như điện tích
của vỏ tế bào vi sinh vật. Ở mỗi loài vi sinh vật thường có khả năng sinh trưởng
ngoài khoảng pH tối ưu. Nhưng khi tế bào vi sinh vật đột ngột thay đổi pH
trong tế bào chất để phù hợp với pH môi trường bên ngoài, dẫn đến màng sinh
chất bị vỡ làm ức chế hoạt tính của enzym hay protein màng.
Đồng thời pH cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và hoạt
động của vi khuẩn. Trong lên men, điều kiện pH tối ưu để nấm men sinh etanol
là 4,5-5. Nếu pH nằm trong khoảng 3-4 thì vi khuẩn bị ức chế, ngược lại nếu
pH cao hơn (5-6) sản phẩm tạo ra bị hư hỏng hay kém chất lượng do dễ bị
nhiễm khuẩn, các sản phẩm phụ sẽ được tạo ra nhiều.
1.6.5.3. Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy
Hầu hết các chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces trong quá trình
lên men rượu vang, thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí. Khi trong môi trường có đầy
đủ oxy thì nấm men sẽ phân hủy đường, dùng làm nguồn năng lượng và cấu
tạo tế bào tăng sinh khối. Nếu thiếu oxy thì nấm men sử dụng phần oxy hòa tan
trong môi trường để sinh trưởng, phát triển và chủ yếu là lên men.
Trong giai đoạn đầu lên men, yêu cầu hàm lượng oxy cao nhất để nấm
men sinh trưởng phát triển tăng sinh khối. Ngoài ra, nếu lên men trong môi
trường lớn thì người ta thường sục khí hoặc lắc để tăng lượng oxy cho nấm men
sinh sản. Ở giai đoạn sau, phải tạo môi trường yếm khí nhằm tránh hiện tượng
lên men giấm, đồng thời ức chế hoạt động của vi khuẩn làm hư hỏng rượu [28].
1.6.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong quá trình lên men, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt động sống của
nấm men Saccharomyces cerevisiae và chất lượng sản phẩm. Nhiều công trình
nghiên cứu cho rằng nhiệt độ trong khoảng:

35. 22
+ Từ 15-30o
C: thích hợp cho rượu vang trắng, nếu thấp hơn thì càng tốt.
+ Tại 25o
C: thích hợp cho rượu vang đỏ, nếu nhỏ hơn 15o
C quá trình diễn ra
rất chậm.
+ Từ 28-30o
C: là khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển tốt nhất.
+ Trên 30-35o
C: thì nấm men dại phát triển nhanh chóng.
+ Trên 40o
C: nấm men không tập hợp được năng lượng dự trữ, có thể chết
và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn axit axetic hoạt động [30].
1.6.5.5. Ảnh hưởng của nồng độ đường
Đường là cơ chất cần thiết cho quá trình lên men nên chịu ảnh hưởng
nhiều đến hiệu suất lên men. Nếu nồng độ đường trong môi trường cao hơn
30% thì sẽ kéo dài thời gian lên men dẫn đến quá trình lên men không triệt để.
Nguyên nhân do lượng rượu được tạo thành gây ức chế hoạt động của nấm
men. Bên cạnh đó, trong môi trường có nồng độ lên men quá thấp (<10%) thì
lượng rượu tạo thành ít, sản phẩm rượu vang có vị nhạt và dễ bị hư hỏng do
nhiễm vi sinh vật. Còn đối với nước quả thì đa số các loại nấm men đều hoạt
động bình thường ở môi trường có nồng độ đường từ 18-25%. Ngoài ra, có một
số chủng hoạt động ở môi trường có độ đường cao hơn, nhưng khi nhân giống
thường sử dụng môi trường có nồng độ đường thấp dưới 15% [31].
1.6.6.6. Ảnh hưởng của nồng độ etanol
Rượu là sản phẩm chính của quá trình lên men kỵ khí, thường thì nồng
độ cồn của rượu vang từ 10-14% v/v. Nếu nồng độ rượu tạo thành tăng quá cao
gây ức chế hoạt động của nấm men.
Khả năng sống sót và lên men trong môi trường có nồng độ cồn cao là
yêu cầu thiết yếu của chủng nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang.
Những chủng nấm men dại thì chúng chỉ sống được trong môi trường có nồng
độ cồn thấp, thường sinh trưởng chậm dần và giảm sự nảy chồi ở nồng độ cồn
2% v/v và có thể ngừng sinh trưởng ở nồng độ cồn 5% v/v [22].
1.6.6.7. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên men ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm tạo thành
ở rượu vang. Trong hai giai đoạn lên men, nếu thời gian quá ngắn thì có thể tạo

36. 23
độ cồn thấp và không đủ thời gian để hình thành hương, mùi vị đặc trưng của
rượu vang. Đối với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 5-20
ngày, thời gian lên men phụ và tàng trữ các loại rượu phải từ vài tháng trở lên.
Thời gian lên men chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: nhiệt độ lên men,
nồng độ đường, chủng nấm men,…Nếu nồng độ đường càng cao thì thời gian
lên men càng dài. Ngoài ra, lượng men ban đầu bổ sung cũng là một yếu tố
quyết định thời gian lên men. Với đa số các loại vang, lượng giống bổ sung vào
khoảng 3-10% v/v dịch lên men [28]. Do vậy mà việc xác định thời gian lên
men là điều hết sức quan trọng để đảm bảo quá trình lên men tối ưu cho ra sản
phẩm đạt chất lượng tốt nhất.
1.6.6.8. Ảnh hưởng của CO2
Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường được
tách làm 3 phần: một phần tồn tại trong môi trường, phần thứ hai sẽ nổi lên trên
bề mặt và phần còn lại được tích tụ thành một lớp màng có thể ngăn cách giữa
không khí và môi trường. Lớp màng ngăn này làm giảm khả năng sinh sản của
nấm men nhưng vẫn lên men bình thường. Nếu hàm lượng khí CO2 cao sẽ gây
ức chế cho quá trình lên men nhưng lại có tác dụng tốt khi CO2 được thoát ra
ngoài sẽ khuấy động môi trường và kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm
men, giúp quá trình lên men diễn ra nhanh chóng. Theo nghiên cứu của Miuler-
Thurrau: Hàm lượng CO2 trong rượu vang đạt 0,25% trọng lượng thì sẽ gây ức
chế sự sinh sản của nấm men, đạt đến 1,5% trọng lượng thì nấm men không
sinh sản được [31].

37. 24
Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian
Thời gian thực hiện: 02/05/2018 đến 08/09/2019.
2.1.2. Địa điểm
Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Hóa lý - Phân tích, Viện
Công nghệ Hóa học và phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, Viện Sinh học
Nhiệt đới.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dịch ép quả điều
Quả điều chín vàng sau khi tuyển chọn và thu hái tại tỉnh Bình Phước
(tháng 5/2018) được vận chuyển về phòng thí nghiệm, tiến hành rửa sạch để
ráo, dùng máy ép trục vít để ép thu lấy dịch quả (hình 2.1). Dịch ép quả điều
được cho vào chai nhựa 5 lít đóng kín và bảo quản ở nhiệt độ -10o
C trong tủ
đông, khi cần sử dụng dịch ép được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (25-30o
C).
2.2.2. Enzym tanase
Enzym tanase (EC 3.1.1.20) ở dạng bột trắng chuyên dùng trong chế biến
thực phẩm, từ nhà sản xuất công ty Biochemifa Kikoman, Nhật Bản.
Bã
Dịch
Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít.

38. 25
2.2.3. Gelatin
Gelatin thực phẩm được sử dụng trong đề tài có màu vàng, hạt tròn được
cung cấp từ công ty phụ gia thực phẩm Sài Gòn.
2.2.4. Vi sinh vật
Saccharomyces uvarum 664 được cung cấp từ phòng thí nghiệm hóa thực
phẩm trường Đại học California David, Mỹ.
Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 được cung cấp từ nhà sản xuất
công ty Lalvin, Canada.
2.3. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.3.1. Môi trường
- Môi trường nhân giống: Dịch điều đã xử lý đưa về 14 o
Brix, pH=4,5,
thanh trùng ở 75o
C trong 15 phút, dùng làm môi trường nhân giống nấm men.
- Môi trường Sabouraud (SBD): Dextrose 40 g, peptone 10 g, agar 5 g,
nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 o
C), tiệt trùng ở 121 o
C trong15 phút dùng
để nhân giống nấm men.
- Môi trường PDA: Potatoes 200 g, dextrose 20 g, agar 15 g, nước vừa
đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 o
C), tiệt trùng ở 121 o
C trong15 phút dùng định lượng
nấm men, nấm mốc.
- Môi trường PCA: Casein peptone 5g, yeast extract 2,5 g, dextrose 1 g,
agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7 ± 0,2 (25 o
C), tiệt trùng ở 121 o
C trong 15
phút dùng để định lượng vi khuẩn hiếu khí.
- Môi Trường TSC: Tryptone 15 g, soya peptone 5 g, meat extract B 5 g,
yeast extract 5 g, sodium metabisulphite 1g, ferric ammonium citrate 1g, agar
15g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7,6 ± 0,2 (25 o
C), tiệt trùng ở 121 o
C trong 15 phút
dùng để định lượng vi khuẩn Clostridium.
- Đĩa petrifim 3M (Mỹ) có chứa sẵn các thành phần dinh dưỡng khô và
chất tạo đông, dùng định lượng vi khuẩn Escherichia coli và Coliform.
2.3.2. Hóa chất
- Hóa chất thực phẩm:
+ Đường tinh luyện thương phẩm từ nhà máy đường Biên Hòa.

39. 26
- Hóa chất tinh khiết:
+ Folin-ciocalteu; Potassium iodide (KI); 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl
(DPPH); Axit gallic; Potassium ferric cyanide (K3[Fe(CN)6]); Axit tricloacetic
(TCA); Iốt (I2); Monosodium phosphate (NaH2PO4); Disodium phosphate
(Na2HPO4); Sulfo-indigocamine; Ferric chloride (FeCl3); Natri cacbonat
(Na2CO3); Axit citric; Phenolphtalein của hãng Merck - Đức.
+ Potassium pemanganate (KMnO4) 0,1N; Sodium hydoxide (NaOH) 0,1N;
hồ tinh bột của công ty hóa chất vật liệu điện Cemaco Việt Nam.
2.3.4. Dụng cụ và thiết bị
− Bình Schott
− Máy đo pH Hanna
− Túi lọc vải
− Kính hiển vi
− Bộ chưng cất cồn
− Máy đo OD- HACH
− Buồng đếm hồng cầu
− Máy ép trục vít
− Máy lắc
− Máy khuấy từ
− Nồi hấp tiệt trùng
− Bình định mức 25 mL
− Bình tỷ trọng
− Cân phân tích Satorius
− Khúc xạ kế Atago
− Tủ đông Sanaky 400L
− Thiết bị ly tâm
4500 vòng/phút
− Thiết bị sắc ký lỏng
hiệu năng cao 1260
(HPLC)
− Thiết bị đo cường
độ màu Abs -
DR/2000.
2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.4.1. Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu
- Mục đích: Xác định một số thành phần dinh dưỡng ban đầu ở dịch ép
quả điều.
- Cách thực hiện: Dịch ép quả điều sau khi được rã đông đưa về nhiệt độ
phòng (28-30o
C) tiến hành phân tích xác định một số thành phần dinh dưỡng
theo bảng 2.1.
2.4.2. Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả
điều và hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin
- Mục đích: Xác định nhiệt độ, pH ở dịch ép quả điều và hàm lượng
enzym tanase bổ sung phù hợp, để phản ứng thủy phân tanin bằng enzym tanase
đạt hiệu quả cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm:

40. 27
+ Thí nghiệm hai yếu tố, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với các nghiệm thức
theo bảng 2.2, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều.
STT Chỉ tiêu Phương pháp
1 Tanin Chuẩn độ
2 Đường tổng Khúc xạ kế
3 Axit tổng số Chuẩn độ
4 pH Máy đo pH
5 Tổng polyphenol Folin – Ciocalteu
6 DPPH So màu
7 TSS TCVN 9462-2012
8 Vitamin C Chuẩn độ
9 Canxi (Ca) AAS - hấp thu nguyên tử
10 Magie (Mg) AAS - hấp thu nguyên tử
11 Sắt (Fe) AAS - hấp thu nguyên tử
12 Kẽm (Zn) AAS - hấp thu nguyên tử
13 Photpho (P) AAS - hấp thu nguyên tử
14 Kali (K) AAS - hấp thu nguyên tử
Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến
hoạt tính của enzym tanase.
Giá trị pH
4 4,5 5 5,5
Nhiệt độ
(o
C)
30 NT1 NT2 NT3 NT4
40 NT5 NT6 NT7 NT8
50 NT9 NT10 NT11 NT12
+ Sau khi xác định giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho phản ứng thủy phân bằng

41. 28
enzym, tiến hành thí nghiệm một yếu tố để xác định ảnh hưởng của hàm lượng
enzym tanase, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase.
Nghiệm thức Hàm lượng enzym tanase (ppm)
NT1 50
NT2 100
NT3 200
NT4 300
NT5 400
NT6 500
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Sử dụng máy đo pH để điều chỉnh dịch mẫu về pH tương ứng với từng
nghiệm thức (bảng 2.2) bằng dung dịch Na2CO3 10% và axit citric 10%. Điều
chỉnh nhiệt độ bằng cách cho dịch ép quả điều vào bể ổn nhiệt.
+ Sau khi xác định pH và nhiệt độ thích hợp, tiến hành bổ sung enzym tanase
ở các hàm lượng như bảng 2.3 để xác định hàm lượng enzym tanase thủy phân
tanin đạt hiệu quả cao nhất.
- Đánh giá hoạt tính của enzym tanase thông qua các chỉ tiêu theo dõi như sau:
Hàm lượng tanin, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa theo hai
chỉ số: DPPH (IC50) và năng lực khử (giá trị ABS700), xác định pic của axit
gallic được tạo thành.
2.4.3. Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở
dịch ép quả điều đến hiệu suất tách loại tanin.
- Mục đích: Dịch ép quả điều sau khi thủy phân bằng enzym tanase, xác
định hàm lượng gelatin cần bổ sung và nhiệt độ ở dịch ép quả điều phù hợp để
hiệu suất tách loại tanin đạt hiệu quả cao nhất.
- Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm một yếu tố, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần (bảng 2.4).

42. 29
- Tiến hành thí nghiệm
+ Dịch ép quả điều sau khi bổ sung hàm lượng gelatin theo bảng 2.4, thời gian
30 phút, tiến hành lọc để thu lấy dịch. Dịch thu được đem xác định hàm lượng
tanin còn lại, nhằm chọn ra hàm lượng gelatin phù hợp.
+ Từ hàm lượng gelatin được chọn cho vào dịch ép quả điều tại các khoảng
nhiệt độ từ 30-60o
C, nhằm chọn ra khoảng nhiệt độ thích hợp ở dịch ép quả
điều để đạt hiệu suất tách loại tanin cao nhất.
Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại
tanin trong dịch ép quả điều.
Nghiệm thức Hàm lượng gelatin (g/L)
NT1 1
NT2 2
NT3 3
NT4 4
NT5 5
2.4.4. Xác định một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều
sau khi tách loại tanin
- Mục đích: So sánh thành phần dinh dưỡng trước và sau khi tách loại
tanin nhằm đánh giá được vai trò hoạt động của enzym tanase trong quá trình
thủy phân tanin.
- Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm xác định thành phần dinh dưỡng được
thực hiện giống ở nội dung 2.4.1.
2.4.5. Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men
thích hợp cho quá trình lên men dịch ép quả điều
- Mục đích: Đánh giá chất lượng và khả năng sinh trưởng của các chủng
nấm men khảo sát. Đồng thời xác định môi trường nuôi cấy và chủng nấm men
phù hợp để lên men rượu vang điều.
- Bố trí thí nghiệm: Nấm men được nuôi cấy lắc trong môi trường
Sabouraud và môi trường dịch điều ở nhiệt độ phòng (28o
C), theo bảng 2.5.
- Tiến hành thí nghiệm:

43. 30
+ Môi trường dịch ép quả điều sau khi tách loại tanin được điều chỉnh bằng
đường để đưa về hàm lượng chất khô hòa tan là 14o
Brix. Chuẩn bị 200 mL từng
loại dịch môi trường để nhân giống nấm men, trong đó môi trường dịch điều
được thanh trùng 75o
C trong 15 phút và môi trường Sabouraud được tiệt trùng
15 phút ở nhiệt độ 121o
C, làm nguội. Lượng nấm men ban đầu bổ sung ở mỗi
bình là 4,2x106
cfu/mL. Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng tế bào nấm men trong 1 mL
canh trường được xác định bằng phương pháp đếm trên buồng đếm hồng cầu
với thời gian 4 giờ/1 lần trong 40 giờ.
+ Sau khi chọn môi trường và thời điểm dừng để nhân giống nấm men, chuẩn
bị 2 bình Schott chứa 200 mL dịch điều đưa về 22o
Brix, tại pH dịch điều
(pH=4,5). Sau đó cấy men giống ở 2 chủng nấm men vào trong dịch lên men
với mật độ 1,04x107
cfu/mL [31], tiến hành lên men chính trong 10 ngày. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần.
- Chỉ tiêu theo dõi:
+ Thời gian số lượng tế bào nấm men trong hai môi trường nuôi cấy sinh
trưởng và phát triển đạt mật độ cao nhất, chọn môi trường nuôi cấy thích hợp.
+ o
Brix, hàm lượng axit tổng số, pH và độ cồn tạo thành nhằm chọn ra chủng
nấm men phù hợp để lên men rượu vang điều.
Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men.
STT Chủng nấm men
Môi trường
Sabouraud
Môi trường
dịch điều
1 Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 NT1 NT2
2 Saccharomyces uvarum 664 NT3 NT4
2.4.6. Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang
điều
- Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của ba yếu tố (bảng 2.6) trong quá
trình lên men chính. Qua đó, ở bảng 2.7 chọn được các giá trị tối ưu: o
Brix (hàm
lượng chất khô), pH và tỉ lệ men ở dịch ép quả điều để hiệu suất tạo cồn của
quá trình lên men là cao nhất. Ở đây, (+): giá trị cận trên, (-): giá trị cận dưới,
(A): giá trị trục thấp, (a): giá trị trục cao, (0): giá trị tại tâm. Để xác định giá trị
tối ưu cho quá trình lên men, kết quả phân tích khớp với phương trình đa thức

44. 31
bậc 2 bao gồm phần tuyến tính bậc 1, bậc 2 và tương tác ba yếu tố bậc 1 bằng
phương pháp hồi quy đa biến. Mô hình toán học sử dụng để xác định giá trị tối
ưu cho các yếu tố có dạng như sau:
Y = b1X1 + b2X2 +b3X3+ b4X1X2 + b5X1X3 + b6X2X3 + b7X1X2X3 + b8X1
2
+
b9X2
2
+ b10X3
2
Trong đó: b1, b2, b3, b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10 là hệ số hồi quy. X1; X2; X3 là yếu
tố thí nghiệm cần tối ưu. Y: chỉ số theo dõi sau quá trình lên men.
Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính.
Biến (yếu tố) Giá trị biến đổi
X1 (pH) 4 4,5 5
X2 (o
Brix) 20 22 24
X3 (tỉ lệ men) 4 7 10
- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm tối ưu hóa được thực hiện theo phần mềm
JMP bằng phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình CCD-Uniform Precision
(Central Composite Design-CCD) được trình bày theo bảng 2.7 với 16 nghiệm
thức bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
- Tiến hành thí nghiệm:
+ Chuẩn bị dịch lên men: Cho 200 mL dịch điều đã tách loại tanin vào 16
bình Schott đã được tiệt trùng 121o
C. Điều chỉnh hàm lượng chất khô (o
Brix)
bằng đường tinh luyện và pH bằng dung dịch axit citric 10% và dung dịch
Na2CO3 10% ở mỗi bình đạt các giá trị theo bảng 2.7. Sau đó, tất cả các bình
được thanh trùng ở nhiệt độ 75o
C trong vòng 15 phút.
+ Nhân giống và cấy men: Tiến hành nhân giống nấm men đã chọn, cấy men
vào bình Schott ngay tại điểm dừng đã xác định. Trong đó, tỉ lệ men (v/v) bổ
sung dựa vào tỷ lệ của các nghiệm thức với mật độ ở bình nhân giống là
4,16x1010
cfu/mL.
+ Lên men: Tiến hành lên men chính ở nhiệt độ phòng (28-32o
C) trong điều
kiện kỵ khí và kết thúc quá trình sau 7 ngày.
- Chỉ tiêu theo dõi: Độ biến thiên các chỉ tiêu: o
Brix, pH, axit và độ cồn
tạo thành ở mỗi ngày trong 7 ngày lên men chính.

45. 32
Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở
dịch ép quả điều.
2.4.7. Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều
Sau khi thực hiện quá trình lên men dịch ép quả điều đã tách loại tanin
theo điều kiện tối ưu hóa. Tiến hành xây dựng quy trình sản xuất rượu vang
điều. Sản phẩm rượu vang điều tạo thành phù hợp theo tiêu chuẩn rượu vang
của Việt Nam (TCVN 7045:2013).
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1. Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal
Dùng pipet hút 10 mL dịch mẫu + 1 mL chất chỉ thị indigo-carmine cho
vào bình tam giác 250 mL + 100mL nước cất 2 lần. Sau đó, chuẩn độ bằng
dung dịch KMnO4 0,1 N cho đến khi dịch trong bình chuyển sang màu vàng
ánh kim [32]. Hàm lượng tanin: Tanin (mg/100mL) =
m
VV 100*025,0*)1( −
STT Pattern 0Brix (X1) pH (X2) Tỉ lệ men (%- X3)
1 −−− 20 4 5
2 −−+ 20 4 10
3 a00 20 4,5 7,5
4 −+− 20 5 5
5 −++ 20 5 10
6 0a0 22 4 7,5
7 00a 22 4,5 5
8 000 22 4,5 7,5
9 000 22 4,5 7,5
10 00A 22 4,5 10
11 0A0 22 5 7,5
12 +−− 24 4 5
13 +−+ 24 4 10
14 A00 24 4,5 7,5
15 ++− 24 5 5
16 +++ 24 5 10

46. 33
Trong đó: V1: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ
V: là lượng KMnO4 dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng
m: là lượng mẫu được chuẩn độ (mL)
0,025 là lượng 1mL KMnO4 phản ứng với 1mL tanin [33].
2.5.2. Xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol ở dịch ép quả điều được xác định theo phương
pháp Folin-Ciocalteu [34], dựa trên nguyên tắc: Thuốc thử Folin-Ciocalteu
chứa các chất oxy hóa là axit phospho-vonframic có khả năng khử các nhóm
hydroxy phenol dễ bị oxy hóa trong dịch quả sinh ra màu xanh của vonfarm và
molypden có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 765 nm.
Tiến hành pha loãng mẫu với nồng độ phù hợp, hút 1mL mẫu cho vào
ống nghiệm + 3mL Folin-Ciocalteu 10%, để trong 4 phút rồi bổ sung thêm 4mL
Na2CO3 10%, lắc đều. Để dung dịch khoảng 60 phút trong bóng tối, sau đó đem
đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 765 nm.
Đường chuẩn axit gallic được xây dựng từ dung dịch chuẩn (0, 10, 20,
30, 40, 50 mg GAE/100mL). Hàm lượng polyphenol được xác định dựa trên
đường chuẩn axit gallic tương đương mg GAE/100mL dịch ép (bảng 2.8). Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần.
Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic.
ABS
Hàm lượng
(mg/100mL)
0 0
0,171 10
0,362 20
0,561 30
0,748 40
0,945 50
y = 52,569x + 0,5815
R² = 0,9996
0
10
20
30
40
50
60
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Hàmlượngaxitgallic(mg
GAE/100mL)
ABS

47. 34
2.5.3. Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1-
picrylhydrazyl)
Phương pháp DPPH được xây dựng dựa vào khả năng hoạt động của các
chất chống oxy hóa, các electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu
mạnh nhất ở bước sóng 517 nm, bắt màu tím. Khi các electron này kết hợp với
hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển
từ màu tím sang màu vàng. Khả năng bắt gốc tự do của một chất càng cao thì
sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm có giá trị càng thấp và
ngược lại [35].
Tiến hành pha loãng dịch mẫu theo các nồng độ thích hợp, lấy 0,2 mL
dịch mẫu + 3 mL cồn + 2 mL DPPH 0,3 mM, lắc đều. Sau đó ủ trong bóng tối
60 phút, tiến hành đo độ hấp phụ quang học ABS ở bước sóng 517 nm. Khi đó
khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:
(%) = 100 x (AMT - Asp)/AMT
Trong đó: AMT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch ép
Asp: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch ép.
Giá trị IC50 là nồng độ của dịch ép quả điều khử được 50% gốc tự do
DPPH ở điều kiện xác định. Nồng độ 9,6 µg/mL là giá trị IC50 của vitamin C
được khảo sát tại điều kiện phòng thí nghiệm. Giá trị IC50 là nồng độ mà tại đó
vitamin C khử 50% gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử
gốc tự do DPPH càng cao.
2.4.4. Xác định năng lực khử [36]
Quy trình khảo sát năng lực khử được dựa trên nguyên tắc: Dịch mẫu thử
sẽ khử ion Fe3+
trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+
trong
phân tử (K4[Fe(CN)6]). Khi bổ sung FeCl3, Fe3+
phản ứng với ion ferrocyanid
tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]3) có màu xanh dương. Sau
đó đo độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm, nồng độ dịch mẫu cho giá trị tại độ hấp
phụ quang là 0,5 được gọi là EC50, nếu giá trị mật độ quang OD phản ánh khả
năng khử của mẫu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu càng cao.
Quy trình khảo sát năng lực khử được tiến hành như sau: 1 mL mẫu thử
ở các nồng độ khảo sát + 2,5 mL dung dịch đệm phosphate 0,2M (pH = 6,6), ủ

48. 35
ở nhiệt độ 50o
C trong thời gian 20 phút. Sau đó, mỗi ống nghiệm được bổ sung
thêm 2,5 mL dung dịch axit tricloacetic 10%, lắc đều. Lấy 2,5 mL dung dịch
trên, thêm 2,5 mL nước cất và 0,5 mL dung dịch FeCl3 0,1% lắc đều rồi đo độ
hấp thụ quang phổ.
2.5.5. Xác định hiệu suất tách loại tanin
Thực hiện chuẩn độ theo phương pháp Lowenthal để xác định hàm lượng
tanin ban đầu và còn lại khi dùng enzym tanase kết hợp với gelatin ở dịch ép
quả điều. Hiệu suất tách loại tanin: H(%) = (1 -
T1
T2
) x 100
Trong đó: T1: làm hàm lượng tanin còn lại (mg/100ml).
T2: làm hàm lượng tanin ban đầu (250 mg/100ml).
2.5.6. Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (o
Brix) [37]
Dụng cụ: Khúc xạ kế Atago thang đo 0-32o
Brix.
Cách sử dụng: Dùng nước cất rửa sạch và làm khô bề mặt kính bằng giấy
mềm, sau đó điều chỉnh nồng độ khô về 0, để đo hàm lượng chất khô của dung
dịch thì thay nước cất bằng dung dịch cần đo. Quan sát và đọc nồng độ chất
khô qua ống kính bằng vạch phân chia vùng tối và vùng sáng trên thang đo.
Sau khi đọc xong, rửa kính bằng nước cất và lau khô bằng giấy mềm.
2.5.7. Xác định pH
Dụng cụ: Để xác định pH sử dụng máy đo pH Mettler Toledo.
Cách sử dụng: Rửa sạch điện cực bằng nước cất, lau khô bằng giấy thấm.
Nhúng điện cực vào nước cất để ổn định pH=7, để đo pH mẫu thì thay nước cất
bằng dung dịch cần đo và đọc giá trị trên màn hình. Sau khi đọc xong rửa sạch
điện cực bằng nước cất, lau khô bảo quản điện cực bằng dung dịch KCl 3M.
2.5.8. Xác định hàm lượng axit tổng số [37]
Nguyên tắc: Độ chua toàn phần được xác định dựa vào phản ứng với
kiềm nên dễ dàng chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N hay KOH 0,1 N chuẩn với chất
chỉ thị màu là phenolphthalein.
Cách thực hiện: Hút 10 mL mẫu cho vào bình tam giác 250 mL, thêm 20
mL nước cất và 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% lắc đều rồi chuẩn độ bằng

49. 36
NaOH 0,1N đến khi dung dịch có màu hồng nhạt bền trong 30 giây.
Công thức tính hàm lượng axit tổng: X = (V * K * 1000) /V1
Trong đó: V - thể tích NaOH 0,1N (mL)
V1 - thể tích mẫu hút để chuẩn độ (mL)
K - hệ số axit sulfuric bằng 0,0049
2.5.9. Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu [38]
Cách tiến hành: Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm, chuẩn bị ống nghiệm
đựng dung dịch huyền phù nấm men đã được pha loãng với tỷ lệ thích hợp. Lấy
một ít dịch cho vào khe ở mép giữa buồng đếm, tránh tạo bọt khí, chỉnh kính
hiển vi với vật kính 40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường
sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4×4 = 16 ô). Sau đó tiến hành đếm
số tế bào trên 5 ô vuông lớn đại diện (5 vuông theo đường chéo hoặc 4 ô vuông
ở bốn góc và 1 ô trung tâm). Và tính toán theo công thức:
N = [(a/b) * 400/0,1] * 103
*10n
Trong đó: N: Số lượng tế bào trong 1 mL dung dịch huyền phù nấm men
a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn
b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16×5 = 80 ô vuông nhỏ)
400: Tổng diện tích số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm
0,1: Thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3
) chứa trên ô trung tâm
103
: Số chuyển mm3
thành mL (1000mm3
= 1mL)
10n
: độ pha loãng mẫu
2.5.10. Xác định độ cồn trong rượu [37]
Nguyên tắc: Xác định tỷ số giữa khối lượng chất lỏng và nước cất ở cùng
thể tích.
Cách thực hiện: Cho vào bình cầu 100 mL hỗn hợp dung dịch gồm: 50
mL nước cất và 50 mL dịch điều lên men. Tiến hành chưng cất thu cồn đến khi
đủ 30 mL dung dịch thì ngừng chưng cất. Rửa sạch bình tỉ trọng (dung tích 25
mL) bằng nước cất, tráng kỹ bằng cồn 96o
, sau đó sấy khô, hút ẩm. Làm lạnh
đến 20o
C, lau khô và cân khối lượng bình (m1). Cho nước cất vào bình tỉ trọng,
làm lạnh đến 20o
C, cân khối lượng (m2). Tiếp theo tráng bình bằng cồn 96o
và

50. 37
sấy nhẹ cho khô, hoặc tráng lại bằng cồn cất được. Cho cồn cất được vào bình,
thao tác như khi cân nước cất để xác định khối lượng bình và cồn (m3). Tỷ trọng
của rượu so với nước cất ở nhiệt độ 20o
C được xác định:
𝑑20 =
𝑚3 − 𝑚1
𝑚2 − 𝑚1
Trong đó: m1: Khối lượng bình tỷ trọng (g)
m2: Khối lượng bình và nước ở 20o
C (g)
m3: Khối lượng bình và cồn ở 20o
C (g)
Kết quả thu được tra bảng xác định độ cồn theo tỷ trọng của etanol ở 20o
C.
2.5.11. Đánh giá cảm quan [39]
+ Cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm: được sử dụng để đánh
giá tổng quát mức chất lượng của sản phẩm so với tiêu chuẩn hoặc so với một
số sản phẩm cùng loại trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan: độ trong, màu sắc, mùi
vị (bảng 2.9). Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm,
giá trị điểm tăng theo mức chất lượng.
Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng.
Chỉ tiêu Hệ số trọng lượng
Độ trong và màu sắc
Mùi
Vị
0,8
1,2
2
Do mỗi chỉ tiêu có vai trò khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng chung
của sản phẩm nên các giá trị của mỗi chỉ tiêu được nhận thêm một giá trị tương
ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì hệ số trọng
lượng cao hơn, thường được xác định theo kinh nghiệm, phương pháp điều tra
kết hợp với phương pháp chuyên gia trên cơ sở thống kê.
Khi đánh giá chất lượng cảm thì điểm cảm quan được dùng hệ điểm 5
(từ 0-5), xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc. Trong đó điểm 0 tương ứng
với chất lượng sản phẩm bị hỏng, còn điểm từ 1-5 ứng với mức khuyết điểm
giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có sai lỗi trong tính chất đang xét.

51. 38
Tổng hệ số trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho một sản phẩm
bằng 4. Chất lượng sản phẩm là điểm trung bình của từng chỉ tiêu nhân với hệ
số trọng lượng của nó. Hội đồng đánh giá gồm có 10 người, mỗi người được
phát một phiếu đánh giá theo 6 mức đánh giá chất lượng sản phẩm (bảng 2.10).
Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm.
Bậc Điểm Tính chất
1 0 – 3,9 Hỏng
2 4,0 – 7,1 Rất kém
3 7,2 – 11,1 Kém
4 11,2 – 15,1 Trung bình
5 15,1 – 18,5 Khá
6 18,5 – 20 Tốt
+ Phép thử cho điểm thị hiếu: Phép thử gồm hai mẫu được chuẩn bị để so
sánh mức độ ưa thích của người thử đối với hai sản phẩm (không so sánh về
cường độ của một tính chất cảm quan nào đó). Thang điểm thị hiếu từ 1 đến 9
tương ứng: cực kỳ không thích đến cực kỳ thích. Giá trị điểm trung bình của
từng sản phẩm có thể so sánh nhờ chuẩn t.
Chuẩn bị mẫu và mời người thử, mỗi người nhận được hai mẫu rượu vang
điều có ký hiệu trên ly kèm theo “Phiếu trả lời”.
2.5.12. Xử lý số liệu
Các số liệu trong đề tài được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2010
và phần mềm JMP 10. Số liệu được biểu diễn bằng giá trị trung bình ± độ lệch
chuẩn (mean ± SD). Kết luận về sự ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm dựa
trên phân tích ANOVA, sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức thí nghiệm
được xác định so với giá trị sai khác nhỏ nhất (5% LSD).