М.Д. Логачева, Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского

1. Опыт применения данных
секвенирования на платформе Illumina
в генетике растений
М.Д. Логачева,
Московский государственный университет им. М.В.
Ломоносова, НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского
р

2. 640kb ought to be enough for anybody
g g y y
While Solexa sequencing is the most economical
g
technology for deep coverage of
transcriptomes, de novo assembly of short Solexa
sequences for non-model species remains an
non model
unresolved challenge. (Wall et al. 2009 BMC
Genomics, 10:347)
A short read-based technology such as Solexa has
been used for re-sequencing in Brassica napus
re sequencing
(Trick et al. 2009) but not for de novo sequencing.
(Brautigam, Gowik 2010, Plant Biology 12: 831–841)

3. Секвенирование транскриптома нута
(Сicer arietinum): первый пример
сборки растительного транскриптома
с помощью коротких чтений
исходные данные:
106 660 317 чтений:
50 523 492 парных (72 bp), 56 136 815
одиночных (50 bp)
о о
результат:
53 409 контигов с N50=900, из них 42 012
имеют значимое сходство с известными
генами

4. Секвенирование de novo других растительных транскриптомов
транскриптом Taxus mairei (Hao et al. 2011
PLoS ONE 6(6): e21220): идентификация генов,
исходные данные - 13 737 528 парных отвечающих за синтез
чтений по 76 bp биологически активных
результат сборки - 36 493 контигов,
б веществ
23515 имеют значимое сходство с
известными генами
транскриптом Ipomoea batatas (Wang et
al. 2010 BMC Genomics, 11:726):
исходные данные – 59 233 468 парных
чтений по 75 b
й bp широкомасштабная
результат сборки – 56 516 контигов идентификация SSR
средней длиной 581 bp, 35 051 имеют
значимое сходство с известными
генами
транскриптом Fagopyrum esculentum
(Логачева с соавт., неопубл.): выявление
исходные данные – 85 891 935 парных полиморфизма между
чтений по 100 bp сор о
сортом и предковой
ред о о
результат сборки – 49 446 контигов, 23 формой
031 имеют значимое сходство с
известными генами

5. Секвенирование геномов органелл
пластидный геном растений: митохондриальный геном
растений:
• небольшой (100-200 Кб) размер
• консервативность порядка и
р р д • размер 0.1 – 2.9 Мб
состава генов • высочайшая вариабельность
• относительно низкая скорость состава и порядка генов
замен •большое количество
• почти нет повторяющихся повторяющихся элементов, в том
элементов (кроме IR) числе видоспечифичных
• секвенирован > 150 видов • горизонтальный перенос генов
• секвенирован у 25 видов
ЗАЧЕМ?
• изучение молекулярной генетики фотосинтеза;
• изучение координации работы двух геномов (более 2/3 протеома
хлоропластов – белки, кодируемые ядерным геномом. Ключевой фермент фотосинтеза –
Рубиско: малая субъединица – ядерный геном, большая – хп.);
• модельная система для изучения горизонтального переноса генов;
• популяционная генетика и биогеография, ДНК-штрихкодирование,
изучение гибридизации;
у р д ц
• молекулярная филогенетика и эволюция;

6. Секвенирование пластидных геномов
Проблемы:
• не всегда возможно получить чистую пластидную ДНК в
нужных количествах
• гомополимерные участки
• псевдогены пластидного происхождения в митохондриальном и
ядерном геномах
Возможные пути решения:
• полногеномная амплификация с помощью long PCR
Cronn et al. 2008, Nucleic Acids Res. 36(19): e122, Parks et al. 2009, BMC Biology
2009, 7:84: внутривидовой полиморфизм и филогения рода Pinus (сосна)
• обогащение пластидной ДНК
б й
хорошо подходит для видов с большим ядерным геномом (Atherton et al. 2010,
Plant Methods, 6:22, Zhang et al. 2011, PLoS ONE 6(5): e20596 )
• секвенирование тотальной ДНК
для видов с небольшим геномом или при наличии референсного генома
пластидный геном – 5 15 % от общего числа чтений
5-15

7. Секвенирование ядерных геномов de novo
Секвенирование генома Brassica rapa:
• экономически значимое растение (репа, турнепс, пекинская капуста)
• близкородственен модельному объекту Arabidopsis thaliana
• один из предков аллополиплоидного вида Brassica napus (рапс)
длина общая длина
б
Основные выводы: глубина
б длина чтения
фрагментов прочтенных секвенирования (bp)
библиотеки rapa – сравнительно недавний (5-9 млн. лет назад)
• Brassica последовательностей
гексаплоид (Gb)
184интенсивная2.482 генов после полиплоидизации (из ожидаемых 90
• потеря 5.045 101
200 14.940
тысяч обнаружено 41174) 30.366 44,75
500потеря генов – не случайный процесс: гены "домашнего хозяйства"
• 7.810 15.874 44,75
2 Kb
теряются, гены, участвующие в ответе 7.276
3.580 на стресс и других 44
5 Kb 3.210 6.524 45
взаимодействиях с окружающей средой остаются многокопийными
8 Kb 2.460 5.000 44
10 Kb 1.522
1 522 3.093
3 093 44

8. Секвенирование ядерных геномов de novo
Секвенирование генома Phoenix dactylifera (финиковая пальма):
• первый из секвенированных геномов однодольных-не злаков
• первый из секвенированных геномов двудомных растений
сборка исходных данных (526 443 374
парных чтений длиной 36–84 bp)
референсный геном
добавление данных секвенирования (женская особь
mate paired
mate-paired библиотек сорта Kh l )
Khalas)
57277 скаффолдов с N50=30480 bp
аннотация
поиск участков
участков,
поиск участков
обогащенных различиями
поиск SNP с аномально
между мужскими и
высоким покрытием
женскими особями
геномы женских и мужских особей других сортов

9. Идентификация генов, охарактеризованных по мутациям
"постгеномная эра" – только для Arabidopsis!
постгеномная эра
Задача: идентифицировать ген, локализованный с точностью до 100-300 Кб.
долго, но не дорого (если повезёт!): быстро, но дорого :
• выявить полиморфизм между • подобрать праймеры для
рефере с
референсным геномом и геномом рас ,
е о о е о о расы, секвенирования каждого гена
на фоне которой получена мутация (включая интроны и
• разработать систему детекции регуляторные области) в этом
полиморфизма (
рф (скорее всего,
р районе (40 50 генов)
(40-50
основанную на расщеплении • секвенировать (по Сэнгеру)
амплифицированных фрагментов – каждый ген у дикого типа и у
метод CAPS или его модификация мутанта
dCAPS) • сравнить последовательности
• проверить состояние полиморфного ДТ и мутанта, выявить
маркера - 7-10 маркеров - у 400-500 изменение
растений F2 (выделение ДНК→ПЦР
→рестрикция →форез)
•

10. быстро и недорого : bractea
дикий тип
• ресеквенирование генома дикого типа и
мутанта
у
• картирование чтений на референсный геном
• выявление SNP и других изменений в
интересующем участке генома дикого типа и
мутанта по отношению к референсному геному
• выявление изменения, уникального для
мутанта
Q E V M E F L D Y W G L I Q E V M E F L D Y * G L I
Пенин с соавт., неопубл.

11. Идентификация генов, охарактеризованных по мутациям
Задача: идентифицировать ген с неизвестной локализацией
Пример: идентификация генов, отвечающих за процессинг
очень долго и дорого:
предшественника микроРНК MIR390a (Cuperus et al. 2010 Proc Natl Acad Sci USA.
классическое
107(1):466 471) картирование → задача сводится к предыдущей
107(1):466-471)
быстро и недорого :
• ресеквенирование генома растений F2, имеющих мутантный фенотип
EMS-мутагенез отбор растений с проверка уже известных
(линия C
( Col-0)
) интересующим фенотипом кандидатных генов
скрещивание с линией Ler, отбор растений с
получение популяции F2 мутантным фенотипом
секвенирование смеси ДНК поиск SNP и определение
этих растений их соотношений
(221 млн. чтений по 36 bp)
В участке локализации мутации должны преобладать SNP, характерные
для Col-0, в остальных участках Col-0/Ler в соотношении 1/1

12. Построение генетических карт
Brassica napus (рапс) – полиплоид
полиплоид,
предковые виды – Brassica rapa и
B. oleracea
Геном ~ 1 2 Гб
1.2

13. Благодарю за внимание!