Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA
MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC
TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG”.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Bích Phương
MSSV: 1151100246 Lớp: 11DSH04
TP. Hồ Chí Minh, 2015

Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi đƣợc thực hiện tại phòng
thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng đại học Công
nghệ TP.Hồ Chí Minh. Các số liệu và kết quả là trung thực, chƣa ai công bố.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về lời cam đoan của mình trƣớc quý thầy cô
và nhà trƣờng.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015
Sinh viên thực hiện
Hồ Thị Bích Phƣơng

LỜI CẢM ƠN
Tận đáy lòng con xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ đã gian lao nuôi
dạy con thành ngƣời và là ngƣời thầy đầu đời của con. Cha mẹ luôn là chỗ dựa vững
chắc nhất của con, là ngƣời giúp con đứng vững sau mỗi lần vấp ngã, là nguồn động
viên, động lực để con tiếp tục phấn đấu trong cuộc sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc. Em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý Thầy Cô Khoa
Công nghệ sinh học – Môi trƣờng – Thực phẩm, cùng toàn thể Thầy Cô Trƣờng Đại
học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho em những
kiến thức quý báu về cơ sở ngành cũng nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào
giảng đƣờng đại học.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hƣơng ngƣời đã luôn tận
tình chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm của
đồ án.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đồ án tại phòng thí nghiệm Khoa Công
nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí
Minh.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp 11DSH04 và các bạn làm đồ án tại phòng thí nghiệm
Khoa Công nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm đã luôn khích lệ, động viên và
giúp đỡ mình trong suốt quá trình học tập tại trƣờng và trong quá trình làm đồ án tốt
nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn!
TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2015
SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng

i
MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ẢNH...................................................................................... vi
MỤC LỤC BẢNG ................................................................................................viii
LỜI MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................. 12
1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật...........................................................12
1.1.1. Hợp chất thứ cấp ..........................................................................................12
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật ..............12
1.2 Tổng quan prodigiosin......................................................................................15
1.2.1. Khái niệm về prodigiosin.............................................................................15
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin..........................................................16
1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin ..............................................................18
1.3. Tổng quan về Serratia marcescens....................................................................24
1.3.1. Phân loại Serratia marcescens.....................................................................24
1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens.............................................................25
1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp bởi Serratia marcescens ............................29
1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens.....................................31
1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin .......................................................................32
1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin........................................................................32
1.4.2. Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin................................................34

ii
1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin....................................................................38
1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lƣợng prodigiosin............................................39
1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens...................................42
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45
2.1. Thời gian và địa điểm..........................................................................................45
2.1.1. Thời gian ......................................................................................................45
2.1.2. Địa điểm.......................................................................................................45
2.2. Vật liệu................................................................................................................45
2.2.1. Nguồn vi sinh vật .........................................................................................45
2.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy và hóa chất sử dụng....................................................45
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.....................................................................................46
2.4 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................47
2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy ...................................................................................49
2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết.................................................................................49
2.5.2 Kháng sinh đồ ...............................................................................................49
2.6 Xác định điều kiện lên men..................................................................................49
2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy..............................................................52
2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng lên men ................................................53
2.7.3 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ muối NaCl ..........................................53
2.7.4 Khảo sát sự ảnh hƣởng của phƣơng pháp đồng nuôi cấy ............................54
2.7.5 Khảo sát sự ảnh hƣởng của sản phẩm Quorum sensing................................55
2.8 Thu hồi sản phẩm thô...........................................................................................56

iii
2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men..........56
2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ .........................................56
2.9 Các phƣơng pháp phân tích..................................................................................56
2.9.1 Xác định protein có trong mẫu......................................................................57
2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu..........................................................................57
2.10 Sắc ký bản mỏng TLC........................................................................................57
2.11 Phƣơng pháp phân tích.......................................................................................59
2.11.1. Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin..........................................59
2.11.2. Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê...........................................................59
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 60
3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết...........................................................................60
3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin ........................................................65
3.2.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........65
3.2.2 Xác định vận tốc lắc......................................................................................67
3.2.3 Kết quả xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng MT3 ........................................69
3.2.4 Ảnh hƣởng của nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp............71
3.2.5 Kết quả thí nghiệm đồng nuôi cấy ................................................................73
3.2.6 Sử dụng dịch trong nuôi cấy .........................................................................76
3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng...........................................................77
3.3.1 Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng: dung môi trích ly lên hàm lƣợng
prodigiosin thu hồi .................................................................................................77
3.3.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng..................................78

iv
3.4 Xác định thành phần hóa học trong mẫu..............................................................84
3.4.1. Phản ứng Biuret’s test ..................................................................................84
3.4.2 Xác định lipid có trong mẫu..........................................................................86
3.5 Sắc ký bản mỏng TLC..........................................................................................88
Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 91
4.1 Kết luận.............................................................................................................91
4.2 Kiến nghị ..........................................................................................................92
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 93
PHỤ LỤC................................................................................................................. 1

v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
EPN: Entomopathogenic nematodes
OD: mật độ quang (Optical Density)
λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại
TLC: Thin Layer Chromatogarphy

vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003).............................................. 19
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008)............................................... 20
Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011) 23
Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) ................. 29
Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở 250
C sau
48 giờ (David, 2012) ..................................................................................................... 28
Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC
39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử
Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001)........................................ 35
Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009) ........................................... 37
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm................................................................................... 51
Hình 2.2 Sơ đồ trích ly.................................................................................................. 54
Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký ..................................................................... 61
Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trƣờng NA..................................... 63
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X
...................................................................................................................................... .64
Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1.................................................................. 65
Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1 .................................................... 65

vii
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp ........ 69
Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc............................................ 71
Hình 3.7 Ảnh hƣởng của pH lên sự tổng hợp prodigiosin của S. marcescens SH1. .... 73
Hình 3.8 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung NaCl. ....................................... 75
Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 và Bacillus sp............................... 77
Hình 3.10 Kết quả đồng nuôi cấy E. coli...................................................................... 78
Hình 3.11. Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung môi
khác nhau....................................................................................................................... 81
Hình 3.12 Canh trƣờng sau khi ly tâm.......................................................................... 82
Hình 3.13. Sắc tố đỏ sau khi trích ly với dung môi Etanol:HCl (95:5) ........................ 83
Hình 3.14. Vi khuẩn S. marcescens đƣợc cấy trên môi trƣờng NA.............................. 84
Hình 3.15. Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng. .................................................. 85
Hình 3.16. Kết quả quét quang phổ của sắc tố canh trƣờng không đun và đun 1000
C 86
Hình 3.17 Biuret’s test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô 87
Hình 3.18 Ninhydrin test đối với dịch trong sau ly tâm và dịch trích ly prodigiosin thô
ở thí nghiệm đun và không đun canh trƣờng. ............................................................... 88
Hình 3.19. Kết quả mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc và sau khi phun thuốc
thử.................................................................................................................................. 90
Hình 3.20. Kết quả sắc ký bản mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether :
Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v).................................................................................... 92
Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S. marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin...........................93

viii
MỤC LỤC BẢNG
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật............... 15
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973) .. 19
Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated).....................................................................25
Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010) 29
Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009). ....... 40
Bảng 2.1. Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc. ........................ 55
Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh ............................................................................. 66
Bảng 3.2 % Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp so với đối chứng (thí nghiệm A) ........ 69
Bảng 3.3. Hàm lƣợng prodigiosin khi thay đổi vận tốc lắc. ......................................... 70
Bảng 3.4 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.................................................... 73
Bảng 3.5 Kết quả hàm lƣợng prodigiosin khi bổ sung muối NaCl............................... 75
Bảng 3.6. % prodigiosin tổng hợp so với đối chứng..................................................... 77
Bảng 3.7. Hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp khi bổ sung dịch nuôi cấy. ...................... 79
Bảng 3.8. % Ảnh hƣởng của tỷ lệ canh trƣờng : dung môi trích ly.............................. 80
Bảng 3.9. Kết quả hàm lƣợng prodigiosin trong thí nghiệm ........................................ 84
Bảng 3.10. Kết quả xác định protein và lipid ............................................................... 91

9
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Các nguồn tài nguyên thiên nhiên, chẳng hạn nhƣ thực vật, vi sinh vật, động vật
có xƣơng sống và không xƣơng sống là những nguồn có giá trị của các hợp chất hoạt
tính sinh học. Một số lƣợng lớn các loại thuốc đã đƣợc phát triển trong ngành y từ
các sản phẩm tự nhiên. Kể từ khi phát hiện và thành công trong việc điều trị của
peniciline, các vi sinh vật đã đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn đặc biệt của các tác nhân
hoạt tính sinh học có cấu trúc đa dạng. Các ứng dụng điều trị của các chất chuyển
hóa của vi sinh vật cung cấp cơ hội cho việc phát hiện ra kháng sinh (ví dụ
peniciline, erythromycin…), ức chế miễn dịch trong cấy ghép, các tác nhân giảm
cholesterol (ví dụ lovastain và mevastatin) và tác nhân chống ung thƣ (ví dụ
doxorubicin, daunorubicin, bleomycin và pentostatin).
Từ khi nền khoa học hiện đại bắt đầu, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đƣợc
chiết xuất từ trái cây, rau, hạt, rễ,… đã đƣợc sử dụng trong việc làm thuốc đông y,
mỹ phẩm, thực phẩm,... Nhƣng sau đó, các hợp chất thứ cấp tự nhiên đã đƣợc nghiên
cứu sâu hơn về cấu trúc hóa học cũng nhƣ cách tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học,
bởi ngƣời ta cho rằng chúng bền hơn, có thể sản xuất trên quy mô lớn và chi phí sản
xuất thấp. Tuy nhiên, các vấn đề ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng xấu đến sức
khỏe gây ra bởi các hợp chất tổng hợp hóa học đã bắt đầu đƣợc chú ý đến. Chính vì
thế so với các hợp chất thứ cấp từ thực vật và động vật thì các hợp chất từ vi sinh
vật ngày càng đƣợc quan tâm và phát triển, vì vi sinh vật cũng là một yếu tố tự nhiên
và an toàn dễ sử dụng, sản xuất đƣợc quanh năm trong các điều kiện địa lý khác
nhau và do sự tăng trƣởng nhanh chóng của vi sinh vật nên sẽ làm giảm thời gian sản
xuất xuống còn chỉ một vài ngày. So với các nguồn khác từ thực vật hoặc động vật
thì hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật có thể dễ dàng đƣợc kiểm soát và dự đoán sản

10
lƣợng (Francis, 1987; Taylor, 1984). Trong những sắc tố từ vi sinh vật thì hợp chất
prodigiosin đƣợc biết đến với ý nghĩa quan trọng.
Một số loài Serratia, đặc biệt loài Serratia marcenscens có khả năng tổng hợp
sắc tố đỏ (red pigment) prodigiosin (2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene)
(C20H25N30 = 323,44) (Williams và Qadri, 1980, Kobayashi và El-Barrad, 1996;
Press và cộng sự, 1997; Someya và cộng sự, 2000; Roberts và cộng sự, 2005).
Prodigiosin là sắc tố màu đỏ, và có hoạt tính kháng vi sinh vật đã đƣợc bắt đầu
nghiên cứu từ những năm 1960, nay thu hút đƣợc nhiều quan tâm do khả năng sử
dụng làm màu tự nhiên và ứng dụng trong lãnh vực bảo vệ thực vật cũng nhƣ hoạt
chất kháng ức chế miễn dịch và chống khối u (D’Alessio và Rossi, 1996; Azuma và
cộng sự, 2000; Bennet và Bentley, 2000; Melvin và cộng sự, 2000, Tsuji và cộng sự,
1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji, 1992; Songia và cộng sự, 1997).
Sớm nhận thấy đƣợc lợi rất quan trọng của hợp chất prodigiosin đƣợc tách từ
việc nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcenscens, Nguyễn Hoàng Anh Kha đã thu nhận sắc
tố đỏ prodigiosin từ việc nuôi cấy trong môi trƣờng peptone glycerol đạt 10,575 mg/ml
sắc tố ( ĐATN Nguyễn Hoàng Anh Kha, 2014). Sau đó ĐATN Trần Lâm Tú Quyên
(2014) đã khảo sát trong quá trình lên men thu prodigiosin, môi trƣờng huyền phù
đậu phộng MT1 (10%) cho hàm lƣợng prodigiosin là 248,4% so với môi trƣờng
peptone glycerol là 100%. Cũng trong ĐATN Trần Lâm Tú Quyên (2014) kết luận môi
trƣờng MT3 chứa 10% huyền phù đậu phộng 5% pepton và 1% dầu hƣớng dƣơng, tỉ
lệ cấy giống 3%, lắc 180 vòng phút trong 24 giờ đầu sau đó giảm còn 150 vòng/phút
là môi trƣờng và điều kiện tối ƣu nhất để tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin. Nhƣng quá
trình lên men còn ở quy mô sản xuất nhỏ 20 ml/bình và còn nhiều yếu tố cần cải thiện.
Dựa trên cơ sở này đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia
mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ
CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin tổng hợp.

11
2. Mục tiêu đề tài
Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, cũng nhƣ
phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô.
3. Nội dung đề tài
Khảo sát chủng Serratia marcescens xem xét độ thuần khiết, khảo sát kháng
sinh đồ.
Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể
tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp
dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung dịch nuôi
cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing.
Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy.
4. Ý nghĩa khoa học
Áp dụng các kiến thức về công nghệ lên men sản xuất hợp chất thứ cấp vào tổng
hợp prodigiosin.
Xem xét khá năng sử dụng chủng Serratia marcescens SH1 phân lập từ tuyến
trùng EPN vào sản xuất prodigiosin qua kháng sinh đồ khác biệt với chủng phân lập từ
bệnh phẩm.
Góp phần vào việc tăng quy mô và nồng độ sản phẩm prodigiosin tổng hợp
bằng phƣơng pháp lên men.
5. Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp sản phẩm prodigiosin thô cho nghiên cứu tinh sạch và khảo sát hoạt
tính sinh học.

12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
1.1.1. Hợp chất thứ cấp
Hợp chất thứ cấp là chất đƣợc tạo ra từ hợp chất sơ cấp, có trọng lƣợng phân
tử nhỏ, thƣờng đƣợc gọi là chất có hoạt tính sinh học đóng vai trò điều hòa quan hệ
sinh thái của chủ thể với các tác động lên chủ thể của môi trƣờng xung quanh.
Hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật là những hợp chất đƣợc vi sinh vật tạo ra từ quá
trình chuyển hóa hợp chất sơ cấp.
1.1.2. Triển vọng và tiềm năng sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật
Vi sinh vật đã đƣợc sử dụng trong một thời gian dài cho sản xuất các phân tử
sinh học nhƣ thuốc kháng sinh, enzyme, vitamine và các tác nhân chỉ thị. Có sự
quan tâm ngày càng tăng trong ngành công nghiệp thực phẩm trong việc sử dụng các
thành phần tự nhiên. Các thành phần, chẳng hạn nhƣ hợp chất thứ cấp, đƣợc xem là
tự nhiên khi xuất phát từ nguồn gốc sinh học nhƣ động vật, thực vật hoặc vi sinh
vật. Hợp chất thứ cấp của vi sinh vật đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp chế biến
cá, ví dụ nhƣ để tăng màu hồng của cá hồi nuôi. Hơn nữa, một số hợp chất tự nhiên
có tiềm năng thƣơng mại để sử dụng nhƣ chất chống oxy hóa. Ngành công nghiệp
hiện nay đã sản xuất một số hợp chất từ vi sinh vật ứng dụng trong thực phẩm, mỹ
phẩm hoặc vật liệu dệt. Trong tự nhiên phong phú về hợp chất và vi sinh vật sản
xuất hợp chất (nấm, nấm men và vi khuẩn). Trong các sắc tố tự nhiên thì vi sinh

13
vật cung cấp một số lƣợng hợp chất rất lớn nhƣ: carotenoid, melanin, flavin,
quinone, prodigiosin và cụ thể hơn là monascin, violacein hoặc indigo (Dufosse,
2009). Các loại hợp chất này có tiềm năng khai thác cao, vì quá trình sản xuất đơn
giản, sự đa dạng di truyền ở vi sinh vật, cũng nhƣ có thể dễ dàng tối ƣu hóa quy trình
công nghệ (Juailova và cộng sự, 1997).
Bên cạnh đó, một số vi sinh vật có khả năng sản xuất hợp chất với hiệu suất
cao, bao gồm các chi Monascus (Hajjaj và cộng sự, 2000) và Serratia (Williams và
cộng sự, 1971a). Các chi vi sinh vật khác nhƣ: Rhodotorula, Bacillus, Achrombacter,
Yarrowia và Phaffia cũng có khả năng sản xuất số lƣợng lớn hợp chất thứ cấp
(Krishna, 2008), trong đó kháng sinh, nhóm hoạt chất có khả năng gây chết hoặc kìm
hãm vi sinh vật phát triển, đƣợc một số vi sinh vật nhƣ nấm mốc, xạ khuẩn và vi
khuẩn tạo ra, là một trong những thành tựu quan trọng của việc sản xuất hợp chất thứ
cấp từ vi sinh vật. Mỗi kháng sinh có phổ tác động riêng của mình. Bảng 1.1 tóm tắt
về một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật.
Bảng 1.1. Danh sách một số hợp chất thứ cấp đƣợc sản xuất bởi vi sinh vật
Vi sinh vật Hợp chất thứ cấp Ứng dụng Kiểu tác động ức chế
Penicillium
notatum,
Penicillium
chrysogenum
Penicillin Ức chế tụ cầu khuẩn,
nhiễm trùng kỵ khí,
giang mai, hen suyễn.
Ức chế tạo polymer
vách tế bào vi khuẩn,
ức chế hấp thu amino
acid và protein, ức chế
tạo enzyme

14
Streptomyces
griceus
Streptomycin Ức chế vi khuẩn
Gram âm và ram
dƣơng. Trị bệnh lao,
bệnh viêm màng não,
ho gà
Ức chế ghép nối một
số amino acid vào
protein, tác động lên
hệ enzyme của vi
khuẩn tham gia
chuyển pyruvate vào
chu trình Creb…
Steptomyces
venezuelae
Chloramphenicol Ức chế đối với bệnh
lỵ, sốt cao, sốt phát
ban
Ức chế đặc hiệu sinh
tổng hợp protein vi
khuẩn liên quan đến
peptidyl transferase
trong tiểu đơn vị
Ribosome 50s, ngăn
không cho tạo liên kết
peptide
Streptomyces
aureomycin
Tetracilin Ức chế phổ rộng vi
khuẩn Gram âm,
Gram dƣơng
Ức chế tổng hợp
protein
Streptomyces
erythraeus
Erythromycin Chữa bệnh do tụ cầu
khuẩn streptococcal
gây ra
ức chế vi khuẩn Gram
âm và Gram dƣơng

15
Streptomyces
fradiae
Neomycin Tác dụng vi khuẩn
Gram âm và Gram
dƣơng
Hơi độc
Streptomyces
kanamycetius
Kanamycin Điều trị lao, ức chế vi
khuẩn Gram âm và
Gram dƣơng
Tác động giống nhƣ
streptomycin và
neomycin
Streptomyces
lavendulae
Cycloserine Điều trị bệnh lao Cản trở tổng hợp vách
tế bào
1.2 Tổng quan prodigiosin
1.2.1. Khái niệm về prodigiosin
Prodigiosin là một tripyrrole đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên khuẩn lạc đặc
trƣng của vi khuẩn Serratia marcescens. Tên gọi “prodigiosin” có nguồn gốc
từ “prodigious” có nghĩa là một điều gì đó kỳ diệu. Prodigiosin đƣợc tìm thấy ở
dạng túi bên ngoài tế bào cũng nhƣ các tế bào liên kết, và dạng hạt ở bên trong tế
bào (Kobayashi và Ichikawa, 1991).
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp, đƣợc sản xuất bởi các vi khuẩn
nhƣ Serratia marcescens, Pseudomonas magneslorubra, Vibrio psychroerythrous,
Serratia rubidaea, Vibrio gazogenes, Alteromonas rubra, Rugamonas rubra và các
xạ khuẩn Gram dƣơng, chẳng hạn Streptoverticillium rubrireticuli và Streptomyces
longisporus (Khanafari và cộng sự, 2006). Hình 1.1 trình bày cấu trúc hóa học của
các hợp chất đại diện của prodigiosin.

16
Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003)
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của prodigiosin
Mãi đến năm 1960, công thức hóa học chính xác của prodigiosin đƣợc tổng
hợp bởi Serrattia marcescens mới đƣợc biết đến (Rapoport và Holden, 1962). Do sự
tiến bộ nhanh chóng trong khoa học phân tích và quang phổ ở những năm tiếp theo,
mà cấu trúc của prodigiosin dần đƣợc nghiên cứu rõ ràng hơn (Hesse, 2000).
Prodigiosin với tên gọi (5[(3-methoxy-5-pyrrol-2-ylidene-pyrrol-2-
ylidene)methyl]-2-methyl-3-pentyl-1H-pyrrole) có công thức phân tử C20H25N30 và
trọng lƣợng phân tử là 323,44 Da (Harris và cộng sự, 2004; Song và cộng sự, 2006;
Williamson và cộng sự, 2006).
Prodigiosin là một alkaloid có cấu trúc hóa học đặc biệt, với ba vòng pyrrole
tạo thành bộ khung pyrrolylpyrromethane, trong đó hai vòng đầu liên kết trực tiếp
với nhau, còn vòng thứ ba đƣợc gắn vào thông qua cầu nối methene (Qadri và
Williams, 1972; Gerber, 1975). Cấu trúc của prodigiosin có bảy liên kết đôi và đƣợc
miêu tả là tạo sắc tố mạnh (Krishna, 2008).

17
Prodigiosin nhạy cảm với ánh sáng và không tan đƣợc trong nƣớc.
Prodigiosin có thể tan tƣơng đối trong alcohol và ether; bên cạnh đó, nó dễ tan
trong chloroform, methanol, acetonitrile và DMSO (Grimont và cộng sự, 1977;
Khanafari và cộng sự, 2006).
Bảng 1.2. Xác định cấu trúc của một số chất đại diện prodigiosin (Williams, 1973)
Loài Tên sắc tố Danh pháp prodigiosin Trọng lƣợng
phân tử và
công thức
Serratia marcescens Prodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
methoxy prodigiosene
323,4 Da
C20H25N30
Serratia marcescens Norprodigiosin 2-Methyl-3-amyl-6-
hydroxy-prodigiosene
309,4 Da
C10H23N30
Nocardia
(Actinomadura)
madurae
Nonylprodigiosin 2-Nonly-6-
methoxyprodigiosene
363,5 Da
C23H31N30
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna, 2008).
(Krishna

18
Nocardia
(Actinomadura)
madurae
Cyclononylprodig
iosin
2,10-Nonano-6-
melhoxy-prodigiosene
265,5 Da
C23H33N30
Nocardia(Actinomadura)
pellctieri
Methylcyclodc
cyl-prodigiosin
2,10-Nonano-6-
Methoxy-prodigiosene
391,5 Da
C25H33N30
Streptomyces
longisporusruber và
Nocardia(Actinomadura)
pelletieri
Undccylprodigios
in
2-Undecyl-6-
Rnethoxyprodigiosene
393,6 Da
C25H35N30
Streplonlyces
longisporusruber
Metacycloprodig
iosin
2,4-(9-Ethylnonano)-6-
methoxyprodigiosene
391,6 Da
C25H33N30
1.2.3. Hoạt tính sinh học của prodigiosin
1.2.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Prodigiosin có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của một số loài vi
khuẩn (Khanafari và cộng sự, 2006). Hoạt tính kháng khuẩn của prodigiosin là
do khả năng thấm qua màng tế bào và khả năng ức chế các enzyme nhƣ DNA
gyrase, topoisomerase IV,… dẫn đến quá trình ức chế sự tăng trƣởng của tế bào vi
khuẩn (Ramina và Samira, 2009).
Nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện và nhận thấy rằng prodigiosin có thể
kháng một số vi khuẩn nhƣ: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
saprophyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus avium, Streptococcus pyogenes,
Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Proteus

19
mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus,... Tuy nhiên, hoạt động kháng
khuẩn của prodigiosin đối với các vi khuẩn Gram dƣơng lại cao hơn so với
các vi khuẩn Gram âm (Ramina và Samira, 2009; Chandni và cộng sự, 2012).
1.2.3.2. Hoạt tính chống tế bào ung thư
Prodigiosin có khả năng gây độc tế bào và có thể chống lại một loạt các dòng
tế bào ung thƣ ở ngƣời, nhƣng vẫn duy trì các tế bào lành tính (Pandey và cộng
sự,2009; Pérez-Tomás và Viñas, 2010). Vì khả năng gây độc chọn lọc này,
prodigiosin hứa hẹn có nhiều triển vọng trong việc sản xuất thuốc chống ung thƣ. Các
hoạt động chống ung thƣ trong cơ thể của prodigiosin đƣợc chứng minh lần đầu tiên
bằng những ác dụng ức chế của cycloprodigiosin trên tế bào Huh-7
hepatocarcinoma xenografted (Yamamoto và cộng sự, 1999). Một mô hình khối u ác
tính trên chuột cũng cho thấy prodigiosin có khả năng ức chế sự di căn, bằng cách
nó đã giảm sự di căn trên tế bào ung thƣ phổi (Zhang và cộng sự, 2005), điều này
đã cho thấy rằng prodigiosin ngăn quá trình phát triển của tế bào ung thƣ thông qua
nhiều cơ chế.
Các khả năng gây độc dẫn đến sự tự hủy của tế bào ác tính bởi prodigiosin
chủ yếu là do ảnh hƣởng từ proapoptotic của chúng chống lại các tế bào ác tính.
Nhiều nghiên cứu đã dần làm sáng tỏ con đƣờng prodigiosin gây sự tự hủy của các
tế bào (Chia-Che và cộng sự, 2011). Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin
đƣợc mô tả cụ thể nhƣ sau:

20
Hình 1.3. Cơ chế kháng tế bào ung thƣ của prodigiosin (Chia-Che và cộng sự,2011)
Quá trình acid hóa pH trong tế bào (pHi) rõ ràng là một kích hoạt quan trọng
của quá trình tự hủy trong tế bào (Lagadic-Gossmann và cộng sự, 2004). Acid hóa
nội bào là cần thiết cho cycloprodigiosin kích thích quá trình tự hủy trong tế bào
HL-60 (Yamamoto và cộng sự, 2000), cũng tƣơng tự nhƣ prodigiosin gây ra sự tự
hủy ở tế bào ung thƣ ruột (Castillo-Avila và cộng sự, 2005).
Các kết cấu của BCL-2 rất quan trọng trong việc tiến hành con đƣờng tự hủy
của ty thể bằng cách điều hòa tính thấm của màng ty thể bên ngoài. Tăng tính thấm
của màng ty thể bên ngoài sẽ dẫn đến việc hình thành cytosolic của cytochrome c,
nhằm kích hoạt caspase-9 bắt đầu caspase để tạo ra quá trình tự hủy. Prodigiosin
đƣợc biết là tác nhân gây ra sự kích thích quá trình tự hủy của protein BCL-2 BAX
trong tế bào MCF-7 (Soto-Cerrato và cộng sự, 2004). Tƣơng tự nhƣ vậy, các nghiên
cứu cũng đã chứng minh trƣớc đó undecylprodigiosin giảm sự ngăn chặn tự
hủy BCL-XL nhƣng nâng kích thích tự hủy BIK, BIM, MCL-1S và NOXA (Ho và
cộng sự, 2007).
Survivin và XIAP là chất ức chế nội sinh của caspase. Survivin hoặc XIAP
cao sẽ tạo ra sự đề kháng, điều này rất phổ biến trong các tế bào ung thƣ (Schimmer

21
và cộng sự, 2006; Altieri, 2008). Một nghiên cứu trƣớc đó của các tác giả thấy rằng
cả survivin và XIAP đều đƣợc giảm đi bởi sự có mặt của undecylprodigiosin trong
tế bào MCF-7 (Ho và cộng sự, 2007).
Ngừng chu kỳ tế bào: bên cạnh việc gây sự tự hủy của các tế bào ung thƣ,
prodigiosin cũng ngăn chặn sự phát triển ung thƣ bằng cách gây ra quá trình ngừng
chu kỳ tế bào ở nồng độ không gây độc cho tế bào. Để làm điều này,
undecylprodigiosin làm giảm sự phát triển của tế bào lympho T bằng cách ức chế
CDK4 và CDK2 (Songia và cộng sự, 1997). Tƣơng tự nhƣ vậy, prodigiosin gây ra
ngừng tăng trƣởng của các tế bào Jurkat tại quá trình chuyển đổi G1-S, bằng cách
giảm phosphoryl hóa Rb thông qua sự ức chế hoạt động của kinase cyclin E-CDK2
và cyclin A-CDK2, cũng nhƣ bằng cách điều chỉnh p21CIP1/WAF1 và
p27KIP1 (Pérez-Tomás, và Montaner, 2003). Một nghiên cứu gần đây của
SotoCerrato và cộng sự (Soto-Cerrato và cộng sự, 2007) đã cung cấp một cái nhìn
sâu sắc vào cách prodigiosin điều chỉnh p21CIP1/WAF1.
Chống sự xâm nhập và chống sự di căn: di căn là một nguyên nhân hàng đầu
dẫn đế sự tử vong do bệnh ung thƣ và làm tăng nhu cầu về thuốc chống di
căn. Những lợi ích chữa bệnh của prodigiosin đã đƣợc chứng minh trong một mô
hình khối u ác tính ở chuột, bằng cách giảm sự di căn phổi (Zhang và cộng sự, 2005).
Cơ chế hoạt động chống di căn của prodigiosin có thể là do tác dụng ức chế của nó
trên các tế bào di căn và xâm nhập, có thể thông qua quá trình down-
regulation của RhoA và matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (Zhang và cộng sự,
2005).
Tiềm năng gây độc tế bào của prodigiosin cũng đã nghiên cứu trong 60 dòng
tế bào tiêu chuẩn của các khối u ở ngƣời, có nguồn gốc từ phổi, ruột, thận,
buồng trứng, ung thƣ não, các khối u ác tính và bệnh bạch cầu. Ức chế tăng sinh tế

22
bào cũng nhƣ cảm ứng cho tế bào tự hủy đã đƣợc quan sát trong các dòng
tế bào (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Ngoài ra, prodigiosin cũng đƣợc tìm thấy gây độc tế bào ung thƣ phổi và các
tế bào biểu mô kháng doxorubicin và biểu hiện tốt lên các protein đa kháng
thuốc (Llagostera và cộng sự, 2005).
1.2.3.3. Hoạt tính ức chế miễn dịch
Hoạt động ức chế miễn dịch của prodigiosin lần đầu tiên đƣợc mô tả
bởi Nakamura và cộng sự, họ đã cho thấy sự hiện diện của prodigiosin và
metacycloprodigiosin trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Serratia và quan sát sự
ức chế chọn lọc quá trình phát triên của các tế bào lympho T đa giá so với các tế bào
lympho B (Han và cộng sự, 2001). Sau đó, hoạt động ức chế miễn dịch đã đƣợc
chứng minh cho các chất tƣơng tự prodigiosin khác nhƣ: undecylprodigiosin, cPrG,
MAMPDM, nonylprodigiosin,…

23
Bảng 1.3. Các sản phẩm prodigiosin thƣơng mại hóa (Santa Cruz Biotechnology,
Merck Millipore, Biovision incorporated)
STT GIÁ THÀNH
SẢN PHẨM
ĐỘ
TINH
SẠCH
THÔNG SỐ KỸ THUẬT ỨNG DỤNG
1 95 $/ 250 g
= 2000000
VNĐ/250 g
355 $/ 1 mg =
7100000 VNĐ/
1mg
95%
HPLC
Độ hòa tan : DMSO hoặc
Ethanol.
Nhiệt độ lƣu trữ: -20 0
C
Điều kiện vận chuyển : gói gel,
tránh không khí ánh sáng.
Dạng thành phẩm: rắn màu đỏ
đậm.
Hoạt động nhƣ
một mTORC1 và
mRTOC2 ức chế
chất phát triển
phức tạp. Chỉ sử
dụng cho nghiên
cứu, không sử
dụng cho ngƣời.
2 349 $/500 µg =
6980000
VNĐ/500 µg
>95% Trạng thái vật lý: rắn
Có nguồn gốc từ: Serratia
marcescens
Độ hòa tan: Hòa tan trong
ethanol, methanol, DMF hoặc
DMSO.Tan trong nƣớc hạn chế
Bảo quản: ở nhiệt độ -20°C
Điểm nóng chảy: 151-152ºC
Hoạt động nhƣ
một kháng sinh.
Chỉ sử dụng cho
nghiên cứu, không
sử dụng cho điều
trị ở ngƣời.

24
3 159 GBP/200
µg = 3975000
VNĐ/200 µg
>95%
HPLC
Nguồn: Serratia marcescens
Xuất hiện: rắn, màu đỏ đậm
Lƣu trữ dài hạn: -20°C
Độ hòa tan: Hòa tan trong
ethanol, methanol, DMF hoặc
DMSO. Tan trong nƣớc hạn
chế.
Đóng gói khí trơ.
Một ứng dụng
hợp chất tế bào
thẩm thấu có hiển
thị ức chế miễn
dịch và chống
khối u đặc tính
không phân biệt
tình trạng p53 và
kháng đa thuốc.
Một trong những vi sinh vật tổng hợp prodigiosin và analog đƣợc nghiên cứu
nhiều nhất là Serratia marcescens.
1.3. Tổng quan về Serratia marcescens
1.3.1. Phân loại Serratia marcescens
Chi Serratia thuộc họ Enterobacteriaceae, là một nhóm vi khuẩn có liên quan
với nhau về hình thái và trình tự DNA. Trong đó, loài điển hình của chi
Serratia là Serratia marcescens.
Theo Bizio (1823), Serratia marcescens đƣợc phân loại nhƣ sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae

25
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens
1.3.2. Đặc điểm của Serratia marcescens
1.2.2.1 Đặc điểm sinh lý
Serratia marcescens là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy nghi. Serratia
marcescens có hình que, đƣờng kính khoảng 0,5 – 0,8 μm và chiều dài khoảng 0,9 –
2,0 μm. Serratia marcescens phát triển ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 5 – 40o
C
và có thể phát triển ở pH trong khoảng 5 – 9 (David, 2012).
Hình 1.4. Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011)
Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar đƣợc mô tả
là khuẩn lạc tròn, lồi và các khuẩn lạc này có màu trắng, hồng hay đỏ, đó cũng chính
là sắc tố thƣờng thấy trong các khuẩn lạc. Các sắc tố của Serratia marcescens
thƣờng bị mất đi trên các khuẩn lạc cũ (David, 2012).

26
Hình 1.5. Khuẩn lạc của Serratia marcescens trên môi trƣờng nutrient agar ở
250
C sau 48 giờ (David, 2012).
Serratia marcescens có thể bám dính với nhau trên môi trƣờng thạch, tạo
thành nhóm ở nồng độ thấp (0,5 – 0,8%), các cụm tế bào này có chiều dài từ 530 μl.
Serratia marcescens cũng có thể tạo thành một màng sinh học.
1.3.2.2 Đặc điểm sinh hóa
Serratia marcescens có thể phát triển trong môi trƣờng có oxy hoặc trong
trƣờng hợp không có oxy. Chủ yếu Serratia marcescens sử dụng quá trình lên men
để lấy năng lƣợng và nhờ có các enzyme nhƣ superoxide dismutase, calatase,
peroxidase,… bảo vệ chúng khỏi các phản ứng oxy hóa, cho phép sống trong môi
trƣờng oxy hóa.
Serratia marcescens có thể phân biệt với các vi khuẩn khác trong họ
Enterobacteriaceae bởi ba điểm đặc biệt là enzyme DNAase, lipase và gelatinase
(Giri và cộng sự, 2004). Ngoài ra, các đặc điểm khác để xác định Serratia
marcescens là khả năng di động và sinh một số enzyme ngoại bào nhƣ nuclease,
protease và haemolysin (Hejazi và Falkiner, 1997). Một số đặc điểm sinh hóa của
Serratia marcescens đƣợc thể hiện qua bảng 1.4.

27
Bảng 1.4. Một số đặc điểm sinh hóa của Serratia marcescens (Tariq và Jonh, 2010).
STT Đặc điểm sinh hóa Kết quả
1 Di động +
2 Indole -
3 Methyl Red -
4 Voges Proskauer +
5 Citrate +
6 Dnase +
7 Catalase +
8 Oxidase -
9 Urease -
10 Gelatinase +
11 Chitinase +
12 Triple sugar iron Môi trƣờng chuyển sang
acid, không sinh khí và
không sinh H2 S

28
13 Hydrogen sulphide
peoduction
-
14 Lysine decarboxylase +
15 Ornithine decarboxylase +
16 Lên men glucose +
17 Lên men sucrose +
18 Lên men sorbitol +
19 Lên men fructose +
20 Lên men xylose -
22 Lên men lactose -
23 Lên men arabinose -
1.3.2.3. Đặc điểm phân bố
Có thể dễ dàng tìm thấy Serratia marcescens trong nƣớc, trong đất, trong thực
vật, côn trùng, cũng nhƣ trong ống tiêu hóa của ngƣời và động vật có xƣơng sống.
Trong nƣớc và đất: đã có 150 chủng Serratia đƣợc phân lập trong nƣớc sông
và Serratia marcescens chiếm 75%. Bên cạnh đó, Serratia marcescens có thể đóng
một vai trò quan trọng trong chu trình sinh địa hóa của kim loại, thông qua việc
khoáng hóa hữu cơ sắt, cũng nhƣ hòa tan vàng và đồng (Parès, 1964).

29
Trong côn trùng: sự phân bố của các chủng Serratia phân lập từ các loài côn
trùng (Grimont và cộng sự, 1979) cho thấy Serratia marcescens chiếm ƣu thế.
Serratia marcescens đƣợc coi là một trong những tác nhân gây bệnh tiềm năng đối
với côn trùng, chúng làm côn trùng tử vong bằng cách gây ra sự nhiễm trùng huyết
sau khi xâm nhập vào xoang máu (Francine và Patrick, 2006).
Hơn nữa, Serratia marcescens cũng đƣợc tìm thấy nhiều trong thực phẩm,
nhất là trong tinh bột biến tính, vì đây là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự tăng trƣởng
của chúng (Singlton và Sainsbury, 2001).
Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện sự có mặt của Serratia marcescens trong
các loài Steinernema và Heterorhabditis (Gouge và Snyder, 2006). Và trong báo
cáo mới nhất của Estrada và cộng sự (2012) cũng đã nêu ra mối quan hệ giữ
Serratia marcescens với Steinernema carpocapsae.
1.3.4 Một số hợp chất được tổng hợp bởi Serratia marcescens
1.3.4.1. Sắc tố
Một nhóm các sắc tố đỏ tự nhiên gọi là prodigiosin đƣợc tổng hợp từ vi
khuẩn Serrattia marcescens (Han và cộng sự, 1998), đƣợc biết đến nhƣ là một yếu tố
đặc biệt, nhƣng chỉ xuất hiện trong một số chủng. Các sắc tố thuộc nhóm này bao
gồm: prodigiosin, cycloprodigiosin hydrochloride (cPrG–HCI), uncedylprodigiosin,
metacycloprodigiosin và desmethoxyprodigiosin. Trong đó, khả năng ức chế miễn
dịch có trong undecylprodigiosin, metacycloprodigiosin và cycloprodigiosin
hydrochloride (cPrG–HCI) (Krishna, 2008).
Trong vi khuẩn Serratia marcescens, prodigiosin đƣợc sản xuất bởi biogroup
A1 và A2/6, nó không đƣợc sản xuất bởi biogroup A3, A4, A5/8, hoặc TCT
(Grimont, 1977). Bên cạnh đó, chủng không sinh sắc tố của biogroup A1 hoặc A2/6
thƣờng gặp trở ngại trong quá trình tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC (Grimont,

30
1977; Williams và Qadri, 1980). Một số gene mã hóa sinh tổng hợp prodigiosin đã
đƣợc biểu hiện trong Escherichia coli (Dauenhauer và cộng sự, 1984). Các dòng
đƣợc tạo thành này có khả năng tổng hợp ở cả hai giai đoạn MAP và MBC, hoặc
tổng hợp giai đoạn MAP ở bên ngoài (Francine và Patrick, 2006). Prodigiosin đƣợc
biết đến là có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể (kháng thể và tế bào
T), vì vậy khi Serratia marcescens sống trong cơ thể ngƣời, có thể chúng sẽ không
tổng hợp prodigiosin và do đó thoát khỏi sự phát hiện của hệ thống miễn dịch
(Hejazi và Falkiner, 1997).
Bên cạnh đó, một sắc tố vàng có tên gọi là 2-hydroxy-5-carboxymethylmuconic
semialdehyde acid, đƣợc sản xuất từ sự phân tách 3,4- dihydroxyphenylacetic acid
(3,4-DHP) bởi enzyme 3,4-DHP 2,3-dioxygenase (Trias và cộng sự, 1988). Enzyme
này đƣợc cảm ứng bởi tyrosine trong tất cả các chủng Serratia marcescens.
Tuy nhiên, hiện nay chủng Serratia marcescens A8a, đã bị mất khả năng phát triển
trên các hợp chất thơm, để có thể sản xuất các sắc tố màu vàng (Francine và Patrick,
2006).
1.3.4.2. Biosurfactants
Các chủng sinh sắc tố và một số chủng không sinh sắc tố của Serratia
marcescens đều sản xuất biosurfactants có thể hoạt động nhƣ một chất thấm. Chất
thấm này đƣợc sản xuất với số lƣợng lớn ở 30°C nhƣng không đƣợc sản
xuất ở 37°C trong phase cân bằng của quá trình tăng trƣởng. Ba aminolipid, từ W1
đến W3, có các hoạt động thấm ƣớt và đã đƣợc tách bằng sắc ký lớp mỏng
(Matsuyama và cộng sự, 1986). Trong đó, W1 đƣợc xác định là serratamolide,
một cyclodepsipeptide mà trƣớc đó đã từng đƣợc phát hiện bởi Wasserman và cộng
sự (1961).

31
1.3.4.3. Acid béo
Các acid béo chủ yếu trong toàn bộ tế bào của các chủng Serratia
marcescens là 3-3-hydroxytetradecanoic, n-hexadecanoic, hexadecanoic, và
octadecanoic acid. Các acid béo này chiếm khoảng 50 – 80% thành phần tế
bào, trong đó, ntetradecanoic acid chiếm Tỷ lệ nhiều nhất (Bergan và cộng sự, 1983).
1.3.4.4. Enzyme
Serratia marcescens có thể tiết ra nhiều loại enzyme nhƣ protease,
chitinase, DNAase, lipase, gelatinase, chloroperoxidase,...
Trong đó, enzyme chitinase có nhiều tiềm năng trong việc xử lý các chất thải có
chứa chitin trong quá trình sản xuất sản thủy sản đóng gói, cũng nhƣ kiểm soát sinh
học đối với nấm bệnh, thu hồi kim loại nặng trong nƣớc,… (Joshi và cộng sự,
1989).
Serratia marcescens có khả năng tiết ra các loại enzyme: Protease thủy phân
casein. Đây là đặc điểm phân biệt Serratia marcescens từ 438 chủng vi khuẩn đƣờng
ruột và tập hợp Pseudomonadaceae. Tƣơng tự nhƣ vậy, một protease khác là gelatinase
phân hủy gelatin, một loại protein không đầy đủ mà thiếu tryptopan.
1.3.5 Tổng quan về quorum sensing trong S. marcescens
Cảm biến định mức (quorum sensing) là một quá trình truyền tín hiệu gian bào
qua đó vi khuẩn nhận diện mật độ tế bào và điều chỉnh sự biểu hiện gen một cách
tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn sản sinh ra những phân tử tín hiệu để tập hợp lại xung
quanh chúng nhƣ việc gia tăng quần thể. Khi sự tập trung của tín hiệu vƣợt quá ngƣỡng
của nó, thì việc đánh dấu hành trình đƣợc bắt đầu và phản ứng sinh lý đƣợc sắp đặt sẽ
đƣợc thực hiện thông qua quần thể này. Quorum sensing sẽ điều chỉnh nhiều quá trình
xử lý quan trọng, trong các loài vi khuẩn khác nhau, ví dụ nhƣ tính độc hại, sự sản sinh

32
trao đổi thứ cấp, cộng sinh, sự hình thành bào tử và màng sinh học ( Whitehead et al.,
2001). Những hệ thống quorum sensing đƣợc nghiên cứu rộng rãi nhất trong khuẩn
gram âm là những hệ thống sử dụng phân tử tín hiệu aHSL, trong đó đồng đẳng LuxI
tổng hợp nhiều tín hiệu aHSL và những protein điều hòa phiên mã loại LuxR tập hợp
tín hiệu cùng loại của chúng ở mật độ tế bào dày đặc và thay đổi sự biểu hiện gen
(Labbate et al., 2004; Riedel et al., 2001).
1.4. Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin
1.4.1. Cơ chế tổng hợp prodigiosin
Các gene sinh tổng hợp prodigiosin trong Serratia nằm trong một operon
lớn. Cấu tạo của các gene sinh tổng hợp prodigiosin (pig) trong Serratia sp. ATCC
39.006 (Serratia 39.006) và trong chủng Serratia marcescens, ATCC 274 (Sma 274)
đã đƣợc báo cáo (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Prodigiosin đƣợc hình thành qua hai giai đoạn: 2-methyl-3-amylpyrrole
(MAP) và 4-methoxy-2, 2'-bipyrrole-5-carboxyaldehyde (MBC), tạo nên dẫn xuất
tripyrrole, đƣợc gọi là 2-methyl-3-amyl-6-methoxyprodigiosene. Có rất ít thông tin
về con đƣờng sinh tổng hợp ở giai đoạn MAP hoặc MBC, ngoại trừ việc mô tả về
phân tử proline kết hợp nguyên vẹn thành một trong những nhóm pyrrole của MBC.
Quá trình tổng hợp sắc tố này cần có không khí và phân tử oxy (Williams và Qadri,
1980).

33
Hình 1.6. So sánh các cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia
ATCC 39.600, Sma 274 và các cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm
màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno và cộng sự, 2001).
Prodigiosin là một chất rất dễ dàng để thực hiện thử nghiệm trong các
chất chuyển hóa của Serratia marcescens và có thể hữu ích đối với việc nghiên cứu
một hệ thống mô hình các cơ chế biểu hiện của chất chuyển hóa thứ cấp trong vi
khuẩn. Tách các phân tử tái tổ hợp mã hóa cho quá trình tổng hợp prodigiosin sẽ là
một cách tiếp cận để xác định sản phẩm gene và sự hiểu biết về enzymology và di
truyền học của quá trình sinh tổng hợp prodigiosin. Việc tách trình tự của DNA mã
hóa một phần trong quá trình tổng hợp prodigiosin bằng cách sử dụng hệ thống nhân
bản vector ở Escherichia coli cosmid đã đƣợc báo cáo (Dauenhauer và cộng sự,
1984).
Cụm gene tổng hợp sắc tố của Serratia spp. ATCC 39.006 đƣợc biểu hiện trong
Erwinia carotovora sub sp. carotovora (25 chủng trong số 36 chủng thử nghiệm),
mặc dù nó đã không đƣợc biểu hiện trong một số chủng vi khuẩn khác thuộc
Enterobacteriaceae, bao gồm cả Escherichia coli (Thomson và cộng sự, 2000).
Trong Serratia ATCC 39.006 tổng hợp prodigiosin đƣợc quy định bởi nhiều yếu tố,

34
bao gồm hệ thống quorum-sensing, thông qua các đồng đẳng LuxIR, SmaI và SmaR
(Thomson và cộng sự, 2000; Slater và cộng sự, 2003). Điều thú vị là việc sản xuất
prodigiosin tạo thành N-(3 oxohexanoyl)-L-homoserine lacton (OHHL) tùy thuộc
vào sự biểu hiện trong Erwinia carotovora sub sp. carotovora, mặc dù sau này, việc
sản xuất một phân tử tín hiệu khác đã đƣợc thực hiện bởi Serratia 39.006 (Thomson
và cộng sự, 2000).
Nhóm sắc tố Serratia đƣợc quy định bởi 14 gene chung cho cả Serratia và
Streptomyces coelicolor và đƣợc bố trí trong pigA đến pigN, trong đó có năm gene
tổng hợp MBC (màu đỏ) và bốn gene tổng hợp MAP (màu xanh), đƣợc mô tả ở hình
1.4. Bốn gene còn lại không có vai trò tổng hợp, tuy nhiên, có một protein còn lại
(PigL) tham gia vào quá trình hậu dịch mã của một số protein trong phức hợp. Thứ tự
gene của hai loài Serratia khác nhau là khác nhau và14 protein thể hiện kích thƣớc
và trình tự amino acid khác nhau giữa các loài (Cerdeno và cộng sự, 2001).
1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng đến tổng hợp prodigiosin
Prodigiosin là một chất chuyển hóa thứ cấp điển hình chỉ xuất hiện sau giai
đoạn phát triển của vi khuẩn (Harris và cộng sự, 2004). Bản chất màu đỏ
tƣơi của prodigiosin giúp việc nghiên cứu hợp chất thứ cấp này dễ dàng hơn
(Chidambaram và Perumalsamy, 2009). Nhiều yếu tố, chẳng hạn nhƣ: nhiệt độ, pH,
độ oxy hòa tan, ánh sáng, phosphate vô cơ và thành phần môi trƣờng ảnh hƣởng đến
quá trình sản xuất prodigiosin (Heinemann và cộng sự, 1970; Sole và cộng sự, 1994;
Rjazantseva và cộng sự, 1995; Williamson và cộng sự, 2005).
Quá trình sản xuất prodigiosin trong Serratia marcescens rất nhạy cảm với
nhiệt độ và bị ức chế đáng kể ở nhiệt độ cao hơn 37°C (Giri và cộng sự, 2004). Hơn
nữa, môi trƣờng thông thƣờng đƣợc sử dụng để sinh tổng hợp prodigiosin bởi các
chủng Serratia marcescens là môi trƣờng phức tạp và rất giàu dinh dƣỡng

35
(Yamashita và cộng sự, 2001; Furstner, 2003; Giri và cộng sự, 2004). Một số chất
dinh dƣỡng nhƣ thiamine và acid sắt (Wei và Chen, 2005) đặc biệt quan trọng
đối với sản xuất prodigiosin, trong khi phosphate (Witney và cộng sự, 1977),
adenosine triphosphate và ribose (Lawanson và Sholeye, 1975) lại có tác dụng
ức chế sản lƣợng prodigiosin.
Hình 1.7. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp prodigiosin bởi
Serratia marcescens (Sundaramoorthy và cộng sự, 2009)
Giri và cộng sự (2004), đã so sánh sự phát triển của Serratia marcescens trên
các môi trƣờng khác nhau nhƣ: môi trƣờng hạt mè, nutrient broth và peptone glycerol
broth,... Các môi trƣờng cũng đƣợc so sánh tốc độ tăng trƣởng và khả năng xuất
prodigiosin ở các nhiệt độ khác nhau. Các thí nghiệm này cũng giúp quan sát vai trò
của các acid béo trong việc sản xuất prodigiosin và nhận thấy nhiều thành phần
trong hạt có thể kích thích tăng mật độ tế bào và sinh tổng hợp nhiều prodigiosin hơn.
Trên môi trƣờng peanut broth thì prodigiosin có thể tổng hợp ở nhiệt độ 37o
C trong
khi trên các môi trƣờng nhƣ nutrient broth, peptone glycerol broth có hoặc không
có bổ sung đƣờng cũng không thể làm đƣợc điều này (Chidambaram và
Perumalsamy, 2009).

36
Quá trình sản xuất prodigiosin ở Serratia marcescens giảm bởi glucose và các
loại đƣờng khác do sự giảm pH trong canh trƣờng nuôi cấy Khanafari và cộng sự,
2006). Bên cạnh đó, có thể xét đến vai trò của nguồn carbon trong quá trình sản xuất
sắc tố. Điểm đầu tiên là trong nutrient broth, về cơ bản là môi trƣờng này không
có nguồn carbon, việc bổ sung maltose hoặc glucose làm tăng cƣờng việc sản xuất
sắc tố, trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng sesame broth thì nguồn carbon ở dạng
các acid béo. Maltose và glucose đƣợc thêm vào nutrient broth làm tăng gấp đôi năng
suất so với chỉ sử dụng môi trƣờng nutrient broth hoặc peptone glycerol broth. Điểm
thứ hai là sự sản xuất sắc tố đƣợc tăng cƣờng trong môi trƣờng peptone glycerol
broth ở 30o
C và trong nutrient broth ở 28o
C, điều này có thể là do sự hiện diện của
glycerol nhƣ là một nguồn carbon. Rõ ràng trong thực tế nguồn carbon giúp hỗ trợ
tăng trƣởng tế bào và sản xuất prodigiosin (Chidambaram và Perumalsamy, 2009).
Ngoài ra, một báo cáo đã chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi trƣờng
lỏng của Serratia marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất
prodigiosin và serrawettin (Yamashita và cộng sự, 2001). Hơn nữa, prodigiosin
thƣờng nằm trên màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ
SDS và môi trƣờng nuôi cấy cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin
(Feng và cộng sự, 1982; Wei và Chen, 2005).

37
Bảng 1.5. So sánh quá trình tổng hợp prodigiosin bởi Serratia marcescens trong các
môi trƣờng và các nhiệt độ khác nhau ( Chidambaram và Perumalsamy, 2009).

38
1.4.3. Điều kiện tổng hợp prodigiosin
Helvia và cộng sự (2010), đã tối ƣu hóa quá trình sản xuất proodigiosin bởi
Serratia marcescens UCP 1549 bằng việc sử dụng 6% nƣớc thải từ công nghiệp chế
biến sắn và bổ sung 2% mannitol ở 28o
C và pH =7 trong 48 giờ. Kết quả cho thấy
Serratia marcescens sản xuất prodigiosin ở mức cao nhất là 49,5 g/l.
Antony và cộng sự (2011), đã thực hiện quá trình tối ƣu hóa sản xuất
prodigiosin bởi Serratia marcescens SU-10 và đánh giá các hoạt tính sinh học của
prodigiosin. Kết quả cho thấy điều kiện tối ƣu cho việc sản xuất prodigiosin trong
môi trƣờng Nutrient broth là ở nhiệt độ 28o
C, pH = 7 và trong thời gian 72 giờ. Và
quá trình chiết xuất prodigiosin đƣợc thực hiện bằng ethanol: hydrochloric acid
(9,5: 0,5) hoặc acetone: ethyl acetate (1:1). Ngoài ra, prodigiosin thu nhận đƣợc có
tác dụng ức chế tốt ở cả vi khuẩn Gram dƣơng và vi khuẩn Gram âm.
Chandni và cộng sự (2012), đã nhận thấy rằng prodigiosin có khả năng
kháng khuẩn nhƣ Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và kháng nấm bệnh
nhƣ Candida albicans, Candida parapsilosis và Cryptococcus sp.,hơn nữa,
prodigiosin có khả năng chống oxy hóa ở nồng độ 22,05 μg/ml và có tiềm năng
nhuộm, cùng với việc không bị ảnh hƣởng bởi acid, kiềm , chất tẩy rửa, mà có thể
ứng dụng rộng rãi trong ngành dệt và các ngành công nghiệp trị liệu.
Shahitha và Poornima (2012), đã tiến hành cải tiến quá trình sản xuất
prodigiosin trong Serratia marcescens. Họ nhận thấy rằng trong số các môi trƣờng
dầu khác nhau thì dầu đậu phộng sản xuất prodigiosin cao nhất (2,72 mg/ml) và có
thể sử dụng để nhuộm bông tạo ra màu đẹp.
San và cộng sự (2012), đã sử dụng chất thải chế biến thủy sản nhƣ một nguồn
carbon và nitơ để sản xuất prodigiosin từ Serratia marcescens TKU011. Hơn nữa,
nghiên cứu của các tác giả này cũng cho thấy prodigiosin có khả năng diệt côn trùng.

39
Nghiên cứu của Ananda và cộng sự (2013) đã sử dụng prodigiosin thu nhận từ
chủng Serratia marcescens CMST 07 để chống lại các vi khuẩn nhƣ Alteromonas sp.
và Gallionella sp., cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu là khoảng 6,75 μg/ml và nồng độ
diệt khuẩn tối thiểu là khoảng 12,5 μg/ml. Bên cạnh đó, Ananda và cộng sự cũng đã sử
dụng prodigiosin để nghiên cứu độc tính trên Artemia cho thấy LD50 khoảng 50 μg/ml.
1.4.4. Thu nhận, tinh sạch và định lượng prodigiosin
1.4.4.1. Thu nhận và tinh sạch
Các sắc tố không tan trong nƣớc mà tan trong dầu thƣờng đƣợc chiết xuất
bằng dung môi hữu cơ pha nƣớc nhƣ: acetone, methanol, ethanol, hoặc các hỗn hợp
của các dung môi, để giúp các dung môi này hoạt động tốt hơn. Chiết xuất thƣờng có
chứa một lƣợng nƣớc đáng kể, do đó, có thể đƣợc loại bỏ bằng cách phân lớp nhờ
hexane, petroleum ether, diethyl ether, dichloromethane hoặc hỗn hợp các dung môi.
Sắc ký, quang phổ hấp thụ ở vùng khả kiến là cơ sở đầu tiên dùng để xác định các
chất màu. Quang phổ sẽ đƣợc thực hiện, lƣu giữ và sau đó tiến hành so sánh với các
phổ chuẩn (Amaya. 2001).
Các tiêu chuẩn tối thiểu sau đây đƣợc đề xuất là nên thực hiện để xác định một
hợp chất chƣa biết (Liaaen-Jensen, 1971; Pfander và cộng sự, 1994).
Phổ khả kiến (𝜇max ).
Sắc ký lớp mỏng (Rf).
Sắc ký lỏng cao áp (thời gian lƣu mẫu).
Phƣơng pháp phổ khối (khối lƣợng phân tử).
NMR (chuyển hóa về mặt hóa học).

40
Các nhà khoa học đã thực hiện nhiều nghiên cứu về quá trình thu nhận và tinh sạch
prodigiosin nhƣ sau:
Prodigiosin (2-metyl-3-pentyl-6 methoxyprodigiosene) đƣợc chiết xuất từ môi
trƣờng nutrient broth nuôi cấy Serratia marcescens sau 72 giờ, với ethanol và
petroleum ether, tiếp theo loại bỏ dung môi trong một cốc nƣớc sôi (hay trong một bể
cách thủy) và hòa tan phần còn lại vào 50% ethanol (Rosenzweig và Stotzky, 1980).
Các sắc tố từ tế bào của Serratia marcescens phân lập từ đất đƣợc chiết xuất bằng
acetone, hòa với một ít ethyl acetate, và đƣợc sấy khô bằng natri sulfat. Các chất chiết
xuất đƣợc hòa tan và đƣợc thực hiện quét từ bƣớc sóng 200 – 700 nm. Hỗn hợp dung
môi dichloromethane, chloroform và acetone với tỷ lệ 2,5: 2,5: 0,5 đã đƣợc sử dụng để
tách một cách hiệu quả các tạp chất từ chiết xuất cùng với các sắc tố bằng sắc ký lớp
mỏng. Cột silica có kích thƣớc từ 80 – 100 mesh đã đƣợc sử dụng để phân tách các
tạp chất không màu từ các sắc tố. Mẫu tinh khiết cho thấy có độ hấp thụ cao duy nhất
tại 535 nm trong quang phổ UV. Nó đƣợc tiếp tục phân tích để xác định trọng lƣợng
phân tử bằng việc sử dụng máy quang phổ khối. Các sắc tố prodigiosin tinh khiết đƣợc
đem phân tích quang phổ khối cho thấy chúng có trọng lƣợng phân tử là 324 Da (Giri
và cộng sự, 2004).
Prodigiosin đƣợc chiết xuất bằng cách lắc môi trƣờng nuôi cấy tế bào Serratia
marcescens 2170 với methanol có tính acid (1ml dung dịch HCl 1N: 24 ml methanol)
và dịch trong suốt đƣợc làm cho bay hơi trong chân không. Sắc ký lỏng cao áp của các
chiết xuất đƣợc thực hiện trên silica gel với dung môi chloroform và methanol. Các sắc
tố thu đƣợc sẽ đƣợc rửa giải trong methanol và phân tích bởi phƣơng pháp phổ khối
(ESI-MS). Sau đó, các sắc tố chƣa tinh khiết đã thu đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc thực hiện
phƣơng pháp HPLC. Một cột đảo pha Nucleosil C18 (250x4 mm, 10 m) đã đƣợc sử
dụng với một gradient tuyến tính 0% đến 100% trong 30 phút (A: 10mM amoni
acetate, pH 7,0, B: 100% acetonitrile). Việc rửa giải đƣợc theo dõi bằng cách sử dụng

41
cả hai máy dò UV diode-array và ESI-MS (Montaner và Perez-Tomas, 2001; Tomas và
Montaner, 2003).
Sau khi lên men Serratia marcescens phân lập từ đất, canh trƣờng đƣợc lấy từ
những chất hấp thụ trong bioreactor (IAB) và sau đó, 1 lít ethanol 95% (v/v) đã acid
hóa (pH 3,0) đƣợc thêm vào IAB. Các sắc tố đƣợc chiết xuất bằng cách sử dụng một
vòng tròn giải hấp impller trong IAB, ở 200 vòng trong 5 giờ, rồi đem cô đặc và ly
tâm. Sau đó, nó đƣợc thu bằng cách sử dụng nƣớc và chloroform để tách pha.
Prodigiosin màu đỏ đi vào chiếm hết chỗ ở phía dƣới của pha chloroform và đƣợc cô
đặc bằng cách cho bốc hơi. Prodigiosin đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silica gel (2,5
× 30 cm). Nó đƣợc rửa với một hỗn hợp hexane: ethyl acetate (2: 1, v/v). Các sắc tố
cô đặc đã đƣợc tách ra bởi việc sử dụng hỗn hợp chloroform: methanol 95:5
(v/v) trong TLC. Sau đó, màu đỏ duy nhất của prodigiosin (giá trị Rf là 0,43) đã đƣợc
thu nhận và hòa tan trong acetone. Các sắc tố chƣa tinh khiết sẽ tiếp tục đƣợc thực
hiên phƣơng pháp TLC (với tỷ lệ dung môi chloroform: methanol: diethyl ether
là 6: 2: 2), và cuối cùng là tinh chế bằng HPLC (với cột C18 (2,5×10 cm)). Sau đó, nó
đƣợc tách rửa với hỗn hợp methanol: nƣớc (7:3, v/v) đã đƣợc điều chỉnh pH= 3,0 bằng
0,1N HCl với tốc độ dòng chảy là 20 ml/ phút. Một lƣới thép không gỉ lớn với kích
thƣớc lỗ 0,5 cm đã đƣợc sử dụng nhƣ sự hỗ trợ cho chất hấp phụ bên trong. Nồng
độ của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở 535
nm sử dụng chùm quang phổ tia UV khả kiến trong methanol đã đƣợc acid hóa
(0,01N HCI 4ml + 96ml methanol) (Goldschmidt và Williams, 1968). Khối lƣợng
phân tử của chất màu tinh khiết đƣợc xác định bằng việc sử dụng quang phổ khối. Các
1
H- và 13
C-NMR của các mẫu màu đƣợc ghi nhận sau khi hòa tan trong CDCl3. Các
dịch chuyển hóa đã đƣợc đối chiếu trong một TMS (trimetylsilyl) tín hiệu. Phổ FT-IR
của các sắc tố đƣợc ghi nhận (Song và cộng sự, 2006).

42
1.4.4.2. Định lượng
Mẫu tinh khiết của prodigiosin cho thấy nó có độ hấp thụ cao và duy nhất tại
bƣớc sóng 535nm trong quang phổ UV (Giri và cộng sự, 2004). Chính vì vậy, nồng độ
của các prodigiosin đỏ sản xuất ra đƣợc thu nhận trong methanol đã acid hóa (với
0,01N HCI 4ml và 96ml methanol) sẽ đƣợc ƣớc tính bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc
sóng 535 nm và sử dụng quang phổ UV khả kiến (Goldschmidt và Williams, 1968).
Tổng số các sắc tố đƣợc ƣớc tính theo công thức sau (Chen và cộng sự, 2006; Williams
và cộng sự, 1960):
TP(µg/L)=
Trong đó:
TP: Biểu thị tổng số sắc tố thu đƣợc (μg/L).
A: Độ hấp thụ của sắc tố đƣợc chiết xuất trong methanol ở 535 nm.
D: Hệ số pha loãng.
V1: Thể tích methanol bổ sung vào. V2: Thể tích canh trƣờng ban đầu.
7.07×104
: Hệ số hấp thụ của prodigiosin.
1.5 Tiềm năng sản xuất prodigiosin của Serratia marcescens
Trong nhiều thập kỷ qua, prodigiosin đƣợc biết đến là một hợp chất tự nhiên
có thể gây độc tế bào (Furstner, 2003) và đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật nhƣ
Vibrio psychroerythrus (D’Aoust và Gerber,1974), Serratia marcescens,
Pseudomonas magnesiorubra và một số vi khuẩn khác (Lewis và Corpe, 1964).
Đặc trƣng của Serratia marcescens là sản xuất sắc tố đỏ không có khả năng
khuếch tán prodigiosin nên có khuẩn lạc với màu đỏ rất đẹp (Kalesperis và cộng sự,

43
1975; Gargallo và cộng sự, 1987; Gargallo-Viola, 1989). S. marcescens cũng là một
tác nhân gây bệnh cơ hội ở ngƣời với những chủng không sản xuất sắc tố gây
đe dọa sức khỏe cộng đồng (Gargallo-Viola, 1989). Những chủng sản xuất sắc tố
phân lập từ tự nhiên ít liên quan đến nhiễm trùng và thật thú vị là những sắc tố đỏ
không tan trong nƣớc này lại đƣợc báo cáo là có hoạt tính kháng sinh (Tsuji và cộng
sự, 1990; Kataoka và cộng sự, 1992; Tsuji và cộng sự, 1992; Songia và cộng sự,
1997). Các prodigiosin tốt nhất đƣợc biết đến là một chất màu đỏ nondiffusible gắn
với lớp màng bên trong tế bào (Iranshahi và cộng sự, 2004). S. marcescens cũng
sản xuất một chất hòa tan trong nƣớc, có màu đỏ hồng-tím superoxidase dismutase
(Hardjito và cộng sự, 2002).
Ở S. marcescens khuẩn lạc rất nhỏ và ban đầu không có màu, màu đầu tiên
xuất hiện gần đƣờng kính khuẩn lạc khoảng 1mm (Haddix và Werner, 2000). S.
marcescens chỉ tổng hợp sắc tố trong một điều kiện nhất định. Bizio và Sette đã phân
lập đƣợc sắc tố đỏ sản xuất bởi các chủng Serratia và cố gắng sử dụng nó nhƣ là một
loại thuốc nhuộm cho mục đích thƣơng mại. Tuy nhiên, ở dạng tinh khiết nó quá
nhạy cảm với ánh sáng khi đƣợc sử dụng thực tế (Furstner, 2003).
Serratia, giống các vi sinh vật họ Enterobacteriaceae khác, có thể phát
triển tốt trong điều kiện môi trƣờng kỵ khí và hiếu khí. Nó phát triển tốt trên các môi
trƣờng tổng hợp, sử dụng các hợp chất khác nhau nhƣ một nguồn carbon duy nhất.
Giri và cộng sự (2004) đã thực hiện thử nghiệm trên một loạt các môi trƣờng và phát
hiện ra trên môi trƣờng từ hạt đậu phộng làm tăng một lƣợng đáng kể prodigiosin.
Hơn nữa, một báo cáo chứng minh việc bổ sung silica gel vào môi trƣờng lỏng
của S. marcescens cũng dẫn đến sự tăng trƣởng tế bào, sản xuất prodigiosin và
serrawettin (Yamashita và cộng sự,2001). Ngoài ra, prodigiosin thƣờng nằm trên
màng tế bào, việc bổ sung các chất hoạt động bề mặt chẳng hạn nhƣ sodium dodecyl
sulface (SDS) cũng có thể nâng cao hiệu quả sản xuất prodigiosin (Wei và Chen,

44
2005). Hardjito và cộng sự (2002) báo cáo rằng việc sản xuất sắc tố bởi chủng phi
lâm sàng (non-clinical) có ý nghĩa khoa học và quan trọng, có một mối quan hệ giữa
quá trình sản xuất sắc tố với sự vắng mặt của plasmid. Do đó, sản xuất sắc tố do
chủng phi lâm sàng của S. marcescens đã đƣợc quan tâm nghiên cứu sâu hơn để
xác định mối quan hệ của quá trình sản xuất sắc tố và khả năng gây bệnh. Đặc điểm
sắc tố của S. marcescens cũng khác nhau (Hardjito và cộng sự, 2002), chịu ảnh
hƣởng của cả hai yếu tố di truyền và môi trƣờng. Sản xuất các sắc tố tan trong nƣớc
đƣợc tăng cƣờng bằng cách bổ sung polymyxin B (Suzuki và cộng sự, 2001),
gramicidin và valinomycin vào môi trƣờng tăng trƣởng (Hardjito và cộng sự, 2002).
Không nghi ngờ gì nữa, sản xuất sắc tố bởi S. marcescens sẽ tiếp tục hấp
dẫn các nhà vi sinh vật học, bác sĩ và kỹ sƣ công nghệ sinh học. Gần đây,
prodigiosin đã đƣợc xem là hiệu quả nhƣ một tác nhân kiểm soát sinh học với tảo có
hại trong môi trƣờng biển tự nhiên, do đó, prodigiosin phải sản xuất với số lƣợng lớn
để có thể đáp ứng nhu cầu trong tƣơng lai (Someya và cộng sự, 2001).

45
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm
2.1.1. Thời gian
Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 25/05/2015 đến ngày 15/08/2015.
2.1.2. Địa điểm
Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực
phẩm - Môi trƣờng, Trƣờng Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu
2.2.1. Nguồn vi sinh vật
Nguồn vi khuẩn thử nghiệm là chủng Serratia marcescens_SH1 do Nguyễn
Hoàng Anh Kha phân lập từ tuyến trùng diệt sâu (EPN) Heterorhabditis indica CP
16 (H.CP 16) tại phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Công nghệ Sinh
học-Thực phẩm-Môi trƣờng, Đại học Công nghệ TP. HCM, đƣợc định danh bằng
phƣơng pháp sinh học phân tử có số đăng kí trên genbank là KF534508.1.
Vi khuẩn sử dụng đồng nuôi cấy gồm Bacillus sb, E. coli do phòng thí nghiệm
khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trƣờng cung cấp.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng
2.2.2.1. Môi trường nuôi cấy ( thành phần môi trƣờng xem phụ lục)
- Môi trƣờng Nutrient agar (NA);

46
- Môi trƣờng Nutrient broth (NB);
- Môi trƣờng Peptone glycerol broth (PG);
- Môi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng (MT3);
- Môi trƣờng huyền phù đậu phộng, pepton, dầu hƣớng dƣơng, muối NaCl (MT4).
2.2.2.2. Hóa chất sử dụng
- NaCl; HCl; NaOH; H2SO4
- Pepton, meat extract, agar
- Nƣớc muối sinh lý 0,85%; nƣớc muối bão hòa
- Ethanol 96%; Petrolium ether; Bismuth nitrate; KI; Ether; Acetic acid; Aceton;
- Coomassie brilliant blue; Methanol; N-hexan; Etyl Acetate
2.2.2.3. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị
Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm,
máy đo độ hấp thụ quang học, tủ lạnh thƣờng, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, kính hiển vi…
Dụng cụ
Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm, đĩa
petri, Eppendorf, vi quản, bản mỏng TLC, đũa thủy tinh, que cấy,cuvet thủy tinh, đèn
cồn…
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp luận

47
Dựa trên mục tiêu đề tài “Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng
hợp prodigiosin, cũng nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô”, các nội dung nghiên cứu
đã đƣợc đề ra với các phƣơng pháp luận nhƣ sau:
Khảo sát chủng Serratia marcescens SH1 xem xét độ thuần khiết, khảo sát
kháng sinh đồ so sánh chủng sử dụng với công bố về các chủng có khả năng gây bệnh.
Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin:
tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng của vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối NaCl,
thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy tăng hợp chất thứ cấp, thử áp dụng bổ sung
dịch nuôi cấy vi khuẩn Gram âm chứa phân tử tín hiệu Quorum sensing. Prodigiosin
là hợp chất thứ cấp, quá trình tổng hợp thƣờng trễ hơn pha tăng trƣởng tế bào. Điều
kiện nuôi cấy quyết định nồng độ prodigiosin tổng hợp. Nghiên cứu này dựa trên các
báo cáo trƣớc đó của các tác giả cùng nhóm (sinh viên năm trƣớc) và ngoài nƣớc để
cải thiện điều kiện nuôi cấy cho chủng phân lập của phòng thí nghiệm.
Thiết lập quy trình trích ly sắc tố thô từ canh trƣờng nuôi cấy đáp ứng yêu cầu
tăng hiệu suất trích ly, tiết kiệm dung môi và an toàn sinh học.
2.4 Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm theo sơ đồ trên hình 2.1

48
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Chủng VK SH1
3. Thu hồi prodigiosin từ
canh trƣờng
1. Khảo sát chủng nuôi
cấy.
2. Cải tiến điều kiện lên
men thu prodigiosin
Prodigiosin thô (sắc tố
thô – STT)
Khảo sát thể tích
lên men và vận tốc
lắc trong nuôi cấy.
Cải thiện quá
trình trích ly nhờ
tiền xử lý gia
nhiệt.
Xác định tỷ lệ dung
môi trích ly
Xác định pH nuôi
cấy.
Khảo sát sự ảnh
hƣởng của
phƣơng pháp
đồng nuôi cấy.
Kiểm tra độ thuần
khiết và khuẩn
định S. marcescens
Kháng sinh đồ
Ảnh hƣờng của
nồng độ muối
NaCl
Khảo sát sự ảnh
hƣởng của sản
phẩm Quorum
sensing.

49
2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy
2.5.1 Kiểm tra độ thuần khiết
Khảo sát hình thái khuẩn lạc
Cấy ria chủng vi khuẩn SH1 đã đƣợc phân lập trên môi trƣờng NA. Dùng
dao sắc, nhỏ, cắt một miếng thạch mỏng, mép cắt sát với mép khuẩn lạc. Quan sát
dƣới kính hiển vi ở hai góc độ là từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 4X và 10X.
2.5.2 Kháng sinh đồ
Sau khi kiểm tra độ thuần khiết, ngƣời thực hiện đề tài gửi chủng vi khuẩn đến
công ty Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn - Phƣờng Tân Hƣng Quận 7 - Thành phố
HCM - Việt Nam để khảo sát kháng sinh đồ. Sử dụng các kháng sinh amoxicillin-
clavulanic acid, ampicillin, tetracycline, cefuroxime và cefotaxime,ciprofloxacin,
amikacin, ertapenem, ceftazidime, chloramphenicol, imipenem,
trimethoprim/sulfamethoxazole, cefepime, piperacillin/tazobactam, gentamicin khuếch
tán vào thạch Mueler-hinton. Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo
Enterobacteriaceae đƣợc trình bày ở bảng 1 phần phụ lục.
2.6 Xác định điều kiện lên men
2.6.1 Ảnh hƣởng của thể tích lên men lên nồng độ prodigiosin tổng hợp
Lên men đƣợc thực hiện trong bình tam giác với các nghiệm thức: đối chứng: 20
ml/bình, thí nghiệm 200 ml/bình và 400 ml/bình. Thí nghiệm lặp lại ba lần.
Cách tiến hành
Bƣớc 1 (nhân giống): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra đổ tinh khiết cũng nhƣ
khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống trong môi trƣờng Nutrient
broth trong 24, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.

50
Bƣớc 2. Chuẩn bị môi trƣờng lên men MT3 thành phần trong phụ lục 1 với thể tích
nhƣ nêu trên. Đem hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, nhiệt độ 1210
C.
Bƣớc 3: Cấy giống vi khuẩn thu từ canh trƣờng ở bƣớc 1, pha loãng sao cho OD
600 nm ≈ 0,7 vào môi trƣờng MT3 với tỷ lệ giống 3%. Lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu,
150 vòng/phút ở 24h sau với nghiệm thức 20 ml/bình và lắc thêm 150 vòng/ phút với
nghiệm thức 200 ml/bình và 400 ml/bình.
Bƣớc 4: thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ trích ly hình 2.2 với tỷ lệ
canh trƣờng : dung môi (Ethanol : HCl 1N (95:5; v:v)) 1:2 (A:B 1:2).

51
Hình 2.2 Sơ đồ trích ly

52
Sau khi trích ly, loại bỏ dịch trong, gom dịch 1, dịch 2 và dịch 3 vừa trích ly,
tiến hành đo OD ở bƣớc sóng λ=535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa vào đƣờng chuẩn
sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.
2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc trong nuôi cấy
Ngƣời thực hiện đề tài khảo sát vận tốc lắc cho bình lên men với thể tích 400
ml/bình ở các chế độ lắc đƣợc trình bày trên bảng 2.1
Bảng 2.1 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của máy lắc và chế độ lắc.
Thí nghiệm Ngày Loại máy lắc Tốc độ (vòng/phút)
Nghiệm thức 1
1 Máy lắc ngang 180
3 Máy lắc vòng 150
Nghiệm thức 2
Nghiệm thức 3

53
4 Không sử dụng 0
Nghiệm thức 4
Nghiệm thức 5
Cách tiến hành, trích ly sắc tố và xác định hàm lƣợng prodigiosin nhƣ trong thí
nghiệm 2.6.1.
2.7.2 Xác định pH tối ưu cho môi trường lên men
Chuẩn bị môi trƣờng lên men MT3 với thể tích 20 ml/bình, điều chỉnh pH ≈
7.2 lặp lại cho 3 bình thí nghiệm và 3 bình không điều chỉnh pH làm đối chứng. Đem
hấp khử trùng trong 15’ ở áp suất 1 atm, 1210
C. Các bƣớc nhân giống, lên men và xác
định hàm lƣợng prodigiosin tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200 vòng/phút ở 24h
đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau.
2.7.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl
Các bƣớc nhân giống và lên men tiến hành giống thí nghiệm 2.6.1 lắc 200
vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, điều chỉnh pH phù hợp với kết quả

54
của thí nghiệm 2.7.2. Bổ sung nồng độ muối NaCl tỷ lệ với thể tích canh trƣờng lên
men lần lƣợt là 0% (đối chứng), 1%, 2%, 3%, lặp lại 3 lần với mỗi nghiệm thức.
Sau khi trích ly, tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 535 nm hợp chất thu đƣợc và dựa
vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu. Đo pH canh
trƣờng sau nuôi cấy, xác định nồng độ NaCl cho nồng độ prodigiosin tổng hợp cao
nhất trong tƣơng quan với pH sau nuôi cấy.
2.7.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của phương pháp đồng nuôi cấy
2.7.4.1 Thí nghiệm đồng nuôi cấy với vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách tiến hành
Bƣớc 1 ( nhân giống Serratia marcescens SH1) từ ống thạch nghiêng đã kiểm
tra độ tinh khiết cũng nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống
trong môi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.
Nhân giống cho vi khuẩn Bacillus subtilis: từ ống thạch nghiêng đã đƣợc cấy
thuần, tiến hành nhân giống trong môi trƣờng NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, nhiệt
độ phòng.
Bƣớc 2: Thu canh trƣờng, pha loãng sao cho OD 600 nm ≈ 0,7. Cấy giống vào MT4
(MT3 + %NaCl ở thí nghiệm 2.6.3 đƣợc điều chỉnh pH tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm
2.6.2) với các nghiệm thức nhƣ sau:
Đối chứng: Cấy giống vi khuẩn S. marcescens vào môi trƣờng MT4, tỷ lệ giống
3% .
Nghiệm thức S/B = 2/1: Cấy giống đồng thời hai giống vi khuẩn S. marcescens
tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 1,5%.

55
tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 3%.
tỷ lệ 3 % và vi khuẩn Bacillus subtilis tỷ lệ 6%.
Bƣớc 3: lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ
phòng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2 nhƣ trong thí
nghiệm 2.6.1.
vào đƣờng chuẩn sắc tố xác định hàm lƣợng prodigiosin trong mẫu.
2.7.4.2 Thí nghiệm đồng nuôi cấy với vi khuẩn Echerichia coli
Các bƣớc tiến hành thực hiện giống thí nghiệm 2.7.4.1 và thay chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis là vi khuẩn gram + bằng vi khuẩn gram – E. coli.
2.7.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của sản phẩm Quorum sensing.
Bƣớc 1 ( nhân giống cấp 2): từ ống thạch nghiêng đã kiểm tra độ tinh khiết cũng
nhƣ khẳng định là S. marcescens SH1, tiến hành nhân giống cấp 2 trong môi trƣờng
NB trong 24h, lắc 150 vòng/phút, ủ tối, nhiệt độ phòng.
Bƣớc 2: lên men S. marcescens môi trƣờng MT5 (đậu phộng 10%+ peptone 5%
+ dầu hƣớng dƣơng 1% + 10ml H2O cất + % NaCl tối ƣu khảo sát ở thí nghiệm 2.7.3
và điều chỉnh pH thích hợp theo thí nghiệm 2.7.2), tỷ lệ cấy giống 3%.
Đối chứng: MT5 + 10ml nƣớc cất.
Nghiệm thức 1: MT5 + 10ml dịch nuôi cấy S. marcescens đã loại bỏ tế bào.
Nghiệm Thức 2: MT5 + 10 ml dịch nuôi cấy E. coli đã loại bỏ tế bào.

56
Bƣớc 3: lắc 200 vòng/phút ở 24h đầu và 150 vòng/phút ở 24h sau, ủ tối, nhiệt độ
phòng. Sau 48h thu canh trƣờng, tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2.
2.8 Thu hồi sản phẩm thô
2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung môi đồng thời khảo sát thể tích lên men
Trích ly sắc tố bằng dung môi Ethanol : HCl (95:5) với tỷ lệ canh trƣờng : dung
môi (A:B) nhƣ các nghiệm thức sau 2:3, 1:2, 2:5. Trích ly theo sơ đồ hình 2.1 ở thí
nghiệm 2.6.1.
2.8.2 Cải thiện quá trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ
Các bƣớc tiến hành lên men thực hiện tƣơng tự thí nghiệm 2.6.1 Sau đó gia nhiệt
canh trƣờng ở 1000
C, 15 phút.
Tiến hành trích ly theo sơ đồ hình 2.2.
2.9 Các phƣơng pháp phân tích
Phân tích prodigiosin
Quang phổ hấp thụ UV/VIS, thiết bị đo mật độ quang.
Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và
giá trị đo OD tại bƣớc sóng λ =535 nm.

57
2.9.1 Xác định protein có trong mẫu
2.9.1.1 Phản ứng Biuret’s test
Hút 1 ml mẫu thêm 5-8 giọt NaOH 10% sau đó thêm 1-2 giọt CuSO4 3%.
Đem đun cách thủy từ 1-2 phút. Nếu dƣơng tính (+) sẽ tạo phức màu tím và
ngƣợc lại.
2.9.1.2 Phản ứng Nynhydrin
Hút 1ml mẫu vào ống nghiệm sau đó thêm 1ml nynhydrin 1%, đun nóng 1-2
phút.
Mẫu sau khi đun nóng có màu tím thì đƣợc xem là dƣơng tính (+).
2.9.2 Xác định lipid có trong mẫu
Chấm mẫu trên bản mỏng sắc ký.
Dùng CBB (Coomassie brilliant blue) 0.03% trong methanol 20% xịt và sấy
100o
C.
Mẫu có màu xanh trên nền sáng đƣợc coi là có lipid trong mẫu.
2.10 Sắc ký bản mỏng TLC
Sử dụng dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70:40:2, v:v:v) và bản
mỏng silica gel.
Chuẩn bị bản sắc ký
Dùng bút chì và thƣớc kẻ vạch đƣờng xuất phát để chấm mẫu cách mép dƣới
2cm và vạch kết thúc cách mép trên bản sắc ký 0,5 cm (Hình ...). Lƣu ý: không chạm
tay lên bản silicagel. Dùng bút chì vạch và chấm nhẹ lên bản silicagel tránh trầy xƣớc
lớp silicagel.

58
Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký
Mẫu sắc tố đƣợc chấm lên bản sắc ký theo vị trí đã đƣợc xác định trên vạch xuất
phát. Dùng vi quản để chấm mẫu. Mẫu chấm phải gọn, không lan rộng, có thể dùng
máy sấy để làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần để số lƣợng mẫu nạp đủ mức cần
thiết.
Tiến hành chạy sắc ký
Tiến hành cho mẫu chạy sắc ký với hệ dung môi trên. Cho bản sắc ký vào
buồng sắc ký chứa sẵn dung môi. Đảm bảo dung môi tiếp xúc gần sát vạch xuất phát.
Đậy nắp bình để tránh thất thoát dung môi và tránh ảnh hƣởng đến sức khỏe. Dung môi
sẽ thấy lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần của mẫu. Chấm
dứt chạy sắc ký khi dung môi thấm đến vạch kết thúc.
Vạch xuất
phát
Vạch kết
thúc
0,5 cm
2 cm

59
2.11 Phƣơng pháp phân tích
2.11.1. Phương pháp định lượng hợp chất prodigiosin
Mục đích
Xác định đƣợc lƣợng hợp chất prodigiosin có trong mẫu từ đó đƣa ra kết luận cho
thí nghiệm.
Nội dung
Nồng độ hợp chất prodigiosin đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn hợp chất và giá
trị đo OD tại bƣớc sóng λ =535 nm.
2.11.2. Phương pháp xử lý số liệu thống kê
Các số liệu thô đƣợc xử lý outlier trên phần mềm Statgraphics Centurion
XV. Các số liệu sau đó đƣợc phân tích ANOVA và đƣợc trắc nghiệm phân hạng
LSD với mức ý nghĩa 0,05.
Các số liệu đƣợc tính toán và xử lý trên phần mềm Microsoft Office
Excel 2010. Các biểu đồ cũng đƣợc thể hiện bằng phần mềm này.

60
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết
Hình thái khuẩn lạc
Chủng S. marcescens SH1 sau khi nuôi cấy trên môi trƣờng NA (hình 3.1) tạo
khuẩn lạc đặc trƣng tròn, lồi, màu đỏ, có quầng sáng bao quanh. Đây cũng chính là đặc
điểm hình thái S. marcescens theo mô tả của David (2002).
Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy trên môi trƣờng NA
Chủng SH1 tổng hợp sắc tố đỏ trên môi trƣờng NA làm cho khuẩn lạc có
màu đỏ (Hình 3.1) nhƣ theo mô tả của các tài liệu về khả năng tổng hợp sắc tố của
Serratia marcescens (Grimont và Grimont, 2006; Anita và cộng sự, 2006;
Chidambaram và cộng sự, 2009; Antony và cộng sự, 2011).

61
Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng và soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật
kính 10X.
Kết quả nhuộm gram
Nhuộm Gram là hình thức quan sát vi thể hình thái tế bào vi sinh vật và là cách đơn
giản nhất, nhanh nhất để phân biệt vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dƣơng.
Kết quả hình 3.3 cho thấy chủng phân lập có lớp peptidoglycan mỏng nên không
giữ đƣợc phức hợp crystal violet – iodine sau khi tẩy cồn và tiếp tục bắt màu hồng
với thuốc nhuộm fuchsin. Điều này cho thấy hai chủng phân lập đƣợc là Gram
âm, phù hợp với những mô tả về Serratia marcescens (Williams và Qadri, 1980;
Grimont và Grimont, 2006; David R.C.,2012).

62
Hình 3.3 Kết quả nhuộm Gram chủng SH1
Sau khi khẳng định là S. marcescens SH1, gửi mẫu cho công ty Nam Khoa thực
hiện kháng sinh đồ đƣợc kết quả nhƣ hình 3.4.
Hình 3.4 Kết quả kháng kháng sinh của chủng SH1

63
Bảng 3.1 Kết quả kháng kháng sinh
S(Sensitivity) - Nhạy cảm: nghĩa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn có thể điều trị đƣợc với
liều thông thƣờng đã đƣợc khuyến cáo.
I(Intermediate) - Trung gian: là kiểu kháng trong đó với những nồng độ ức chế tối
thiểu của một kháng sinh thƣờng đạt đƣợc trong máu và tổ chức cho đáp ứng thấp hơn
so với kiểu nhậy cảm (S). Kháng trung gian phản ánh hiệu quả lâm sàng tại các cơ
quan, bộ phận mà thuốc phân bố.
R(Resistan) - Đề kháng: chủng vi khuẩn không bị ức chế bởi bất cứ nồng độ nào của
thuốc mà cơ thể có thể chấp nhận đƣợc.
Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Mueler-hinton có chứa các
chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh đƣợc
biểu hiện bằng đƣờng kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
Cũng giống nhƣ các chủng khác của Enterobacteriaceae, S. marcescens và các loài
Serratia khác đều kháng penicillin G, các macrolides, clindamycin, linezolid, các
glycopeptide, quinupristin-dalfopristin và rifampin (Department of Pathology and Area
Laboratory Services, Madigan Healthcare System, Tacoma, Washington, 2011).
Hầu hết các chủng vi khuẩn thuộc chi Serratia, trong đó có S. marcescens thƣờng
kháng ampicillin, amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ampicillin-sulbactam,

Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường

Similar to Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường (20)

More from https://www.facebook.com/garmentspace

More from https://www.facebook.com/garmentspace (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

Cải thiện điều kiện nuôi cấy serratia marcescens sh1 và phương pháp thu hồi sắc tố prodigiosin từ canh trường