Crash course on NGS data analyses (in Turkish)

1. Genetik Hastalıkların
Karakterizasyonunda Yüksek Ölçekli
Dizileme ve Biyoenformatik
Can Alkan
Bilgisayar Mühendisliği Bölümü,
Bilkent Üniversitesi, Ankara

2. Genom nedir?
 Bir canlının tüm DNA’sındaki kalıtımsal
şifrelerin tamamı
 İnsan genomu 6 milyar baz çiftinden oluşur, anne
ve babadan 3’er milyar baz çifti gelir
 4 çeşit baz: adenin (A), sitozin (C), guanin (G),
timin (T)

3. Referans genomu
 Uluslararası İnsan Genomu Projesi (ABD, İngiltere, Çin, Japonya,
Almanya, Fransa)
 8 bireyden oluşturulan 3 milyar baz çiftlik “referans genomu”

4. İnsan genom çeşitliliği
Sıklık
Genetik farklılık türleri
Tek Nükleotid Polimorfizm (TNP [SNP])
Kopya Sayısı Varyasyonu (KSV [CNV])
ve Yapısal Varyasyon (YV [SV])
Kromozomal
(trizomi/monozomi)
1 bp 1 kbp 1 Mbp
1 kromozom
Değişken büyüklüğü
Nasıl bulunur?
SNP genotipleme/Sanger dizileme
Array-CGH
Karyotipleme
Yeni nesil dizileme
Verimlilik
1 bp
1 kbp 1 Mbp
1 kromozom
Değişken büyüklüğü

5. Tek nükleotidlik ve kısa değişimler
TNP: İnsanlar arasında tek nükleotidin değişimi ile oluşan farklar
Kısa indel: 1-50 baz uzunluğunda silinme ve eklenmeler
referans: C A C A G T G C G C - T
birey: C A C C G T G - G C A T
substitüsyon silinme eklenme
(TNP / SNP) (indel)
 Kişi başına 3-4.5 milyon arası TNP, yaklaşık 500 bin kısa indel
 Birçoğu etkisizdir, bazıları genlerin ifade ettiği proteinleri etkiler
 Nonsense mutasyon: Genin ifadesini durdurur (örn: Akdeniz anemisi)
 Missense mutasyon: İfade edilen proteini değiştirir (örn: ALS)
 Frameshift (indel): DNA kodunda kaymaya neden olup proteini değiştirir (örn:
hiperkolesterol)

6. Kısa tekrar (mikrosatelit) polimorfizmi
Tekrar eden ardışık tekrarlardaki değişim
referans: C A G C A G C A G C A G
birey: C A G C A G C A G C A G C A G
 Adli tıpta ve babalık testlerinde kullanılır
 Bazı hastalıklara yol açabilir:
 Kırılgan X Sendromu (Fragile X Syndrome)
 Huntington hastalığı

7. Yapısal ve Kopya Sayısı Varyasyonu
SİLİNME YENİ DİZİ EKLEME TRANSPOZON EKLEME
(deletion) (novel sequence ins.) (transposon insertion)
Alu/L1/SVA
ARDARDA KOPYA AYRIŞIK KOPYA
(tandem duplication) (interspersed duplication)
İNVERSİYON TAŞINMA
(inversion) (translocation)
Kopya Sayısı
Varyasyonu - KSV
(copy number
variation)
Dengeli
Varyasyon
(balanced
rearrangement)

8. Yapısal ve Kopya Sayısı Çeşitlilikleri
Eklenme
Silinme
Çevrilme (inversion)
 ‘Bireysel olarak ender, toplu
olarak yaygın’
 Kişi başına yaklaşık 15-20
milyon baz çiftini etkiler
 Çoğunun etkisi yok ya da
azdır, genlerin silinmesi ya da
kesintiye uğraması
durumunda hastalığa yol
açabilir:
 Silinme: otizm, zeka geriliği,
Crohn hastalığı
 Kopyalanma: şizofreni, sedef
hastalığı
 Taşınma: CLL (lösemi)
 Transpozon: hemofili
Kidd et al., Nature, 2008

9. Genomik farklılık keşif projeleri
 Uluslararası HapMap Projesi
 4 toplumdan 270 birey
 İnsan Genomu Çeşitlilik Projesi (HGDP)
 52 toplumdan 1050 birey
 Dizileme projeleri:
 1000 Genom Projesi
 26 toplumdan 2500 birey (planlanan)
 İngiltere:
 UK100K (kontrol + nadir hastalık +yaygın hastalık)
 Diğer bağımsız projeler:
 Güney Afrika, Kore, Hindistan, Japonya, İrlanda, Hollanda,
vb.

10. Genom dizileme
Örneklenen
genom Rastgele parçalama
Eşli dizileme (paired-end seq.)
Referans Dizi okuma (read) yerleştirme
Genomu
(İGP) Biyoenformatik analiz
Bulunan farklılıklar
Sonuçlar
Deneysel doğrulama
Baz başına
10-100
molekül

11. Ekzom ya da tüm genom
 Ekzom dizileme sadece protein kodlayan kısımları
inceler
 Genomun %1.5’u
 Tek gen hastalıkları ve Mendel kalıtımına uyan hastalıklar için
genelde iyi sonuç verir
 > 80X kapsama gerekir (~40 milyon “read”)
 Tüm genom dizileme ile intronlar, UTR’lar,
promotörlerdeki hastalık nedeni mutasyonlar da
bulunabilir
 Crohn hastalığı: McCarroll 2008, Bekpen 2009
 ALS-FTD: Renton, 2011
 > 30X kapsama gerekir (~1 milyar “read”)

12. Biyoenformatik analizler
 Tekrar dizileme (resequencing): elde bir referans
genomu varsa karşılaştırılma yapılır (örn. insan,
fare, şempanze, vs.)
 Parçacık yerleştirme (read mapping): Her parçacığın
referans genomuna mümkün olan en az değişiklik ile
eşleştirilmesi
 Yeni dizileme (de novo sequencing): referans
genomu olmayan türlerin referans genomunun
oluşturulmasında (örn: inci kefali, gibbon, pirinç,
vb.)

13. Tekrar dizileme analizi
Dizileme
parçacıklar
BWA, Bowtie, mrFAST, vb.
parçacık yerleştirme
(read mapping)
TNP/indel keşfi Yapısal farklılık keşfi
GATK, samtools,
vb.
VariationHunter,
GenomeSTRiP, Delly, vb.
Annovar, snpEff, SIFT, vb. Ingenuity, DADA, vb.
Yorumlama, veritabanı karşılaştırma, gen
önceliklendirme
Protein etkileşimi ve yolak analizi

14. TNP VE KISA INDELLER

15. Amaç
 Referans genomuna hizalanmış kısa parçacıklar
incelendiğinde görülen farklılıklardan gerçek
TNP ve dizileme hatalarının ayırılması
TCTCCTCTTCCAGTGGCGACGGAAC
CTCCTCTTCCAGTGGCGACAGAACG
CTCTTCCAGTGGCGACGGAACGACC
CTTCCAGTGGCGACGGAACGACCC
TNP?
CCAGTGGCGACTGAACGACCCTGGA
CAGTGGCGACAGAACGACCCTGGAG
Dizileme
hatası
Referans TCTCCTCTTCCAGTGGCGACGGAACGACCCTGGAGCCAAGT

16. Zorluklar
 Dizileme hataları
 Tekrar ve duplikasyonlardaki paralog dizi
varyanları
 Hizalama hataları
 TNP ve indellerin yanlış hizalanması
 Kısa ardışık tekrarlar
 Düzeltmek için Çoklu Dizi Hizalaması (ÇDH)
gerekir

17. Başlıca TNP/indel tahmin programları
 Genome Analysis Tool Kit (GATK; Broad
Inst.)
 Samtools (Sanger Centre)
 PolyBayes (Boston College)
 SOAPsnp (BGI)
 VARiD (U. Toronto)

18. TNP tahmin hataları ve filtreleme
 TNP tahminlerinde çok sayıda hata bulunur
 Sistematik okuma hataları, parçacık yerleştirme ve hizalama
hataları
 Ham TNP tahminlerinde %5‐%20 arası yanlış bulgu olabilir
 “Sert” filtreler:
 Okuma derinliği (çok az ve çok fazla derinlik)
 Alel dengesi
 Baz okuma kalitesi
 İplik meyli (strand bias)
 Kısa bölgelerde TNP sayısının fazlalığı
 İstatistiksel filtreler:
 dbSNP, HapMap, mikrodizin verileri ile istatiksel skorlama
 VQSR: Variant Quality Score Recalibration (GATK programında)

19. YAPISAL VE KOPYA SAYISI
VARYASYONU

20. Yapısal ve Kopya Sayısı Varyasyonu
SİLİNME YENİ DİZİ EKLEME TRANSPOZON EKLEME
(deletion) (novel sequence ins.) (transposon insertion)
Alu/L1/SVA
ARDARDA KOPYA AYRIŞIK KOPYA
(tandem duplication) (interspersed duplication)
İNVERSİYON TAŞINMA
(inversion) (translocation)
Kopya sayısı
Varyasyonu
(copy number
variation)
Dengeli
Varyasyon
(balanced
rearrangement)
Otizm, Crohn’s
Hemofili
Şizofreni, sedef
Lösemi (CLL)

21. Keşifteki zorluklar
Silinme ve duplikasyonlar > 5 Kbp; aynı 5 kişinin genonumda
790
283
128
5
634
278
132 84
25
76
130
5
Fosmid klonu
eşli dizileme
End-sequence pair
(N = 1,206)
42 milyon oligolu
arrayCGH
Conrad et al., 2010
(N = 1,128)
Affymetrix 6.0 TNP microdizin
McCarroll et al., 2008 (N = 236)

22. YV için dizi sinyalleri
 Eşli dizi analizi (read pair – RP)
 Tüm YV türleri
 Bulunan YV’lerin büyüklüğü ve yerlerinin kesinliği
eşler arasındaki mesafeye bağlı
 Dizileme derinliği analizi (read depth – RD)
 Sadece silinme ve duplikasyonlar (KSV)
 Bulunan KSV’lerin başlangıç/bitiş yerleri yaklaşık
bulunur
 Ayrık dizi analizi (split read – SR)
 Tekrarsız genomik bölgelerdeki tüm YV türleri
 Bulunan YV’lerin yerleri kesindir
 Yerel ve genel de novo birleştirme
 Tekrarsız genomik bölgelerdeki tüm YV türleri
 Bulunan YV’lerin yerleri kesindir

23. Bazı YV algoritmaları
Silinme Eklenme İnversiyon Transpozon Duplikasyon Mikrosatelit
RP
VariationHunter X Kısa X X X
BreakDancer X Kısa
HYDRA X Kısa X X
Tangram X
RD
WSSD X X
CNVnator X X
RDXplorer X X
SR
Pindel X Kısa
SPLITREAD X Kısa X X X X
lobSTR X
RP+SR
Delly X Kısa
Invy X
GenomeSTRiP X Kısa X
AS
Cortex X X
NovelSeq X

24. 1000 Genomes Projesinde YV
Approach Algorithm name Platform Genomes
SV types discovered (size-range of
validated SVs in basepairs)
SV
calls
valid
ated
FDR
(PCR)
FDR
(array)
FDR
(hierar
ch.)
Event-wise testing Illumina 6 DEL (200 - 221,800); DUP (200 - 415,700) 5,762 1,952 0 0.230 0.230
CNVnator Illumina 6 DEL (100 - 412,475) 17,036 2,361 - 0.142 0.142
AB large indel tool SOLiD 1 DEL (67 - 83,391) 1,138 480 0.188 0.084 0.143
AB large indel tool SOLiD 1 INS (448 - 2,213) 632 42 0.176 - 0.176
Spanner Illumina 6 TEINS (51 - 6,012) 2,013 179 0.022 - 0.022
Spanner Illumina 6 DEL (50-192,167) 4,718 3,619 0.100 0.033 0.087
PEMer 454 1 DEL (941 - 960,004) 1,062 483 0.095 0.363 0.363
VariationHunter Illumina 6 DEL (52 - 498,738) 11,028 4,231 0.103 0.419 0.190
BreakDancer Illumina 6 DEL (51 - 1,035,808) 5,973 3,587 0.115 0.145 0.121
N/A Illumina 6 DEL (276 - 959,518) 3,419 2,584 0.136 0.085 0.121
Mosaik 454 2 TEINS (300 - 6,000) 1,463 172 0.055 - 0.055
Pindel Illumina 6 DEL (51 - 46,384) 3,879 2,960 0.201 0.127 0.189
N/A 454 1 DEL (51 - 703,404); INS (52 - 295) 32,187 3,845 0.545 0.519 0.543
SOAPdenovo Illumina 6 DEL (64 - 3,907) 160 55 0.531 0.531 0.497
SOAPdenovo Illumina 6 INS (55 – 4,116) 3,894 22 0.810 - 0.810
Cortex Illumina 1 DEL(52-39,512);DUP(83-2,090) 2,787 896 0.415 0.415 0.410
Cortex Illumina 1 INS(50-828) 389 84 0.398 - 0.398
NovelSeq Illumina 6 INS (200 - 8,224) 657 30 0.791 - 0.791
IN
Spanner Illumina 6 TANDUP (55-64,230) 256 88 0.049 - 0.049
AS SR PE RD
1000 Genomes Consortium, Nature, 2010

25. Kapsamlı bir metot yok
486
4
3250
303
6855 (63%)
3223 (80%)
1772 (33%)
RP
N=6
RD
N=4
SR
N=4
1000 Genomes Projesi’ndeki
doğrulanmış silinmeler
Kidd et al., Cell, 2010

26. Varyasyon keşfi – özet
 Parçaçık hizalama: BWA, mrFAST, Bowtie
 TNP ve indel: GATK, samtools, SOAPsnp
 Yapısal:
 Silinme, eklenme: VariationHunter, Delly,
BreakDancer, GenomeSTRiP, Pindel, HYDRA...
 İnversiyon: VariationHunter, Invy
 Transpozon: VariationHunter, Tangram
 Mikrosatelit: lobSTR, SPLITREAD, Pindel
http://seqanswers.com/wiki/SEQanswers

27. Analiz yükü
 Tüm genom:
 100 GB ham (sıkışmış), 150 GB işlenmiş veri
 BWA hizalama: 30 CPU günü
 GATK ile SNP/indel (çok aşamalı): 10 CPU günü
 Yapısal varyasyon: 1 – 20 CPU günü
 Ekzom:
 50 GB ham (sıkışmış), 15 GB işlenmiş veri
 BWA hizalama: 1 CPU günü
 GATK ile SNP/indel (çok aşamalı): 15 CPU saati
 Yapısal varyasyon: 1-2 CPU günü

28. Keşif sonrası
 Yorumlama ve etkiler
 snpEff
 VAAST & pVAAST
 PolyPhen2
 Annovar
 SIFT
 SNAP
 MutationTaster
 Evrimsel korunum
 GERP
 phastCons
 Protein etkileşimi ve
yolaklar
 DADA, VAVIEN, vb.
 Protein yolakları
 Ingeniuty, vb.
Cooper & Shendure, Nature Reviews Genetics, 12(9):628-40, 2011

29. “İsviçre çakısı”: GEMINI

30. Özet
 DNA dizileme ucuzlamakta: tüm genom ($1,500-$5,000),
tüm ekzom ($800-$900).
 Analiz için güçlü ve pahalı bilgisayar sistemleri gerekli
 Örn: 32 çekirdekli sistem ~$25,000; 90 TB depolama sistemi ~$25,000
 Hemen her tür genetik varyasyon bulunabilir:
 Translokasyon ve inversiyon en zorları
 KSV tüm genom ile nispeten kolay, ekzom ile sınırlı
 Varyant etkisi, haplotipleme (fazlama), akraba
evliliklerinde homozigosite haritalama gibi ek analizler
yapılabilir
 Hastalık için nedensel varyantların bulunması “bilimden
çok sanat”