Ubikitin, tüm ökaryotik hücrelerde bulunan, primer yapısı yüksek oranda korunmuş, ısıya dayanıklı, 76 amino asitlik bir polipeptittir. Ubikitin hedef proteinlere ubikitinasyon adı verilen posttranslasyonal bir reaksiyon ile kovalent olarak bağlanır. Bir protein, bir veya daha fazla lizini üzerinden bir ubikitin monemeri ile konjuge olabileceği gibi (monoubikitinasyon), lizin uzerinden bağlanmış ubikitin zincirleri ile de (poliubikitinasyon) bağlanabilir. Sadece dört veya daha fazla ubikitinin 48. lizin (K48) üzerinden oluşmuş poliubikitin zinciri ile modifiye olmuş proteinler proteazoma sevk edilir. Proteazom tripsin benzeri, kimotripsin benzeri ve kaspaz benzeri olmak üzere 3 enzim aktivitesi gösterir. Bu aktiviteler sonucu poliubikitine proteinleri yıkma eğilimindedir. Bu sistemde oluşacak bozukluklar, inflamasyon, immün bozukluklar, kistik fibröz, viral enfeksiyon, diyabet ve kalp hastalıkları gibi birçok hastalığa öncülük eder. Kanser üzerine yapılan çalışmalarda son yıllarda proteazom inhibisyonuna olan ilgi artmıştır. Bunun temelini büyük ölçüde Bortezomib’in klinikteki başarısı oluşturmaktadır. Bortezomib özellikle Multipl miyelomada etkili olsade geniş antitümöral aktivitesi ile prostat ve meme kanserinde de kullanılmaktadır. Bunun yanında laktasistin gibi birçok doğal proteazom inhibitörleri üzerinde durulmuştur. Bizim çalışma amacımız bazı sentetik ve doğal sekonder metabolitlerin meme kanserinde antiproteazomal aktivitesinin taranmasıdır. Asteraceae familyasından olan Centaurea urvillei DC. subsp. Urvillei ’den izole edilen 14 madde ve N-(sübstitüe)-fenil-2-(açilamino)asetamid, propanamit ve sülfonamit grubu 14 sentetik bileşik çalışmada kullanılmıştır. Çalışma sonucunda özellikle bitkisel metabolitlerde aktivite gözlenmiş ve kamferol ve apigenin’in meme kanserinde apoptozisi indüklediği tespit edilmiştir. Bu da bu bileşiklerin antiproteazomal aktivite yoluyla meme kanserinde umut verici ilaç aday molekülleri olabileceğini göstermiştir. İleride yapılacak çalışmalar ile, söz konusu bileşiklerin antiproteazomal etkilerinin meme kanserine spesifik olup olmadığı, diğer kanserlerdeki etkinliği incelenerek tespit edilmeye çalışılacaktır. Antiproteazomal etkinliğinin tüm proteazom substratlarda mı etkin olduğu yoksa bazı spesifik substratlara mı etki ettiği, ayrıca proteazomun hangi enzimatik aktivitesinin inhibe edildiği gelecekte yapılması planlanan çalışmalardır.

1. BİR GRUP SENTETİK VE BİTKİSEL SEKONDER BİLEŞİĞİN MEMELİ UBİKİTİN PROTEAZOM SİSTEMİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN HÜCRE VE MOLEKÜLER BİYOLOJİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI

2. Genel Bilgiler

3. UbikitinProteazom Sistemi UPS ökaryotik hücrelerde istenmeyen proteinlerin yıkımından sorumlu olan temel yolaklardan birisidir. UbikitinProteazom Sistemi Otofaji

4. UPS vs Otofaji

7. Yapısında 7 adet lizin bulundurur. Poliubikitin zincir oluşumlar bu noktalardan kaynaklanır.

9. PROTEAZOM

10. Kanser Tedavisinde UPS’nin Hedef Alınması 1) UbLigazların(E3) Hedeflenmesi Ubikitinligazlar spesifik substratlarınyıkımına aracılık eder. Kanser tedavisi için ilaç geliştirmede bu enzimlerin aktif kısımlarının veya bu kısımların substratlarla etkileşmesinin hedeflenmesinin, daha az yan etkiye sahip selektif ilaçlar oluşturacağı düşünülerek bu yönde çalışmalar yapılmaktadır.

11. 2) Deubikitinasyon Enzimlerinin Hedeflenmesi DUB, ubikitine edilmiş proteinleri tanıyarak ubikitin eklentilerini kaldırır ve bu sayede sistemi geri dönüşlü kılar. İnsan DUB’larıonkojenik veya tümör baskılayıcı E3 ligazların direk antagonistleridir ve artan şekilde kanser tedavisinde potansiyel hedefler olarak görülmektedir. Kanserle ilgili süreçleri kontrol eden nükleer DUB’lar umut vadeden adaylardır.

12. 3) Proteazomun Hedeflenmesi Ubikitine olmuş proteinler, hücre içi proteinlerin büyük bir kısmının yıkımından sorumlu sorumlu olan dev protein kompleksine, proteazomayönlendirilirler. Proteazomdaki değişiklikler insanlardaki birçok rahatsızlıkla ilişkilendirilmiştir. Bunlara örnek olarak kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kistik fibröz verilebilir.

13. 3)Proteazomun Hedeflenmesi Proteazom inhibitorü ilaçlar, özellikle hızla prolifere olan hücrelerde etkildir. Bu kanser hücrelerinin proteazomu kendi faydaları için kullanıyor olabileceğini göstermektedir. Virüslerin, MHC sınıf antikorları hücreyi ele geçirmek için proteazoma sevk etmelerine benzer şekilde, kanserli hücrelerde de tümör süpresan proteinlerin yıkımı özellikle artmıştır.

14. 3)Proteazomun Hedeflenmesi NPI-0052 ve bortezomib gibi düşük dozda proteazom inhibitörlerinin kombinasyonlarının in vitro ortamda kanser hücreleri üzerine sinerjistetkileri önemli gelişmelerdir. Ayrıca belirgin substrat seçiciliğine sahip proteazom inhibitörlerinin gelişimi biyoyararlanımıarttırıp, toksisiteyi azaltmış ve inatçı tümörlerde geniş kullanımı için kapıyı açmıştır.

15. Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar Hücre kültüründen gelen verilerin büyük çoğunluğunun doğruluğu klinik uygulamalarda kanıtlanmış ve ubikitin sistemini hedef alan stratejilerin gelişimine izin vermiştir. Henüz hücre kültürü çalışmalarından elde edilen sonuçlar her zaman için in vivo modellerdeki bulguları yansıtmamakta olup hasta tümör örneklerini ve fare modellerini analiz etmek gerekli olacaktır

16. Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar Ubikitinsinyal yolakları hücre transformasyonu veya metastazı esnasında diğer onkojenikkaskatlar ile birlikte hareket etmektedir. Bu gibi olayların dinamiğini ve kompleksliğini in vivo ortamda anlamak için fazla sayıda hastadan alınan primer tümör materyali ile geniş kapsamlı proteomik ve genomik çalışmalar başlatılması gerekecektir.

17. Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar Tümörlerde ubikitin sisteminin anormal bileşenlerine daha ileri müdahaleler için, ubikitinkonjugatları ve lizatlarınıninhibisyonu, substrat tanımlanmasının önlenmesi, ubikitine bağlanımın engellenmesi ve yeni proteazom inhibitörlerinin geliştirilmesini içeren yaklaşımlar geliştirilmektedir. Özellikle spesifik ubikitin ligaz inhibitörlerinin geliştirilmesine yönelik çabalar gibi bazı durumlarda sonuçlar hayal kırıklığı yaratmaktadır. Diğer taraftanyeni proteazom inhibitörleri geliştirmeye yönelik çabalar daha verimli olmaktadır.

18. Gereçler ve Yöntemler

19. Hücre Kültürü Çalışmalarda MCF-7 meme kanseri (breast cancer) hücre hattı kullanılmıştır. PCR-tabanlı mikoplazma kontrolü ile hücre hattının kontaminasyonsuz olduğu konfirme edilmiştir. 1X105sayısındaki MCF-7 hücreleri 12 kuyucuklu petrilere ekilmiştir. Bir gün sonra, DMSO’da çözünmüş bileşenler eklenmiş ve 24 saat inkübe edilmiştir. Bu işlem sonunda hücreler tripsinize edilip iki defa 1’er ml 4C’deki PBS ile yıkandı. 10.000 rpm’de birer dakika 4C’de santrifüj edilerek hücreler toplandı.

20. Hücrelerin Hazırlanması ve Protein Miktar Tayini Hücreler, lizatlama tamponuna proteazom inhibitör kompleks eklenerek 5 dakikada bir vortekslemek yoluyla 20 dakika süreyle lizatlanmıştır. Hücre pelletini uzaklaştırmak için 14.000 rpm’de 10 dakika boyunca 4C’de santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatantlar temiz mikrosantrifüj tüplerine transfer edilmiştir. BCA-protein deney kiti (Pierce) kullanılarak toplam protein miktarlarına bakılmıştır.

21. Western Blotlama Elektroforezişlemiylepoliakrilamidjeldegöçettirilenproteinler, PVDF membranatransfer ile immobilize edilmişvemembrandakiproteinlerintayiniimmünolojikmetotlarlayapılmıştır. Primer antikorolarak anti-poliubikitinve anti-aktinantikorları; sekonderantikorolarak goat-anti-mouse antikorukullanılmıştır.

22. BULGULAR

23. İzole edilmiş sekondermetobolitlerinantiproteazomal aktivitesinin incelenmesi MCF-7 hücreleri 1 ml besiyeri içerecek şekilde incelenecek maddelerin ilavesinden 24 saat önce ekildi. Ertesi gün, hücrelere 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonu olacak şekilde maddeler uygulandı. Elde edilen verilere göre sadece B2, B12, B13 ve B14 anlamlı bir şekilde (2.5 kattan fazla) proteazomuinhibeetmiştir. Belirtilen dozlarda en yüksek aktivite, kontrole göre 6.1 oranında ubikitine protein birikimi göstererek 100 M konsantrasyonda B12 kod numaralı 3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozit olmuştur.

24. B2 B2 kod numaralıhispidulin-7-O-β-D-metilglukuronopiranozit’in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi

25. B12 – B13 – B14 B12 kod numaralı3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozit, B13 kod numaralısalidrozit ve B14 kod numaralı eriyodiktiyol-7-O--D-glukuronopiranozit‘in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi

26. İncelenen 14 sekonder bileşikten bazılarının belirtilen konsantrasyonlarda yüksek aktivite göstermesi, bazılarının ise miktarlarının az olması nedeniyle sekonder bileşiklerden 0.05 ve 0.5 mM konsantrasyonlarında yeni stok çözeltiler hazırlanmıştır. İkinci tur çalışmalarda 0.05, 0.5 ve 2 M final konsantrasyondaki sekonder bileşikler MCF-7 hücrelerine uygulanmıştır.

27. Bu düşük doz uygulamada B1, B3, B4 ve B8 kod numaralı bileşikler dışındaki tüm bileşikler anlamlı derecede antiproteazomal aktivite göstermiştir. Belirtilen düşük dozlarda en yüksek aktivite, kontrole göre 11.8 oranında ubikitine protein birikimi göstererek 0.5 M konsantrasyonda B6 kod numaralı kamferol olmuştur.

28. kamferol

30. Sentezlenmiş maddelerin antiproteazomal aktivitesinin incelenmesi 14 adet sentezlenmiş madde 50 mM konsantrasyonunda DMSO’da çözülerek stok çözeltileri hazırlandı. MCF-7 hücreleri 1 ml besiyeri içerecek şekilde incelenecek maddelerin ilavesinden 24 saat önce ekildi. Ertesi gün, hücrelere 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonu olacak şekilde maddeler uygulandı. Doğal bileşiklere göre incelenen sentetik bileşiklerin antiproteazomal aktiviteleri oldukça düşük bulunmuştur.

31. K14 K14 kod numaralıN- (2-klorofenil)-2-(1,3-diokso-1,3-dihidro-2H-izoindol-2-il)etansülfonamit‘in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi.

33. C K11 K13 Mg C K11 K13 Mg poliubikitin aktin LICOR ODYSSEY AhmetUygarÖrstarafındanyapılmıştır.

34. TARTIŞMA

35. Apigenin-7-O-β-D-metilglukuronopiranosid, naringenin-7-O-β-D-glukuronopiranosid ve hispidulin-7-O-β-D-glukuronopiranosid dışındaki incelenen tüm bitkisel sekonder bileşikler, değişen oranlarda total poliubikitine protein miktarında artışa neden olmuştur. İmmünoblotlama sonuçlarına göre incelenen örnekler arasında kamferol en aktif proteazom inhibitörü bileşiktir. kamferol > apigenin > eriyodiktiyol-7-O-β-D-glukuronopiranosid > 3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozid > salidrosid

36. Kamferolün çeşitli meme kanser hücre hatlarında apoptozu indüklediği birçok çalışma ile gösterilmiştir. Salidrosid ve glukopiranozidin antiproteazomal etkileri ilk kez bu çalışma ile rapor edilmiştir. İlginç olarak luteolin ve hidroksikamferol glukuronopiranozid; kullanılan konsantrasyona bağımlı olarak hem proteazomal aktivasyon hem de inhibisyon göstermektedir

37. GELECEKTEKİ ÇALIŞMALAR

38. İleride Yapılacak Çalışmalar İle Söz konusu bileşiklerin antiproteazomal etkilerinin meme kanserine spesifik olup olmadığı, diğer kanserlerdeki etkinliği tespit edilerek Antiproteazomal etkinliğinin tüm proteazomsubstratlarda mı etkin olduğu yoksa bazı spesifik substratlara mı etki ettiği, Ayrıca proteazomun hangi enzimatik aktivitesinin inhibe edildiği incelenecektir.

39. TEŞEKKÜRLER

40. Yrd. Doç. Dr. PetekBallar Prof. Dr. AysunPabuçcuoğlu Arş. Gör. AhmetUygarÖrs Doç. Dr. CananKaraalp Yrd. Doç. Dr. ZeynepSoyer Prof. Dr. MetinerTosun