miRNAデータ解析入門_第23回勉強会資料

m i R N A データ解析入門
第 2 3 回勉強会資料
2013年6月15日

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2
m i R N A とは
• タンパク質をコードしない、ノンコーディングRNAの一種
• 他の遺伝子のイントロンのアンチセンス鎖などから転写
される
• 転写後、ヘアピン構造のprecursor miRNAになった後、
Dicerによって切り出されて長さ20～25bp程度のmature
miRNAとなって機能する
• miRNA上の一部分が他の遺伝子の一部分に結合する
ことで遺伝子の発現が制御される
• 細胞の発生、分化、増殖、がん化などに深く関与するこ
とが知られている
http://ja.wikipedia.org/wiki/MiRNA

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3
BioToday 2013-05-10
マイナビウーマン 2013-04-27
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日経バイオテクONLINE 2013-04-11

4
m i R N A 解析の一般的な流れ
Single-endで
シーケンシング
アダプタを除去
10bp未満を
破棄
既知配列と比較
mature miRNA, other ncRNA,
exon, intergenic/intronic
既知
miRNA
発現量正規化
TPM（*1）
サンプル間比較
SAM（*2）、Fold Change
*1: transcript per million
*2: Significance Analysis of Microarrays
データのクリーニング・解析前処理
アノテーション
リードを
クリーニング
既知 other ncRNA
参考：
BMC Genomics. 2010 May 7;11:288. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20459673
BGI Japan http://www.bgisequence.com/jp/services/sequencing-services/rna-sequencing/small-rna-sequencing/
intergenic/intronic
にある
未知転写物
新規
miRNA
新規miRNA予測
ターゲット予測
Pathway分類
GO分類
発現比較
転写物＋両端70bpを
miRNA予測
既知 exon
uniqueなFastaに変換してから解析することが多い
二次構造や
既知モデルとの比較
Pathway分類
GO分類

5
m i R N A のシーケンシング
• 原則的にSingle End
• シーケンシング長は35～50bp程度で十分
• miRNAのキャプチャキット
– mirVana™ miRNA Isolation Kit （ライフテクノロジー）
– TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit （イルミナ）など

6
テストデータを用いた解析例

テストデータ
• 哺乳類miRNAをGAII、Single End でシーケンシングした結果が公開されている
– http://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/study?acc=ERP000773
• 今回はそのうちのヒト由来3組織×2サンプル＝計6サンプルを使用
7
ID 説明リード長リード数
ERR038405
ヒト
脳由来
miRNA
43 21,758,606
ERR038406 43 20,241,515
ERR038410
肝臓由来
51 10,514,371
ERR038411 26 8,399,589
ERR038415
精巣由来
26 7,130,991
ERR038416 26 9,378,202

8
テストデータのクオリティをチェック
• FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）でチェック
– → クオリティスコアの低いリードが入っている
– → 一部のサンプルでアダプタ配列が混入している
クリーニングが必要

クリーニング
• クリーニング条件
– クオリティスコアが20未満の塩基を80%以上含むリードを破棄
– クオリティスコアが20未満の塩基をトリミング
– トリミングの結果、10bpより短くなったリードを破棄
• FastX-Toolkit（fastq_quality_filter、fastq_quality_trimmer）でクリーニング
• クリーニング前後のリード配列を、FastQC
（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）でチェック
9
$ fastq_quality_filter -i SRR060981.fastq
-q 20 -p 80 -Q33 | fastq_quality_trimmer -t 20
-l 10 -Q33 -o SRR060981_clean.fastq

10
クリーニング前後のクオリティ比較
クオリティの悪い塩基・
リードが除去された

アダプタ配列除去
• 一部のサンプルで以下のアダプタの混入が確認された
– Illumina PCR Primer Index 1
• TACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTTC
• CTACAGTCCGACGATCTCGTATGCCGTCTT
– Illumina Single End Adapter 2
• TCGTATGCCGTCTTCTGCTTGAAAAAAAAA
• cutadapt（http://code.google.com/p/cutadapt/）を用いてアダプタ除去を行った
11

• cutadapt実行前後の各アダプタ（全長）出現数
12
ID Illumina PCR Primer Index 1
TACAGTCCGACGATCTCGTA
TGCCGTCTTC
Illumina PCR Primer Index 1
CTACAGTCCGACGATCTCGT
ATGCCGTCTT
Illumina Single End Adapter 2
TCGTATGCCGTCTTCTGCTT
GAAAAAAAAA
除去前除去後除去前除去後除去前除去後
ERR038405 8 0 16 0 3 0
ERR038406 264 0 495 0 45 0
ERR038410 2 0 2 0 0 0
ERR038411 0 0 0 0 0 0
ERR038415 0 0 0 0 0 0
ERR038416 0 0 0 0 0 0
アダプタが全長で入っているようなものは完全に除去できた
→アダプタが断片的に入っているようなものはどうか？

• cutadapt実行前後の各アダプタ（前半15塩基）出現数
13
TGCCGTCTTC
ATGCCGTCTT
GAAAAAAAAA
ERR038405 82 45 99 39 552 0
ERR038406 1,402 91 2,217 78 21,281 11
ERR038410 2 0 2 0 3 0
ERR038411 5 0 4 1 38 0
ERR038415 27 0 14 0 77 0
ERR038416 154 3 124 2 995 0
「アダプタ断片」は少し残っている可能性がある

• cutadapt実行前後の各アダプタ（後半15塩基）出現数 ※赤字配列をgrep
14
TGCCGTCTTC
ATGCCGTCTT
GAAAAAAAAA
ERR038405 552 0 130 0 3 0
ERR038406 21,281 11 4894 3 48 3
ERR038410 3 0 2 0 0 0
ERR038411 38 0 0 0 0 0
ERR038415 77 0 0 0 0 0
ERR038416 995 0 3 0 0 0
※3つ目のアダプタの
前半15塩基と同じ
「アダプタ断片」は少し残っている可能性がある

15
アノテーション
• fastqをfastaに変換（配列が同一のものは1つにまとめる）
• 作成したfastaを、既知mature miRNAデータにマッピング（blastn）し、
最もe-valueの小さい結果を採用した
• mature miRNAにマッピングできなかったものはprecursor miRNA、
ncRNA、既知遺伝子の順にマッピングし、アノテーションをつけた
miRBase V19
mature miRNA
miRBase V19
precursor miRNA
Rfam V11
other ncRNA
refSeq Gene
not
mapped
not
mapped
not
mapped

16
既知 h u m a n m a t u r e m i R N A の発現比較
• サンプルごとに総リード数は異なる（＝実験時のバイアスなど）
→サンプル間で発現を比較するには補正が必要
ID アダプタ
除去後
ERR038405 59,245
ERR038406 723,434
ERR038410 460
ERR038411 32,323
ERR038415 157,294
ERR038416 656,099
例えばあるmiRNAが
ERR038406に15リード、ERR038410に13リード
あった場合、単純に
「ERR038406のほうが発現が高い」とは言えない
→「マップできたリード数」などで補正する

17
• 各サンプルにおける発現量（補正前）

18
• 各サンプルにおける発現量（補正後）
– 「human mature miRNAにマップできたリード数（単位：100万）」で割る

19
• 補正による発現量の変化の例
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
ERR038405 ERR038406 ERR038410 ERR038411 ERR038415 ERR038416
hsa-let-7g-5p
補正前
補正後

20
ヒートマップ図
• 補正後の発現量データをRに読み込む
> mirna <- read.table("補正後の発現量ファイル", header=T,
row.names=1)
補正後発現量の合計が大きい順
50データを用いた

21
ヒートマップ図
• 組織ごとにクラスタリングされた
• 肝臓でmir-122の発現が高かった
（赤矢印）
• mir-122は肝臓特異的に発現する
miRNAであることが論文で報告さ
れている[1]
脳脳肝
臓
肝
臓
精
巣
精
巣
[1] Landgraf P, et al.
A mammalian microRNA expression atlas based on
small RNA library sequencing.
Cell. 2007 Jun 29;129(7):1401-14. PubMed PMID: 17604727

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まとめ
• miRNAシーケンシングデータ解析で留意すべき点
– アダプタが混入していたら、適切に除去する
– 既知miRNAやncRNAにマッピングしてアノテーションをつける
– 新規miRNAを予測するソフトもある
– 発現量を比較する場合は「マッピングできたリード数」などで補正する

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