В рамках Сетевой научно-практической конференции.

1. ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н.
Ульянова»
МБОУ «Лицей №2» г. Чебоксары
Липосомация как способ повышения
биологической усвояемости доклинически
активных противотуберкулезных соединений на
основе производных 2-ацил(ароил)-1,1,3,3-
тетрацианопропенидов натрия.
Картмасова Наталия
класс М-10-2 МБОУ «Лицей№2»
г. Чебоксары
E-mail: natasha.kartmasova@mail.ru
Мареева Татьяна
класс М-10-2 МБОУ «Лицей№2»
г. Чебоксары
E-mail: mareeva-tatyana@mail.ru
Научный руководитель
Ростилова Евгения Александровна,
магистрант 2 курса ХФФ ФГБОУ ВПО
«ЧГУ им. И. Н. Ульянова».
Михайлова Тамара Васильевна,
учитель химии высшей категории
МБОУ «Лицей № 2»
Научный консультант
Карпов Сергей Владимирович,
к.х.н., ассистент кафедры органической химии
ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова».
Чебоксары - 2013

2. Введение.
Биологическая усвояемость лекарственных препаратов – одна из наиболее
важных и актуальных задач современной фармацевтической технологии. Один из
способов усилить ее – увеличение дозы лекарства. Однако большинство современных
антибиотиков токсичны в больших дозах. Это особенно важно в отношении
противотуберкулезных и противораковых препаратов, т.к. первые являются сильными
ингибиторами МАО, а вторые низкоспецифичны по отношению к мишени.
В настоящее время одним из перспективных способов внутритканевого
направленного транспорта лекарственных средств является использование
супрамолекулярных систем - липосом. С помощью заключения противотуберкулезного
лекарственного средства в липосомы можно значительно повысить биологическую
усвояемость препарата с сопутствующим снижением эффективной концентрации.
Наряду с липосомами в качестве средств адресной доставки лекарств также
используются полимерные микрокапсулы [2]. Такие капсулы состоят из веществ,
способных разрушаться под действием электромагнитного излучения. Эти
неорганические соединения в момент «вскрытия» капсулы распадаются на «мелкие
осколки», оставаясь в организме человека. Как показали исследования, липосомы могут
быть использованы как более эффективный и безопасный способ доставки [10].
Задачей проекта являлось освоение метода получения липосом, содержащих
внутри себя биологически активное вещество с целью увеличения биологической
усвояемости этого вещества, обоснование выбора липосом в качестве межтканевого
способа доставки лекарственных средств, изучение методов получения новых веществ
активных по отношению к палочке Коха.
Липосомы, как средство адресной доставки лекарственных
препаратов.
Адресная доставка лекарственных средств – это направленный транспорт
лекарственного вещества в заданную область организма, органа или клетки.
Направленная транспортировка лекарств в очаг развития заболевания позволяет
добиться повышения эффективности уже существующей лекарственной терапии. Такая
адресная доставка обеспечивает более эффективное действие лекарства и сохраняет
окружающие ткани [1].
Липосомы – это микроскопические заполненные жидкостью сферические
частицы, мембрана (оболочка) которых состоит из фосфолипидов, функционально
аналогичных природным, входящим в состав клеточной мембраны. Фосфолипиды
являются дифильными веществами, молекулы которых содержат гидрофильные и
гидрофобные части. Это свойство придает фосфолипидным молекулам
самопроизвольно образовывать в воде мембраны, которые представляют собой
двойной слой липидных молекул, называемый липидным бислоем [3]. Стремление
максимально ограничить контакт неполярных цепей липида с водой приводит к тому,
что бислой при его достаточной протяженности замыкается сам на себя, образуя полые
оболочечные структуры. Размеры и форма липосом зависят от кислотности среды,
присутствия солей и т. д.
Свойства липосом определяется, прежде всего, наличием у них замкнутой
мембранной оболочки. Несмотря на малую толщину (около 5-20 нм), липидный бислой
отличается хорошей механической прочностью и гибкостью. Вместе с тем гибкость
бислоя и его текучесть придают липосомам высокую пластичность. Так, липосомы
меняют размеры и форму в ответ на изменение осмотической концентрации внешнего
водного раствора. При сильном осмотическом стрессе целостность бислоя может
нарушиться и липосомы могут раздробиться на частицы меньшего размера.

3. Липосомы могут быть однослойными (диаметр 25...30 нанометров) и
многослойными (5...50 микрометров) (рис.1 а, б). Заштрихованные тоны – место
нахождения воды, светлые – бимолекулярный липидный слой, «хвосты» составляющих
его молекул обращены внутрь слоя.
а) б)
Рис. 1. Структуры липосом: а) многослойная липосома; б) однослойная липосома
Для практического применения липосом исключительно важна их способность
включать в себя и удерживать вещества различной природы. Круг таких веществ
необычайно широк - от неорганических ионов и низкомолекулярных органических
соединений до крупных белков и нуклеиновых кислот. Способность липосом включать
в себя вещества дает поистине уникальные возможности для решения некоторых
медицинских проблем. Так, многие лекарственные препараты имеют низкий
терапевтический индекс. Это означает, что концентрация, в которой они оказывают
лечебное действие, мало отличается от концентрации, при которой препарат становится
токсичным. В других случаях лекарственный препарат при введении в организм может
быстро терять активность под действием инактивирующих агентов. Включение таких
препаратов в липосомы может значительно повысить их терапевтическую
эффективность, поскольку, с одной стороны, препарат, находящийся в липосоме,
защищен ее мембраной от действия неблагоприятных факторов, а с другой - та же
мембрана не позволяет токсичному препарату превысить допустимую концентрацию в
биологических жидкостях организма. Липосома в данном случае выполняет роль
хранилища, из которого препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах и в
течение требуемого промежутка времени [7].
Липосомы могут быть изготовлены из природных липидов и такие системы
являются нетоксичными, не вызывают нежелательных иммунных реакций и
биодеградируемы, то есть разрушаются под действием обычных ферментов,
присутствующих в организме. Известно, что липиды, входящие в состав мембран,
занимают от 20 до 80 процентов их массы. Поэтому при правильном подборе
компонентов липосом их введение в организм не вызывает негативных реакций.
Второе важное свойство липосом – это универсальность. Это возможность
поручать липосомам, переносить широкий круг фармакологически активных веществ:
противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины, а
также дополнительные источники энергии для клетки, генетический материал.
В-третьих, липосомы сравнительно легко разрушаются в организме,
высвобождая доставленные вещества, но в пути следования липосомы, сами лишенные
свойств антигена, надежно укрывают и свой груз от контакта с иммунной системой и,
стало быть, не вызывают защитных и аллергических реакций организма.
Важную роль играет также характер взаимодействия липосом с клетками. Оно
может принимать разные формы: самая простая – липосомы адсорбируются
(прикрепляются) на клеточной поверхности. Дело может на этом закончиться, а может
пойти дальше: липосому поглотит клетка (этот процесс «заглатывания» называется
эндоцитоз), и вместе с ней внутрь клетки попадут те вещества, которые она доставила.
Наконец, липосомы могут слиться с мембранами клеток и стать их частью.[3].

4. Чтобы липосома безошибочно нашла клетку-мишень, в нее встраивают
фрагменты плазматических или внутриклеточных мембран, различные белки или
ферментные комплексы, изучают механизмы генерации энергии в клетке, рецепции
межклеточных взаимодействий, транспорта воды и различных веществ через
мембраны, а также механизмы взаимодействия с мембранами различных
лекарственных препаратов.
За сравнительно короткий срок липосомы превратились из простой модели,
имитирующей клеточные мембраны, в объект активных научных исследований и
практического применения. Они имеют ряд преимуществ при использовании в их
качестве носителей лекарственных препаратов для селективного накопления
действующих веществ в патологических очагах. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
разработаны липосомальные системы доставки противоопухолевых препаратов [8].
Туберкулезные заболевания. Лекарственные средства.
Туберкулез (от лат. tuberculum — бугорок) — широко распространенное в мире
инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое различными видами
микобактерий, как правило, Mycobacterium tuberculosis (палочка Коха). Различают
открытую и закрытую формы туберкулеза. При открытой форме очаг туберкулеза
распространен по всему объему легких и больной очень заразен, при закрытой форме
один крупный очаг. Во всех случаях очаг окружен капсулой из соединительной ткани,
но в случае закрытой формы она более прочная, что мешает проникновению
лекарственным препаратам [4].
Самый распространенный метод лечения туберкулеза – это схема с
применением изониазида (рис.2). Но из-за высокой токсичности возникает сложности в
лечении. В 2007 году зарубежными авторами была опубликована работа, посвященная
исследованию метаболизма изониазида в организме человека. Ими было установлено,
что противотуберкулезное действие оказывает не сам изониазид, а его естественный
метаболит в организме (рис.3в).
Рис. 2. Гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид)
В 2010 году этим же коллективом авторов был синтезирован ряд соединений,
обладающие структурной схожестью с активным центром метаболита и показано, что
соединения обладают противотуберкулезным действием (рис.3а). В отличие от самого
изониазида эти соединения не содержат гидразидные группы и не являются
ингибиторами МАО [5,6].
В лаборатории химико-фармацевтиеского факультета ЧГУ было синтезировано
вещество, по своей структуре схожее с противотуберкулезным веществом зарубежных
авторов, оно включает дополнительные формакофорные группы, которые повышают
биологическую активность (рис.3б). Данное вещество прошло доклинические
испытания в Республиканском туберкулезном диспансере на 9 штаммах, три из
которых были резистентными. В результате 2 из 3 резистентных штамма прекратили
свое развитие под действием этого вещества, а третий резко замедлил свой рост [9].

5. а) б)
в)
Рис. 3. Структурная формула: а) искусственно синтезированное вещество, схожее с метаболитом
[10,11]; б) синтезированное вещество на основе АЦТП;
в) метаболит изониазида;
Применение синтезированного вещества совместно с липосомами позволит
создать новый лекарственный препарат против туберкулеза, который позволит сделать
его менее токсичным и увеличить биологическую усвояемость.
Получение липосом.
В разработанном нами методе для приготовления липосом использовалась смесь
фосфолипидов входящих в состав биологической добавки под торговым названием
«Лецитин» с содержанием фосфолипидов не менее 25%.
Для получения липосом был приготовлен 0,01 М раствор фосфолипидов в
безводном бензоле. Далее был приготовлен 1% раствор калиевой соли активного
вещества, полученного из 2-ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропенида в воде. Для этого
была взята навеска (0,1г) вещества и добавлена в термостойкий стакан с водой. После
этого проводили нагревание и перемешивание на магнитной мешалке. Для получения
калиевой соли вещества и растворения суспензии был добавлен насыщенный раствор
карбоната калия. Далее, приготовленные реагенты были смешаны в соотношении 10
частей раствора фосфолипидов в бензоле к 1 части раствора активного вещества.
Эмульсия была помещена в круглодонную колбу. Липосомы получали методом
ультразвуковой сонификации. Озвучивание проводили в ультразвуковой ванне с
использованием аппарата «techpan Type UM-1»
Полученную суспензию помещали в вакуум и упаривали бензол до
превращения системы в пастообразную массу. После чего в систему добавляли воду и
снова упаривали бензол. Процесс повторялся до полного удаления бензола. В процессе
упаривания летучего растворителя происходит уменьшение объема системы.
Результаты исследования.
В результате эксперимента нами были получены липосомы с высокой степенью
однородности и средним диаметром около 10 мкм, содержащие в себе водный раствор
активного вещества. Высокая степень однородности и малый диаметр позволит создать
новый эффективный лекарственный препарат для борьбы с туберкулезными
заболеваниями. Такой препарат позволит бороться с различными формами
туберкулезных заболеваний резистентных к другим видам лечения. На рис. 4 показаны
снимок липосом под микроскопом.

6. Рис. 4. Липосомы под микроскопом. Увеличение в 1000 раз.
В дальнейшем мы планируем улучшить наш метод получения липосом, изучить
стабильность во времени, в зависимости от различных факторов, провести испытания
биологической активности полученных липосом содержащих известный антибиотик
«Фуразолидон» по отношению к кишечной палочке и сравнить полученные результаты
с литературными данными для нелипосомальных систем.
Литература.
1. http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1411
2. http://www.nanonewsnet.ru/news/2010/polimernye-mikrokapsuly-s-unt-kak-sredstvo-
dostavki-lekarstv
3. http://n-t.ru/nj/nz/1988/0601.htm, Кобринский Г. Липосомы в медицине // Наука и
жизнь. 1998. № 6. (Электронная версия: НиТ. Научные журналы, 2002). 5
4. http://ru.wikipedia.org
5. Delaine T., Bernandes-Genisson V., Stigliani J-L., Gornittka H., Meunier B.,
Bernadou J. Ring-Chain Tautomerism of Simplified Analogues of Isoniasid-NAD(P)
Adducts: an Experimental and Theoretical Study. – Eur. J. Org. Chem. – 2007,
P.1624-1630.
6. Delaine T., Bernandes-Genisson V., Stigliani J-L., Gornittka H., Meunier B.,
Bernadou J. Development of isoniazideNAD truncated adducts embedding a
lipophilic fragment as potential bi-substrate InhA inhibitors and antimycobacterial
agents– Eur. J. Org. Chem. – 2010, P. 4554 – 4561.
7. Барсуков Л. И. Липосомы//Соровский образовательный журнал, №10, 1998, С. 2-
10.
8. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как
средство доставки противоопухолевых препаратов. // Вестник РАМН, №3,
2012. С. 23-31.
9. Карпов С.В. Взаимодействие 2-ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропенидов
натрия с галогеноводородами.// Автореф. диссертации на соиск. уч. степ. к.х.н. –
Казань, 2012.
10. Мухамадияров Р.А., Веремеев А.В., Марцияш Н.Е., Зинчук В.Г. Влияние α-
токоферола на динамику процессов липопероксидации в липосомах,
полученных методами ультразвуковой сонификации и экструзии, при различных
температурах хранения.// Фундаментальные исследования, № 6, 2012, С. 566-
570.

7. Рис. 4. Липосомы под микроскопом. Увеличение в 1000 раз.
В дальнейшем мы планируем улучшить наш метод получения липосом, изучить
стабильность во времени, в зависимости от различных факторов, провести испытания
биологической активности полученных липосом содержащих известный антибиотик
«Фуразолидон» по отношению к кишечной палочке и сравнить полученные результаты
с литературными данными для нелипосомальных систем.
Литература.
1. http://thesaurus.rusnano.com/wiki/article1411
2. http://www.nanonewsnet.ru/news/2010/polimernye-mikrokapsuly-s-unt-kak-sredstvo-
dostavki-lekarstv
3. http://n-t.ru/nj/nz/1988/0601.htm, Кобринский Г. Липосомы в медицине // Наука и
жизнь. 1998. № 6. (Электронная версия: НиТ. Научные журналы, 2002). 5
4. http://ru.wikipedia.org
5. Delaine T., Bernandes-Genisson V., Stigliani J-L., Gornittka H., Meunier B.,
Bernadou J. Ring-Chain Tautomerism of Simplified Analogues of Isoniasid-NAD(P)
Adducts: an Experimental and Theoretical Study. – Eur. J. Org. Chem. – 2007,
P.1624-1630.
6. Delaine T., Bernandes-Genisson V., Stigliani J-L., Gornittka H., Meunier B.,
Bernadou J. Development of isoniazideNAD truncated adducts embedding a
lipophilic fragment as potential bi-substrate InhA inhibitors and antimycobacterial
agents– Eur. J. Org. Chem. – 2010, P. 4554 – 4561.
7. Барсуков Л. И. Липосомы//Соровский образовательный журнал, №10, 1998, С. 2-
10.
8. Барышников А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как
средство доставки противоопухолевых препаратов. // Вестник РАМН, №3,
2012. С. 23-31.
9. Карпов С.В. Взаимодействие 2-ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропенидов
натрия с галогеноводородами.// Автореф. диссертации на соиск. уч. степ. к.х.н. –
Казань, 2012.
10. Мухамадияров Р.А., Веремеев А.В., Марцияш Н.Е., Зинчук В.Г. Влияние α-
токоферола на динамику процессов липопероксидации в липосомах,
полученных методами ультразвуковой сонификации и экструзии, при различных
температурах хранения.// Фундаментальные исследования, № 6, 2012, С. 566-
570.