Dokumen tersebut merangkum protokol praktikum kultur sel, termasuk isolasi dan kultur primer sel, uji sitotoksisitas dan proliferasi sel, pembuatan medium kultur, serta contoh kultur primer yang pernah dilakukan seperti melanosit, sebocyte, dan stem cell adiposit. Kolagen dari buntut tikus digunakan sebagai zat perekat untuk menanam sel primer pada permukaan flask.

1. PRAKTIKUM KULTUR SEL
(SEL LINES DAN SEL PRIMER)
TRI YULIATI,SKM
LPPT UGM

2. UJI SITOTOKSISITAS,PROLIFERASI
VIABILITAS
SITOTOKSISITAS (Treatment Sel)
1. Panen sel
- Sel dilihat dibawah mikroskop, kalau sudah konfluent 80-90%
- Buang medium yang ada pada flash
- Cuci medium (medium tanpa FBS) , masukan dalam flash
- Kemudian goyang-goyang untuk menghilangkan sisa-sisa FBS yang masih menempel pada sel, kemudian
tuang.
- Tambahkan tripsin-EDTA 0,25% 1-2 ml
- Diamkan sebentar , kalau sudah lepas ( membulat) semprot-semprot.
- Masukkan ke tabung centrifuge, tambahkan medium sampai penuh.
- Centrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm
- Buang supernatan
- Pelet, tambahkan 1 ml medium komplit dihomogenkan
- Hitung sel yang didapat (sel siap ditreatment).

3. 2. Treatment Sel/Sharing Sel
- Pada plate 96 well, tambahkan masing-masing sebanyak 100 ul susupensi sel dengan kepadatan 2X10 4 /
20.000 sel/well.
- Kemudian diamkan selama 1-2 jam
- Setelah itu tambahkan 100 ul ekstrak dengan berbagai konsentrasi dosis.
- Inkubasi dalam incubator CO2 selama 24 jam (kadar CO2 5%, suhu 37 OC, kelembaban 98%).
- Setelah 24 jam dilihat dibawah mikroskop dan difoto
- Setelah itu buang medium yang ada ( dengan cara dibalik) pada kertas tissue (untuk sel yang
menempel)
- Tambahkan 100 ul MTT (5 mg MTT + 1 ml PBS+ 9 ml medium RPMI komplit/medium penumbuh)
pada masing-masing well.
- Inkubasi selama 4-6 jam
- Inkubasi over night.
- Baca pada ELISA Reader panjang gelombang 550 nm.
- Analisa data.

4. PEMBUATAN MEDIUM ( RPMI, DMEM, M199)
- Hepes 2 gr
- NaHCO3 2 gr
- Serbuk RPMI, DMEM, M199 1 sachet
- Ditambah H2O sampai 1 liter
- Ukur pH 7,2 -7,4
- Difilter dengan filter 0,22 um

5. MEDIUM KOMPLIT/ MEDIUM PENUMBUH
100 ml 10%
• FBS 10 ml
• Penstrep 2 ml
• Fungizone 2 ml
• Add RPMI, DMEM, M199 100 ml

6. Rumus Perhitungan Sitotoksisitas
% Kematian = OD kontrol - OD Sampel
----------------------------------- X 100 %
OD kontrol (sel+media)

9. KULTUR PRIMER
Contoh-contoh bahan/jaringan yang bisa digunakan untuk culture primer:

10. PROTOKOL KULTUR PRIMER HPDL
SEL FIBROBLAST
1. Jaringan gingiva di ambil dari gingiva bebas pada gigi PI.
2. Gigi dari cabutan kemudian di cuci 3 sampai 4 kali dengan PBS
yang sudah mengandung PenSrep dan Fungizone.
3. Kemudian di kerok atau di potong jaringan gingiva yang masih
menempel pada gigi,sampai kecil – kecil sekitar 1mm.
4. Jaringan di tata pada petri dish dan kemudian di tutup dengan
deckglass yang sudah di sterilkan dan agak di tekan-tekan.
5. Tambahkan Medium DMEM Komplit sebanyak 3-5ml.
6. Kemudian di inkubasi pada Incubator CO2 5% dan suhu 37C.
7. Setiap 3 hari medium diganti dengan yang baru.
8. Setelah sel fibroblast keluar dan udah terlihat banyak,di tripsin
dan di sub kultur ke Flash.

11. KULTUR SEKUNDER
- Sel dilihat dibawah mikroskop, kalau sudah konfluent 80-90%
- Buang medium yang ada pada flash
- Cuci medium (medium tanpa FBS) , masukan dalam flash
- Kemudian goyang-goyang untuk menghilangkan sisa-sisa FBS yang masih menempel
pada sel, kemudian tuang.
- Tambahkan tripsin-EDTA 0,25% 1-2 ml
- Diamkan sebentar , kalau sudah lepas ( membulat) semprot-semprot.
- Masukkan ke tabung centrifuge, tambahkan medium sampai penuh.
- Centrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 1500 rpm
- Buang supernatan
- Pelet, tambahkan 1 ml medium komplit dihomogenkan
- Hitung sel yang didapat (sel siap ditreatment).

12. Kultur Primer
Beberapa Kultur Primer memerlukan
• Zat adhesi (sel matrik, gelatin, fibronektin)
• Pemesanan bahan memerlukan waktu yang
lama
• Bisa bikin sendiri bahan adhesi dari collagen
buntut tikus
• Dibutuhkan juga Collagen type 2/untuk
melepas sel

13. KOLAGEN SEBAGAI ZAT ADHESI
MELEKATKAN SEL PRIMER PADA FLASH PADA
PENELITIAN KULTUR SEL
SUMBER KOLAGEN MURAH
BUNTUT TIKUS

14. KULTUR PRIMER YANG SUDAH
PERNAH DI KERJAKAN
MELANOSIT
SEBOCYTE
HUVEC
KERATINOSIT
C666.1 KARDIOMIOSIT
STEM CELL ADIPOSIT
Endotelial Progenitol Cells
(EPC)
FIBROBLAST

15. Simpan dalam botol steril pada 4°C Cairan kolagen dihasilkan dan
dapat diencerkan sesuai dengan kebutuhan dengan
menambahkan asam asetat steril
1 :1000

16. Masukkan kolagen secara merata
pada dasar

17. Contoh-contoh Kultur Sel
Yang Sudah Menggunakan
Kolagen Buntut Tikus
Sebagai Bahan Adhesi

20. Isolasi Adipose-derived Stem Cells dari lipoaspirat
Alat dan Bahan:

22. Prosedur:

29. 29
TIDAK ADA YANG TIDAK BISA
DIKERJAKAN KALAU KITA MAU
BELAJAR, BERUSAHA DAN
BERKARYA

30. BAGIAN FARMAKOLOGI FK UNUD - 2012
TERIMAKASIH
MATUR NUWUN