2. 10
ceskoslovenská sucIALISTICKÁ
REPUBLIKA
- , o Rad P R o pat enty a vys Alezy
Třída 30 h,
vydáno 15. srpna 1861 Vyloženo 15. února 1961
PATENTNÍ spis č.
100427
KONRAD BERNHAUER, ASCHAFFENBURG, ELISABETH BECHER, STOCKSTADT am Main a
GEORG WILHARM, ASCHAFFENBURG (NSR)
Způsob biosyntetické výroby ,6-dimethylbenzimidazolového kobalaminu . •
Přihlášeno 27. února 1959 (PV 1203-59) Platnost patentu od 27. února 1959 Právo přednosti od 28.
února 1958 (Německá spolková republika)
Vynález se týká způsobu biosyntetické výroby ,6-dimethylbenzimidazolového kobalaminu. -
Výraz k obalamin je obvyklé označení skupiny sloučenin,, která zahrnuje vitamin B12 a jemu
příbuzné látky. Toto označení se zpravidla doplňuje tak, že se před ně napíše jméno té zásady, jejíž
radikál je obsažen y nukleotidové složce, molekuly; tak na příklad se označuje vitamin B12 názvem ,6-
dimethylbenzimidazolový kobalamin, poněvadž v molekule vitaminu B12 je obsažena báze ,6-
dimethylbenzimidazol.
Existují také analoga vitaminu , B12, u nichž je nukleotidová složka
molekuly vitaminu B12 přítomna jen částečně nebo vůbec chybí. Taková analoga vitaminu B12 se
nazývají neúplné faktory vitam in u B12 nebo ne úplné kobala miny. Mezi těmito neúplnými kobalaminy
jsou jednak takové, u nichž jsou skupiny amidů kyseliny molekuly faktoru B nahrazeny volnými skupinami
karboxylovými, jednak takové, u nichž je nukleotidová složka neúplná, poněvadž chybí : nuklèotidóvá
báze. Takové neúplné faktory se nazývají neúplné kyselé kobalaminy. Faktory první skupiny se odlišují
od základního komplexu," tj. ėtiokobalaminu
(faktoru B), tím, že jim chybí jedna nebo několik amidových skūpin; takže představují na
příklad monokarbonové nebo, dikarbonövé -
liny. K nim patří faktory , , atd. zjištěné ve vyhnívajícím kälu.
· Faktory druhé skupiny neúplných kyselých kobalaminů se odlišují od

3. etiokobalaminu tím, že obsahují ještě ribosu a kyselinu fosforečnou.
: : : •

5. Do této skupiny patří faktor Ib, nalezený ve vyhnívajícím kalu (etíokobalaminová fosforibosa).
Zatím co přeměna etiokobalaminu ve vitamin, B12 působením mikroorganismů již byla popsána
(viz patentní spisy NSR . 945 648; . 948734 a č. 1 017 324 a patentní spis NDR . 13 300j,
nepodařilo se až dosud převést kromě ve stopách neúplné kyselé kobalaminy v ,6-
dimethylbenzimidazolový- kobalamin (vitamin B12).
Je však již také známo (viz J. Pawelkiewicz Precusors of the biosynthesis of vitamins of B12 group
Bull. Acad. Polon. Sci., Cl II, vol. III . 1, str. 3, 1955), že bakterie produkující kyselinu propionovou, jako na
příklad Propionibacterium shermanii, mohou využít ,6-dimethylbenzimidazolu přidávaného do živného
prostředí k syntéze vitaminu Nyní bylo zjištěno, že pomocí mokroorganismů lze dosáhnout s
překvapujícím účinkem přímé přeměny neúplných kyselých kobalaminů v ,6-dimethylbenzimidazolový
kobalamin, a to s velkým výtěžkem.
Vynález tedy spočívá v tom, že se při biosyntetické výrobě ,6-dimethylbenzimidazolového
kobalaminu působením rostoucích bakterií, produkujících kyselinu propionovou, na neúplné kobalaminy v
živném prostředí, obsahujícím ,6-dimethylbenzimidazol a živné minerální soli, jako fosforečnany, soli
hořčíku a železa, a asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku, jako uhlohydráty a štěpné produkty bílkovin,
používá jako výchozí látky neúplných kyselých kobalamínů. A.
Jako vhodných bakterií produkujících kyselinu propionovou se použije Propionibaçteria shermanii
nebo Propionibacteria freudenreichii. Kultuře těchto bakterií se přidává neúplný kyselý kobalamin, který
se má přeměnit, a ,6-dimethylbenzimidazol. Tyto látky jsou přijímány buňkami bakterií, v nichž pak
probíhá přeměna,
Výhodný způsob provádění způsobu podle vynálezu je tento:
V živném prostředí, které obsahuje potřebné živné látky a především cukr, směs aminokyselin,
fosfáty a jiné živné soli, se nechá růst na příklad kultura Propïonibacterium shermanii. Asi po dvoudenní
kultivaci při 28 až 30° C se do živného prostředí přidá neúplný kyselý kobalamin, na příklad kyselina
etiokobalaminokarbonová nebo faktor Ib (též v surovém, nečištěném stavu, a ,6-dimethylbenzimidazol.
Koncentrace tohoto neúplného kyselého kobalaminu v kvasném prostředí je účelně asi 5 až 20 mg,
koncentrace ,6-dimethylbenzimidazolu asi 20 až 40 mg na litr. Dalším přídavkem glukosy do živné půdy a
nastavením hodnoty pH asi na ,5 se udržuje fermentace po několik dní. . . .
Po skončení kvašení se vyfermentovaná půda odstředí, přičemž — jeli toho zapotřebí – se
nastaví pH na hodnotu asi 4 až ,5. Odstředěný, po případě vodou propraný sediment se za
tepla (na příklad při 80 až 110° C) extrahuje vodou. Přitom se získá výtažek, který je již zbarven
oranžově červeně. Ten se zpracuje aktivním uhlím. Adsorbát se z uhlí získá filtrací a
odstřeďováním a pak se obvyklým způsobem eluuje, na příklad vodným roztokem alkoholu.
Takto získaný, eluát má již typické, čistě červené zbarvení vitaminu B12. Lze z něho velmi ·
snadno získat obvyklým způsobem krystalický vitamin B12. Jestliže se zvolí příliš velké
množství kobalaminu, který se má přeměnit v živné půdě, může se stát, že se při fermentaci
nepřemění úplně žádaným způsobem. Pak je možno množství tohoto kobalaminu, který zůstal
ve filtrátu kultury, zhodnotit beze zbytku tím, že se filtrát: kultury po
- dalším přídavku cukru nechá znovu fermentovat s týmiž bakteriemi
: a dále se postupuje stejně jako dříve. . . . * , ; Pro techniçkou realisaci
způsobu podle vynálezu lze vycházet ze

8. 100
110
120
získávání vitaminu B12 z vyhnívajícího kalu. Přitom se může použít
těchto dvou postupů:
1. Známým způsobem lze získat z vyhnívajícího kalu koncentrát
různých kobalaminů, na příklad ve tvaru infusoriového produktu(viz patentní spis NSR . 1 016
898), a z něho oddělit rozdělovací chromatografií na celulóze kyseliny etiokobalaminokarbonové a
faktor Ib.
Neúplné kyselé kobalaminy, obsažené v. získaných frakcích, se pak
přemění způsobem podle vynálezu ve vitamin B12. . . .
2. Může se však postupovat také tak, že se připraví z vyhnívajícího kalu pouze vodný extrakt nebo
surový koncentrát, na příklad ve formě bentonitového nebo uhelného eluátu, který kromě neúplných
kyselých kobalaminů - obsahuje také ještě faktor III, purinové kobalaminy a samotný vitamin B12. V tomto
případě lze zvláště výhodně uplatnit způsob podle vynálezu, poněvadž kvašením se přemění za
přítomnosti ,6-dimethylbenzimidazolu přítomné kyseliny etiokobalaminokarbonové a faktor Ib jakož i
zároveň přítomné úplné kobalaminy ve vitamin B12.
Způsob podle vynálezu má ještě další velmi vítanou technickou výhodu: Přeměňované
kobalaminy jsou přejímány buňkami bakterií a v nich se přeměňují za přítomnosti ,6-
dimethylbenzimidazolu ve vitamin B12, který se hromadí v buňkách. To umožňuje jednoduché
získávání vítamínu B12 odstředěním buněk bakterií a isolováním z nich
Vitaminu B12.
Jestliže se však sediment získaný popsaným způsobem odstřeďo-
váním nezpracuje na čistý vitamin B12, nýbrž má-li se ho použít jako přísady do krmiva, stačí jej jen
vysušit. Takto získaný suchý produkt má poměrně velmi vysoký obsah vitaminu B12, zpravidla daleko
více než 100 mg na kg. Proto jej lze smíchat s jinými vhodnými krmivy, jako se sójovou moukou, otrubami
atd., a tím upravit na žádaný obsah vitaminu B12. Krmivo s přísadou připravenou způsobem podle
vynálezu je zřejmě daleko hodnotnější než krmivo obsahující ještě kobalaminy, které jsou pro zvířata
fysiologicky neúčinné.
Popsaného způsobu lze použít pro přeměnu všech dosud známých kyselin
etiokobalaminokarbonových, vyskytujících se v přírodě, především hojnějších kyselin monokarbonových
a dikarbonových (faktorů V1 a ), také faktoru Ib a konečně i kyselin karbonových faktorů Ib, tedy všech
faktorů, které jsou obsaženy na příklad v surových nezpracovaných extraktech nebo koncentrátech z
vyhnívajícího nebo vegetabilního kalu.
Technický pokrok, jehož lze dosáhnout způsobem podle vynálezu, spočívá především v
tom, že na příklad neúplné kyselé kobalaminy vypadávající jako vedlejší produkty při získávání
vitaminu B12 z vyhnívajícího kalu, jako na příklad kyseliny, etiokobalaminokarbonové a faktor
Ib, pro něž se až dosud nenašlo přímé použití, lze nyní přímo přeměňovat ve vitamin B12 a tím
je zužitkovat.
Podrobnosti provádění způsobu podle vynálezu jsou patrny z těchto příkladů provedení: · -

9. 130
obvyklým způsobem (30 minut při 120° C) se sterilisuje 10 litrů prostředí, které je nastaveno
na pH ,7 a obsahuje , na 1 litr, tyto látky: , : . . . . .
kyselý hydrolysát kaseinu, odpovídající tryptický hydrolysát kaseinu, odpovídající
. . . . . 1,76 g :

11. 100427
. , Pak se naočkuje 1 litrem inokula kultury Propionibacterium shermanii ve stejném prostředí a kultivuje
se za anaerobních podmínek
při 28 až 30° C. Po dvoudenní fermentaci se přidá sterilní roztok 50 · ·
mg kyseliny etiokobalaminokarbonové a 200 mg ,6-dimethylbenzimidazolu. Během
fermentace se přidává občas sterilní roztok glukosy,
aby se udrželor kvašení v činnosti, a hodnota pH se nastaví přídavkem
nasyceného roztoku uhličitanu sodného na ,6. Po dalších dvou dnech se přidá ještě jednou 200
mg ,6-dimethylbenzimidazolu. Za 6 dní je fermentace skončena. Produkt se okyselí přídavkem
kyseliny sírové na pH ,0, čímž jsou nuceny bakterie sedimentovat. Odstředěním se získá 285 g
sedimentu s obsahem sušiny 29%. Vlhký sediment se několikrát extrahuje pod tlakem vždy po
10 minut při 110° C vodou, čímž se získá úhrnem 2,5 litru oranžově červeného vodného
extraktu. Extrakt se smísí po ochlazení zá míchání s 25 g aktivního uhlí, odsaje se přes
infusoriovou hlinkui a adsorbát se několikrát eluuje z uhlí při teplotě varu i směsí obsahující 70
objemových dílů isopropanolu, 25 dílů vody a 5 dílů benzenu tak dlouho, až je eluát prakticky
bez- . barvý. Takto se získá 1 litr čistě červeně zbarveného eluátu, který se zahustí ve vakuu na
malý objem. Obvyklým způsobem se z něho získá 34 mg krystalického vitaminu B12.
Získaný produkt byl identifikován zjištěním jeho vlastností, zejména
elektroforetických při pH 2,7 a ,2. Za těchto podmínek se chová
vitamin B12 neutrálně, kdežto kyseliny etiokobalaminokarbonové při pH 2,7 mají posun ke
katodě a při pH ,2 k . Kromě toho byla potvrzena identita vitaminu B12 také papírovou
chromatografií za použití obvyklých vyvíjecích metod a měřením jeho absorpčního spektra.
Postupuje se stejným způsobem jako v příkladě 1 až na to, že se místo . kyselin
etiokobalaminokarbonových použije 40 mg faktoru Ib. Přitom se získá úplně stejným způsobem 28 mg
krystalisovaného vitaminu B12. Vyrobený produkt byl identifikován stejně jako v příkładu 1.
Ke 100 litrům vodného roztoku, který se získá obvyklým způsobem ohřátím vyhnívájícího
kälu a odstraněním tuhých látek odstředěhím å který při testu s Escherichia coli má aktivitu
vitaminu B12 rovnou ,8 mg/litr a obsahuje směs kyselinetiokobalaminokarbonových a faktor Ib s
úplnými kobalaminy, jako s faktorem III a purinovým kobalaminem, se přidá 1 kg technické
glukosy a obvyklým způsobem se sterilisuje. Směs se pak očkuje 10 litry základní kultury
Propionibacterium freudenreichii, která byla vykultivována v prostředí popsaném v příkladu 1 a
kultivuje se dále za anaerobních podmínek při
Po dvoudenní fermentáci, se k ní přidá sterilní 2 g ,6-dimethylbenzimidazolu a ve
fermentaci se pokračuje 6 dní tím, že se občas přidává sterilní roztok a pH se udržuje
na hodnotě
· ,6 přídavkem koncentrovaného roztoku . Čtvrtého dnefërmentace

12. se přidá ještě jednou i g ,6-dimethylbenzimidazolu.

14. 5 100427
Vyfermentovaná půda se upraví způsobem popsaným v příkladu 1. Přidá se k ní kyselina sírová, až
se dosáhne hodnoty pH ,0. Bakterie přitom zvločkované se oddělí odstředěním. Získá se 2,8 kg
sedimentu s obsahem sušiny 29. Z vlhkého sedimentu se získá jako v příkladu 1 30 litrů vodného
extraktu, který se zpracuje 300 g aktivního uhlí. Adsorbát na uhlí, získaný odstředěním, se eluuje při
teplotě varu beze zbytku směsí 70 obj. dílů isopropanolu, 25 dílů vody a 5 dílů . benzenu. Ze směsi čistě
červeně zbarvených eluátů 13,5 litru) se připraví obvyklým způsobem vitamin B12. Jak ukazuje bližší
rozbor, kyseliny etiokobalaminokarbonové a také faktor Ib nyní zmizely a přeměnily se ve vitamin B12.
Totéž platí pro purinové kobalaminy a faktor III, obsažené ve výchozím prostředí.
Předmět patentu
Způsob biosyntetické výroby ,6-dimethylbenzimidazolového kobalaminu působením rostoucích
bakterií, produkujících kyselinu propionovou, na neúplné kobalaminy v živném prostředí, obsahujícím ,6-
dimethylbenzimidazol a živné minerální soli, jako fosforečnany, soli hořčíku a železa, a asimilovatelné
zdroje uhlíku a dusíku, jako uhlohydráty a štěpné produkty bílkovin, vyznačující se tím, že se jako výchozí
látky používá neúplných kyselých kobalaminů.
Severografia, n. p, závod 03