MEDIA untuk mikroorganisme

1. A. PENGENALAN MEDIA DAN FUNGSINYA
Media pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat
makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. Mikroba
memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun
komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroba menjadi
kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
BAHAN-BAHAN MEDIA PERTUMBUHAN
1. Bahan Dasar
a. Air (H2O) sebagai pelarut.
b. Agar-agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit
didegradasi oleh mikroba pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC.
c. Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah polimer asam
amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannya adalah lebih banyak jenis
mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai
pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi
mikroba autotrof obligat.
2. Nutrisi atau Zat Makanan
Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel, yaitu
berupa unsur makro, seperti C, H, O, N, P, dan unsur mikro, seperti Fe, Mg, dan unsur
pelikan/trace element.
a. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau
anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber
karbon organik, antara lain dari karbohidrat, lemak, protein, dan asam organik.
b. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain.
Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik, seperti urea.
c. Vitamin-vitamin.
3. Bahan Tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke media dengan tujuan
tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator
perubahan pH akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik
ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
MACAM-MACAM MEDIA PERTUMBUHAN
1. Media berdasarkan Sifat Fisik
a. Media solid
media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Media solid biasanya digunakan untuk mendapatkan koloni tunggal dan melihat
morfologi mikroorganisme.
b. Media semi solid
media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak
padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan: supaya
pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media, tetapi tidak mengalami
percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya, bakteri yang tumbuh pada
media Nitrogen free Bromthymol Blue (NfB) semisolid akan membentuk cincin
hijau kebiruan di bawah permukaan media jika media ini cair maka cincin ini

2. dapat dengan mudah hancur, untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya
pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan
metabolisme nitrat, tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata di seluruh
media, dan untuk melihat pergerakan bakteri.
c. Media cair
media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah Nutrient Broth (NB),
Lactose Broth (LB). Media cair biasanya digunakan untuk melihat aktivitas
biokimia bakteri.
2. Berdasarkan komposisi atau susunan bahannya
a. Media alami
Komposisi media ini tidak diketahui secara pasti baik jenisnya maupun ukuranya.
Media ini sudah tersedia secara alami misalnya air, nasi, buah, biji, daging dan
lain-lain
b. Media sintetis
Sering juga disebut media buatan. Komposisi senyawa berikut takarannya
diketahui secara pasti, tidak tersedia secara alami tapi dibuat. Media sintetik
sering digunakan untuk mempelajari sifat genetika mikroorganisme. Senyawa
organik dan anorganik ditambahkan dalam media sintetik harus murni sehingga
harganya mahal, misalnya: sabouroud agar, czapek’s dox agar, Glucose Agar,
Mac Conkey Agar
c. Media semi sintetis
media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misalnya Potato
Dextrose Agar (PDA) yang mengandung agar, dekstrosa, dan ekstrak kentang.
Bahan ekstrak kentang, tidak dapat diketahui secara detail tentang komposisi
senyawa penyusunnya.
3. Berdasarkan Kegunaannya
a. Media umum
Media ini digunakan secara umum artinya media ini dapat ditumbuhi oleh
berbagai jenis mikroorganisme baik bakteri maupun jamur dan mengandung
semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya NA (nutrient agar)
b. Media selektif
Media ini dipakai untuk menyeleksi mikroorganisme sesuai dengan yang
diinginkan , jadi hanya satu jenis mikroorganisme saja yang dapat tumbuh dalam
media ini atau hanya satu kelompok tertentu saja. Media selektif selain
mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut
dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba
yang diinginkan. misalnya media Salmonella Sigella Agar yaitu media khusus
untuk mengamati atau menyelidiki salmonella atau shigella dari makanan atau
bahan lain.
c. Media deferensial
Media ini digunakan untuk menyeleksi mikroorganisme. Medium ini dapat
ditumbuhi berbagai jenis mikroorganisme tapi salah satu diantaranya dapat
memberikan salah satu ciri yang khas sehingga dapat dibedakan dari yang lain
dan dapat dipisahkan
d. Medium diperkaya (enrichment)
Medium ini digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme untuk Media
diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan
mikroba dan ditambah komponen kompleks, seperti darah, serum, dan kuning

3. telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang
ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk
berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood
Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar.
B. PEMBUATAN MEDIA
Alat
 Timbangan analitik untuk menimbang media
 Labu erlenmeyer untuk menyimpan media yang telah ditimbang
 Kompor pemanas (Hot plate with stirer) untuk mencampur dan memanaskan media
 Gelas ukur untuk mengukur volume aquades
 Magnetic stirer untuk menghomogenkan media dengan aquades
 Sumbat untuk menutup erlenmeyer ketika sedang dipanaskan
 Spatula untuk mengambil media ketika akan ditimbang
 Alumunium foil/cawan petri kecil untuk menyimpan media ketika akan ditimbang
 Kain atau sarung tangan anti panas
Bahan
 Media sesuai kebutuhan
 Aquades
Cara pembuatan media
 Media disiapkan dan dihitung sesuai kebutuhan
 Perhitungan media menggunakan rumus pengenceran V1 x M1 = V2 x M2
Dengan :
o V1 = volume aquades (1000 ml)
o M1 = banyaknya media yang telah diketahui pada kemasan (Contoh: media
NA 20 gr/ml, media PDA 39 gr/ml)
o V2 = volume aquades yang dibutuhkan (ml)
o M2 = banyaknya media yang dibutuhkan (gram)
 Media ditimbang menggunakan timbangan analitik
o Timbangan analitik dikalibrasi terlebih dahulu (nilai pada timbangan harus 0)
o Dimasukkan alumunium foil/cawan petri kecil kedalam timbangan analitik
o Timbangan analitik ditutup dan kalibrasi kembali
o Timbangan analitik dibuka dan media dimasukkan sedikit demi sedikit
menggunakan spatula hingga sesuai dengan perhitungan yang telah dilakukan
o alumunium foil/cawan petri kecil yang telah berisi media dikeluarkan dari
timbangan analitik
o setelah digunakan dibersihkan timbangan analitik dan kalibrasi kembali
 Setelah media ditimbang kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer (jika membuat
media 200 ml menggunakan erlenmeyer dengan ukuran 250/300 ml begitupun
seterusnya, tidak boleh menggunakan erlenmeyer dengan ukuran yang pas karena hal
tersebut untuk menghindari meluapnya media dari erlenmeyer ketika mendidih)
 Aquades ditambahkan kedalam erlenmeyer sesuai kebutuhan
 Magnetic stirer dimasukan kedalam erlenmeyer dengan hati-hati melewati mulut
erlenmeyer

4.  Erlenmeyer ditutup menggunakan sumbat atau alumunium foil
 Erlenmeyer ditempatkan pada hot plate with stirer
 Kabel Hot plate with stirer dihubungkan dengan sumber listrik kemudian diatur suhu
dan kecepatan stirer (suhu yang biasa digunakan yaitu 250-300 ˚C dan kecepatan yang
digunakan yaitu 200-250 rpm)
 Media dimasak hingga mendidih
Jika sudah mendidih erlenmeyer diangkat menggunakan kain atau sarung tangan anti
panas
 Suhu dan kecepatan pada hot plate diatur pada setingan awal 0
 Kabel hotplate dicabut dari sumber listrik
 Media ditunggu hingga tidak terlalu panas kemudian keluarkan magnetic stirer dari
dalam erlenmeyer, selanjutnya media disterilisasi dan siap digunakan
Peringatan !!!
Saat membuat media harus selalu dipantau dan fokus tidak boleh ditinggal dan
mengerjakan hal lain. Hal tersebut untuk menghindari meluapnya dan tumpahnya
media ketika sedang mendidih
Media yang sudah mendidih harus segera diangkat menggunakan kain atau sarung
tangan anti panas. Jangan mematikan alat terlebih dahulu karena media yang telah
mendidih akan cepat meluap sehingga menyebabkan media tumpah
Setelah media dimasak jangan lupa untuk mengeluarkan magnetic stirer dari
dalam erlenmeyer dan kabel hot plate dicabut
Media yang telah dibuat harus segera digunakan. Penyimpanan media hanya dapat
dilakukan pada kurun waktu 24-48 jam
CONTOH-CONTOH MEDIA MIKROORGANISME
1. Nutrient Agar (NA)
Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy. NA juga
digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme yang tidak selektif,
dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang
dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar. NA merupakan salah satu media yang
umum digunakan dalam prosedur bakteriologi seperti untuk membuat stok kultur,
untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi organisme dalam
kultur murni.
Komposisi media NA :
Beef extract ................................................................ 3 gram
Peptone ...................................................................... 5 gram
Agar-agar .................................................................. 15 gram
Aquades .................................................................... 1000 ml
Komposisi media NB :
Beef extract ................................................................ 3 gram
Peptone ...................................................................... 5 gram
Aquades .................................................................... 1000 ml

5. 2. Potato Dextrose Agar (PDA)
PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang.
Dapat juga digunakan untuk enumerasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau
produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu
terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan
kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat
PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah didestilasi.
Komposisi media PDA :
Kentang ................................................................... 200 gram
Dextrose .................................................................... 10 gram
Agar-agar .................................................................. 15 gram
Aquades .....................................................................1000 ml
3. Eosin Methylene Blue Agar (EMBA)
Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa
dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S.
aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella.
Komposisi media EMBA :
Peptone ............................................................................10 gram
Lactose ..............................................................................5 gram
Sucrose.............................................................................. 5 gram
Dipotassium phosphate...................................................... 2 gram
Eosin Y ..............................................................................0,4 gram
Methylene blue ..................................................................0,065 gram
Distilled Water.......................................................................Add to make 1 Liter

6. 4. Lactose Broth (LB)
Lactose broth digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran koliform
dalam air, makanan, dan produk susu, sebagai kaldu pemerkaya (pre-enrichment broth)
untuk Salmonellae dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada
umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk
memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat
difermentasi untuk organisme koliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas
adalah presumptive test untuk koliform. Lactose broth ini akan berwarna kekuningan
dan jernih.
Komposisi media LB :
Peptone .................................................................. 5 gram
Ekstrak Daging ...................................................... 3 gram
Laktosa ...................................................................5 gram
C. Penuangan media
1. Media Solid
 Media yang terdapat pada erlenmeyer setelah disterilisasi selanjutnya siap
untuk dituang kedalam cawan petri steril
 Penuanga media harus dilakukan didalam Laminar Air Flow (LAF)
 LAF sebelum digunakan harus terlebih dahulu dibersihkan menggunakan
alkohol 70% dan di sinari UV selama 30 menit
 Stelah 30 menit LAF siap digunakan
 Matikan lampu UV dan nyalakan lampu LAF. Alat dan media dimasukkan
kedalam LAF. Sebelum dimasukkan alat dan media harus disemprot terlebih
menggunakan alkohol 70% bagian luarnya
Alat yang dimasukkan meliputi 2 lampu spirtus dan cawan petri steril
Lampu spirtus dinyalakan dan media siap dituang
 Cawan petri yang telah steril dibuka bungkusnya dan dipanaskan mulut cawan
tersebut menggunakan tangan kiri
 Media diambil dengan tangan kanan, sumbat dibuka dan panaskan mulut
erlenmeyer
 Tutup cawan petri dibuka sedikit dan dedia dituang kedalam cawan petri
secara perlahan ±15 ml jangan terlalu sedikit dan jangan terlalu banyak
 Cawan petri ditutup dan dipisahkan

7.  Mulut erlenmeyer dipanaskan kembali untuk selanjutnya dtutup kembali
menggunakan sumbat
 Lakukan hal tersebut hingga seluruh media habis
Peringatan !!!
Setelah media dituang, mulut erlenmeyer dipanaskan dan langsung
ditup kembali dengan sumbat
Mulut cawan petri dipanaskan dengan cara memutar cawan petri
Jika media mulai memadat, langsung dipanaskanmenggunakan hot
plate tanpa stirer dan siap dituang kembali
2. Media semisolid dan media cair
 Media yang telah dibuat ditunggu hingga hangat dan siap dimasukkan
kedalam tabung reaksi
 Tabung reaksi disiapkan sesuai kebutuhan
 Media dimasukkan menggunakan pipet serologi sebanyak ±10 ml
 Penuangan media tidak dilakukan didalam LAF
 Setelah media habis, tabung reaksi ditutup dengan sumbat atau penutup
tabung reaksi
 Selanjutnya tabung reaksi yang telah berisi media dimasukkan kedalam
plastik tahan panas untuk selanjutnya di sterilisasi menggunakan autoklaf
 Sterilisasi dilakukan ±2 jam dengan suhu 121 ˚C dan tekanan 1 atm
 Media yang terlah di sterilisasi selanjutnya siap digunakan
Peringatan !!!

8. Apabila ingin membuat agar miring, tabung reaksi berisi media yang
telah di sterilisasi dikeluarkan dan dimiringkan ±45˚
Jika media tidak segera digunakan, media dapat disimpan pada suhu
ruang tanpa mengeluarkannya dari plastik tahan panas
Apabila media akan digunakan, tabung reaski berisi media dikeluarkan
didalam LAF yang telah disinari UV
Apabila ingin menuang media untuk uji MPN sebelum media dituang,
dimasukkan terlebih dulu tabung durham kedalam tabung reaksi dan
selanjutnya media siap dituang.
D. PEMBUATAN SUMBAT DAN PEMBUNGKUSAN CAWAN
1. Pembuatan sumbat
Alat :
Kain kasa
Kapas
Gunting
Cara pembuatan :
 Kain kasa dipotong membentuk persegi sesuai kebutuhan
 Kapas diambil secukupnya, kemudian diputar membentuk tabung hingga
padat
 Kapas selanjutnya ditempatkan pada kain kasa
 Kain kasa yang berisi kapas dimasukkan kedalam erlenmeyer kemudian
sumbat di uji
 Sumbat dikeluarkan dari dalam tabung hingga terdengar bunyi “blup”
 Apabila tidak terdengar bunyi, kapas ditambahkan hingga terdengar bunyi
“blup”
 Jika telah terdengan bunyi “blup” bagian ujung kain kasa diikat hingga
kencang dan digunting apabila terdapat kain kasa yang menjuntai
 Sumbat siap digunakan
Peringatan !!!
Sumbat yang dibuat tidak hanya terdengar bunyi “blup” tetapi juga
dapat dikeluarkan dan dimasukkan dengan mudah menggunakan 2 jari
2. Pembungkusan cawan
Alat :
Kertas buku telepon atau kertas bekas yang salah satu sisinya tidak terdapat coretan
(bersih dan putih)
Cara pembuatan :
 Kertas disiapkan dan sisi bagian yang tidak ada coretan menghadap ke atas
 Cawan petri ditempatkan diatas sisi kertas yang bersih dengan posisi ditengah
dan kondisi terbalik (tutup cawan berada dibawah)
 Ujung-ujung kertas dihubungkan dan dilipat
 Sisi kiri dan kanan kertas dilipat kebawah mengikuti lekukan cawan petri
 Cawan petri siap di sterilisasi
Peringatan !!!
Saat membungkus cawan pastikan kertas tidak sobek

9. Cawan yang akan disterilisasi dimasukkan terlebih dahulu kedalam
plastik tahan panas
E. STERILISASI
Sterilisasi adalah proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda
dari semua bentuk kehidupan.Sterilisasi dapat dilakukan tergantung dari bahan atau
alat yang akan disteril. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu sebagai
berikut.
MACAM-MACAM STERILISASI
Prinsip dalam sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu secara mekanik,
fisik, dan kimiawi.
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)
menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45
mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini
ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan
antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.
 Pemanasan
a) Pemijaran (dengan api langsung)
Membakar alat pada api secara langsung, contoh alat jarum inokulum,
pinset, batang L, dll.
b) Panas kering
Sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800. Sterilisasi panas kering cocok
untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi, dll.
c) Uap air panas
Konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih
tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.
d) Uap air panas bertekanan
Menggunakan autoklaf
 Radiasi
a) Sinar Ultra Violet (UV) juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi,
misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan
interior Biological Safety Cabinet (BSC) atau Laminar Air Flow (LAF)
dengan disinari lampu UV.
b) Gamma bersumber dari Cu60 dan Cs 137 dengan aktivitas sebesar 50-
500 kilo curie serta memiliki daya tembus sangat tinggi. Dosis
efektifitasnya adalah 2,5 MRad. Gamma digunakan untuk mensterilkan
alat-alat yang terbuat dari logam, karet serta bahan sintesis seperti
pulietilen
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan.
Desinfektan adalah suatu bahan kimia yang dapat membunuh sel-sel vegetatif
dan jasad renik, bersifat merusak jaringan. Prosesnya disebut desinfeksi.
Contoh: alkohol, fenol, halogen.

10. TEKNIK KERJA ASEPTIS
Apabila akan bekerja di atas meja maka persiapan yang harus dilakukan
sebelum bekerja secara aseptis adalah mensterilkan tempat bekerja (meja). Caranya
dengan menyemprotkan alkohol 70% di permukaan meja dan udara di sekitar meja
secara merata. Kemudian bersihkan meja dengan menggunakan kapas/tisu dengan
cara digosok satu arah saja. Setelah itu, letakkan alat dan bahan yang diperlukan di
atas meja yang telah bersih. Semprot lagi semua permukaan alat dengan alkohol,
kemudian semprot kedua tangan hingga merata, diamkan hingga kering, dan siap
bekerja secara aseptis.
Perlu diingat bahwa untuk mengurangi terjadinya kontaminasi maka harus
selalu bekerja dekat dengan api dari pembakar bunsen. Apabila akan memindahkan
biakan dari tabung reaksi atau erlenmeyer dan cawan petri ke tabung reaksi atau
cawan petri lain, pastikan untuk membuka tutupnya dekat dengan api. Sebelum
menutup kembali, mulut tabung reaksi dan erlenmeyer dibakar terlebih dahulu. Begitu
pula setelah menutup cawan petri, bibir cawan dibakar.
Jarum ose yang digunakan untuk memindahkan biakan, sebelum dan sesudah
digunakan juga harus dibakar pada api bunsen. Apabila menggunakan pinset dan
batang L maka sebelum dan setelah pemakaian dapat dicelupkan pada alkohol
kemudian dibakar pada api bunsen.

11. PRINSIP KERJA STERILISASI MENGGUNAKAN AUTOKLAF
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 121oC. Suhu dan tekanan tinggi yang
diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar
untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media
digunakan suhu 121oC dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan
digunakan suhu 121oC atau 249,8oF adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika
digunakan tekanan 15 psi. Pada tekanan 0 psi dengan ketinggian di permukaan laut (sea level)
air mendidih pada suhu 100oC, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama,

12. menggunakan tekanan 15 psi maka air akan mendidih pada suhu 121oC. Ingat kejadian ini
hanya berlaku untuk sea level, jika di laboratorium terletak pada ketinggian tertentu maka
pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700
kaki dpl maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 121oC untuk
mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 121oC dan
tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih
dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara
dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam
autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi
dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber
panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak
boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah sebagai berikut.
1. Bahan tidak tahan panas, seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim.
2. Pelarut organik, seperti fenol.
3. Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS.
F. ALAT-ALAT LISTRIK
1. Autoklaf (Sterilisasi)
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan
dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan pada
umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121˚C (250˚F). Jadi, tekanan yang
bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per
square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121˚C.
Cara penggunaan autoklaf yaitu sebagai berikut.
a. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

13. b. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir maka tutup harus
dikendurkan.
c. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang
keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.
d. Autoklaf dinyalakan, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121˚C.
e. Ditunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan
terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan)
dan ditunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan
mencapai 2 atm.
f. Jika alarm tanda selesai berbunyi maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun
hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preissure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi
autoklaf dengan hati-hati.
2. Autoklaf (Destruksi)
Prosedur Kerja :
a. Autoclave harus ditempatkan pada tempat dimana cukup lapang untuk pelepasan uap.
b. Masukkan akuades dalam ruang sterilisasi, sampai menutup sistem pemanas (heater),
untuk mencegah penimbunan kapur pada elemen pemanas
c. Masukkan keranjang berisi bahan/alat yang akan disetrilkan ke dalam autoclave,
kemudian tutup autoclave.
d. Pada saat menutup, selang harus masuk ke posisi yang tepat. Tanda panah pada penutup
harus sejajar dengan tanda garis. Tutup semua tuas secara diagonal agar seimbang
kekuatan pada saat menutup Autoclave.
e. Pastikan klep keluarnya uap (safety falve) pada posisi berdiri/tegak
f. Tekan tombol kearah ON
g. Thermostat di putar pada posisi maximal di angka 10
h. Biarkan hingga keluar uap air dari klep lalu tutup/arah ke samping
i. Proses sterilisasi mulai, hingga mencapai kondisi yang diinginkan baik suhu maupun
waktu sterilisasi (jarum berada diwarna hijau)
j. Thermostat diturunkan sampai pada posisi lampu pertama kali mati
k. Timer diputar pada waktu 15 menit
l. Setelah timer berbunyi alat dimatikan dengan menekan tombol OFF
m. Klep dibuka secara perlahan sampai jarum menunjukkan angka 0
n. Tutup autoclave dapat dibuka Catatan: Pastikan bahwa posisi air di ruang sterilisasi
cukup merendam elemen pemanas

14. 3. Inkubator
Inkubator adalah alat untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang
terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu
untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya, adalah 10-70 ˚C.
4. Hot Plate Stirrer
Prosedur Kerja :
a. Pasang kabel pada stop kontak dengan aliran listrik 220 V
b. Tekan ON untuk menyalakan
c. Putar tombol STIR dari arah MIN ke MAX sesuai putaran yang diinginkan
d. Putar tombol HEAT untuk mengatur suhu dari suhu rendah (LO) ke suhu tinggi
(HI)
e. Taruh sampel yang akan dipanaskan dan atau distirer
f. Setelah selesai putar tombol HEAT ke posisi OFF
g. Putar tombol STIR ke posisi MIN
h. Matikan tombol ON
i. Cabut stop kontak
5. Laminar Air Flow (LAF)
Prosedur Kerja :
a. Nyalakan lampu UV, minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow
digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
b. Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang dimasukkan
ke dalam laminar air flow cabinet, disemprot terlebih dahulu dengan alcohol 70%
atau spiritus.
c. Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau dengan spiritus
untuk mensterilkan LAF.
d. Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.

15. e. Nyalakan lampu dalam LAF.
f. LAF sudah siap untuk digunakan.
Hal yang perlu diperhatikan :
Jangan meletakkan lampu bunsen terlalu dekat dengan filter dan alkohol untuk
merendam peralatan kultur.
Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan tempat
bekerja sehingga menghalangi aliran udara.
Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol (nyala api
alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat yang
terang, HATI-HATI!!
Jangan mendekati lampu bunsen, dengan tangan yang baru disemprot alkohol atau
spiritus.
Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet, setelah selesai bekerja. Jangan meninggalkan
botol bekas, kapas bekas, dan sebagainya di dalam LAF.
6. Timbangan digital
Prosedur Kerja :
a. Sambungkan kabel pada aliran listrik (220 V).
b. Pastikan “water pass” berada pada posisi tengah.
c. Beban neraca analitik maks 220 gram dan minimum 10 mg (termasuk wadah).
d. Tekan panel “on/off “ untuk menghidupkan timbangan.
e. Tekan Units untuk merubah mg atau gram
f. Letakkan wadah yang dipakai untuk alas menimbang
g. Kemudian tekan “ O/T “, untuk zero, tunggu sampai monitor menjukkan angka
nol (0).
h. Letakkan bahan yang akan ditimbang pada wadah.
i. Setelah selesai menimbang tekan panel ”on/off” untuk mematikan neraca analitik
dan bersihkan bagian dalam dan luar menggunakan tissue/lap bersih.
j. Cabut kembali kabel dari aliran listrik.
k. Tutup timbangan analitik dengan penutup.
l. Meja tempat menaruh timbangan harus dalam
kondisi bersih kembali

16. DAFTAR PUSTAKA
Cahyani, Vita Ratri. (2014). Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Perairan.
Universitas Sebelas Maret. Surakarta.
http://medlab.id/ diakses pada hari Minggu, 04 November 2017 pukul 15.00 WIB
www.merckmillipore.com diakses pada hari Minggu, 04 November 2017 pukul
16.00 WIB

17. Standarisasi Medium Berdasarkan ISO 11133:2014 Tentang Preparasi Produksi,
Penyimpanan dan Performa Pengujian Pada Kultur Media
Skala laboratorium yang melakukan pemeriksaan mikrobiologi bertujuan untuk
mempertahankan, menumbuhkan, mendeteksi berbagai macam mikroorganisme yang tumbuh.
Media kultur yang digunakan pada teknik kultur mikrobiologi secara konvensional
membutuhkan berbagai macam formula serta ada beberapa yang dirancang untuk
pertumbuhan mikroorganisme spesifik.
Banyak pengujian dan prosedur pada media kultur yang mampu memberikan hasil
secara konsisten dan dapat direproduksi. Persyaratan untuk media khusus untuk sampel dan
organisme yang akan dideteksi. Penetapan media merupakan kriteria kinerja sebagai
prasyarat untuk setiap pekerjaan yang berhubungan dengan mikrobiologi yang dapat
ditelusuri. Pengujian yang memadai harus melalui persyaratan sebagai berikut :
1. Kondisi setiap batch medium
2. Peruntukan medium
3. Hasil yang memadai dan konsisten
Ketiga kriteria ini merupakan bagian penting dari prosedur pengendalian kualitas
internal dan dokumentasi yang sesuai, akan memungkinkan pemantauan yang efektif dari
media kultur dan berkontribusi pada produksi data yang akurat dan dapat diandalkan. Untuk
analisis mikrobiologi yang dapat diandalkan, penting untuk menggunakan media kultur
dengan kualitas yang terbukti. Untuk semua media yang dijelaskan dalam metode standar,
penting untuk menentukan kriteria penerimaan minimum yang diperlukan untuk memastikan
keandalannya. Rekomendasikan bahwa dalam penentuan karakteristik kinerja dari uji media
kultur dilakukan yang sesuai dengan Standar Internasional yang berlaku.
Penetapan kriteria kinerja minimum yang diterima secara luas untuk media harus
mengarah pada produk dengan kualitas yang lebih konsisten dan dengan demikian
mengurangi tingkat pengujian yang diperlukan di laboratorium pengguna. Selain itu, kriteria
penerimaan yang diukur dengan metode yang didefinisikan dalam Standar Internasional dapat
digunakan oleh semua laboratorium mikrobiologi untuk mengevaluasi sifat yang produktif,
selektif dan / atau elektif dari media kultur.
Daftar Istilah
1. Quality Control
Manajemen mutu yang berfokus pada pemenuhan persyaratan kualitas
2. Batch Kultur Medium

18. Unit yang bersifat homogen dan dapat dilacak dari medium yang mengacu pada sejumlah
besar produk setengah jadi atau produk akhir yang ditentukan, yang konsisten dalam jenis
dan kualitas dan yang telah diproduksi dalam satu periode produksi yang ditetapkan, yang
telah ditetapkan dalam batch yang sama.
3. Substrat Kromagenik
Substrat yang mengandung gugus kromofor / fluorofor dan substrat yang dapat dimanfaatkan
oleh bakteri atau jamur. Setelah memisahkan substrat kromogenik / fluorogenik, kromofor /
fluorofor dilepaskan dan produk akhir berwarna / fluoresen menjadi terlihat / dapat dideteksi
menggunakan lampu ultraviolet (UV).
4. Performa Kultur Medium
Respons media kultur untuk menantang organisme uji di bawah kondisi yang ditentukan
5. Target Mikroorganisme
Mikroorganisme atau kelompok mikroorganisme untuk dideteksi
6. Mikroorganisme non target
Mikroorganisme yang ditekan oleh medium dan / atau kondisi inkubasi atau tidak
menunjukkan karakteristik yang diharapkan dari mikroorganisme target
7. Produktivitas Media
Tingkat pemulihan target mikroorganisme dari medium kultur di bawah kondisi yang
ditentukan
8. Selektivitas Media Kultur
Tingkat penghambatan mikroorganisme non-target pada atau dalam media kultur selektif
dalam kondisi yang ditentukan
9. Elektivitas / Spesifisitas Medium
media kultur dalam kondisi yang ditentukan, bahwa mikroorganisme non-target tidak
menunjukkan karakteristik visual yang sama dengan mikroorganisme sasaran
10. Kultur Medium
Formulasi zat, dalam bentuk cair, semi padat atau padat, yang mengandung konstituen alami
dan / atau sintetis yang dimaksudkan untuk mendukung pertumbuhan, (dengan atau tanpa
penghambatan mikroorganisme tertentu), identifikasi atau viabilitas mikroorganisme
11. Medium Secara Kimia
medium kultur hanya terdiri dari konstituen yang ditentukan secara kimia dari struktur
molekul yang diketahui dan tingkat kemurniannya
12. Medium Transportasi

19. media yang dirancang untuk mempertahankan dan menjaga kelangsungan hidup
mikroorganisme sambil meminimalkan perubahan numerik dalam periode waktu antara
pengumpulan sampel dan pengolahan sampel di laboratorium (Amies Transport Medium)
13. Medium Preservasi
media yang dirancang untuk mempertahankan dan menjaga kelangsungan hidup
mikroorganisme dalam jangka waktu lama, untuk melindungi mereka dari pengaruh buruk
yang mungkin terjadi selama penyimpanan jangka panjang dan memungkinkan pemulihan
setelah periode ini (Nutrient Agar Miring)
14. Media Diluent
medium yang dirancang untuk memisahkan mikroorganisme dari produk uji padat ke fase
cair dan / atau untuk mengurangi konsentrasi mereka dengan pengenceran tanpa perkalian
atau penghambatan selama waktu kontak (Peptone Salt)
15. Media Esusitasi
media untuk mengurangi mikroorganisme stres dan rusak untuk memperbaiki dan
memulihkan kondisi mereka untuk pertumbuhan normal (Buffered Peptone)
16. Media Konfirmasi
medium yang digunakan untuk identifikasi atau karakterisasi mikroorganisme setelah
resusitasi awal dan / atau pengayaan dan / atau isolasi
17. Media Referensi
Media yang biasanya tidak selektif, untuk evaluasi komparatif kinerja dari media yang
sedang diuji dan didemonstrasikan agar sesuai untuk penggunaan kontrol (TSA)