Bioinformatica

Recupero della seq. nucleotidica (mRNA) e
della seq. nucleotidica genomica
ALLINEAMENTO
NM_003037
vs
NC_000001.11
MEDIANTE
BLASTN

LE GIUNZIONI
ESONE-ESONE
(STEP 5)
…

LE GIUNZIONI
ESONE-ESONE
Le giunzioni esone -esone
sono state riportate sulla
sequenza nucleotidica
genomica (mRNA) in
formato FASTA nel file
Word.

Progettazione dei primers ALLINEAMENTO
CON Primer-
BLAST
I parametri di temperatura e
lunghezza dei primers voluti sono
stati impostati nel tool «Primer
Blast» e si è proceduto con
l’allineamento della seq. NM_003037

SCELTA DELLA
COPPIA DI
PRIMER
Una coppia di primer con
almeno una giunzione
esone -esone
nell’amplicone è stata
scelta e la sue
caratteristiche sono state
riportate nel file Word.
La coppia scelta è la n°1.
Le loro posizioni sono
state riportate sulla
sequenza nel file Word.

Analisi di una sequenza: caratteristiche
fisico-chimiche - ProtParam
La seq proteica è stata
recuperata in formato FASTA
e inserita nel database
ProtParam.
Number of amino acids: 335
Molecular weight: 37230.9
Theoretical pI: 8.70
Ext. coefficient 43235Abs 0.1% (=1
g/l) 1.161, assuming all pairs of Cys
residues form cystines
Ext. coefficient 42860Abs 0.1% (=1
g/l) 1.151, assuming all Cys residues
are reduced
Instability index: 46.72; this
classifies the protein as unstable.
Aliphatic index: 91.61
Grand average of hydropathicity
(GRAVY): -0.202
COMPOSIZIONE
IN AA
vs
FREQUENZA
NORMALIZZATA
DEGLI AA
Ala (A) 15 4.5%
Arg (R) 13 3.9%
Asn (N) 17 5.1%
Asp (D) 9 2.7%
Cys (C) 7 2.1%
Gln (Q) 14 4.2%
Glu (E) 20 6.0%
Gly (G) 21 6.3%
His (H) 6 1.8%
Ile (I) 18 5.4%
Leu (L) 39 11.6%
Lys (K) 21 6.3%
Met (M) 8 2.4%
Phe (F) 7 2.1%
Pro (P) 22 6.6%
Ser (S) 29 8.7%
Thr (T) 27 8.1%
Trp (W) 4 1.2%
Tyr (Y) 14 4.2%
Val (V) 24 7.2%
Pyl (O) 0 0.0%
Sec (U) 0 0.0%
= frequenza
< di 3% rispetto alla
frequenza normalizzata
= frequenza
> di 3% rispetto alla
frequenza normalizzata
Amino acid composition
8,7%
8,5%

Ricerche ed analisi usando pattern e
profili: ProSite
1 hit (by 1 profile)
on 1 sequence
Nessun pattern
Un ponte disolfuro
INPUT: seq.
proteica
DATABASE:
patten/profili

profili: rps - BLAST INPUT: seq.
proteica
DATABASE:
profili PSSM

profili: InterPro APPLICAZIONE
DEI PHMM
Detailed signature
matches
Signaling lymphocytic
activation molecule, N-
terminal
Immunoglobulin-like
domain
Unintegrated signatures
Lo stesso risultato di
Pfam/rps-BLAST

Informazioni della ricerca di
pattern/profili
SLAM superfamily (rps-BLAST)
Signaling lymphocytic activation molecule, N-terminal
(ProSite)
Immunoglobulin-like domain (ProSite, Interpro)
Disulfide bond (ProSite)
INFORMAZIONI
INTEGRATE
NELLA
SEQUENZA
PROTEICA

Predizione della localizzazione delle
proteine: Psort PREDIZIONE
DEI SITI DI
LOCALIZZAZIO
NE DELLA
PROTEINA
NELLA CELLULA
Position of the most N-terminal TMS: 5 at i=2
INTEGRAL Likelihood =-12.37 Transmembrane 242 - 258 ( 237 - 264)
INTEGRAL Likelihood = -4.78 Transmembrane 5 - 21 ( 3 - 23)
Type IIIa or IIIb is favored for ER memb. proteins Memb.protein
with uncleavable signl is often at ER
KDEL Count: 0
apolar signal for intramitochondrial sorting (Gavel position 53) from:
5 to: 21
Type III proteins may be localized at Golgi

proteine: SignalIP PREDIZIONE SITI
DI CLIVAGGIO E
EVENTUALE
PRESENZA DI
PEPTIDI
SEGNALE
C-score= raw-cleavage site score
S-score= signal peptide score
Y-score = combined cleavage site score

proteine: TMHMM PREDIZIONE
ELICHE
TRANSMEMB
RANA IN
PROTEINE

Predizione della localizzazione
delle proteine INFORMAZIONI
INTEGRATE
NELLA
SEQUENZA
PROTEICA
= dominio transmembrana Psort
= dominio transmembrana Psort + TMHMM
= sito di clivaggio SignalIP
= dominio transmembrana TMHMM

Parametri:
Expected Threshold: 0,001
Word size: 3
Ricerca per confronto di
sequenze: BLASTP INPUT: seq.
proteica
DATABASE:
RefseqPrimo risultato salvato in html
Taxonomy reports  specie in
cui trovo la mia proteina:
primati,
conigli & lepri,
roditori,
balene & delfini,
ungulati,
carnivori,
pipistrelli,
placentati
7 sequenze simili
in uomo

Seconda ricerca BLASTP
Le sequenze sono state riportate nel file word e rese più leggibili
INPUT: seq.
proteica
DATABASE:
Refseq

Analisi filogenetica - MEGA5
ALLINEAMENTO
MULTIPLO TRA
SEQ RECUPERATE
E SEQ DI
INTERESSE

OUTPUT ALBERO
BOOTSTRAP
CONSENSO –
MEGA5
Albero consenso
Myseq Prim signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Homosapiens NP 003028.1
Prim signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Homosapiens NP 003028.1
Prim signalinglymphocyticactivationmolecule Gorillagorilla XP 004027768.1
Prim signalinglymphocyticactivationmolecule Macacamulatta XP 001117605.1
Prim signalinglymphocyticactivationmoleculeisoformX1 Homosapiens XP 005245513.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmolecule Vicugnapacos XP 015104492.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Canislupusfamiliaris NP 001003084.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Feliscatus NP 001265755.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Rattus norvegicus NP 001102548.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeisoformX2 Mus musculus XP 006496936.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Mus musculus NP 038758.2
Ucc signalinglymphocyticactivationmolecule Gallus gallus XP 423077.3
Ucc naturalkillercellreceptor2B4isoformX13 Gallusgallus XP 003643429.2

Albero originale OUTPUT ALBERO
ORIGINALE –
MEGA5
Prim signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Homosapiens NP 003028.1
Prim signalinglymphocyticactivationmolecule Gorillagorilla XP 004027768.1
Prim signalinglymphocyticactivationmolecule Macacamulatta XP 001117605.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmolecule Vicugnapacos XP 015104492.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Canislupusfamiliaris NP 001003084.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Rattus norvegicus NP 001102548.1
Mamm signalinglymphocyticactivationmoleculeprecursor Mus musculus NP 038758.2

OUTPUT ALBERO
BOOTSTRAP
CONSENSO –
MEGA5
SENZA
RIPETIZIONE

Analisi filogenetica -
GeneDoc
SEQUENZE
ORDINATE
SECONDO I
RAGGRUPPAMENTI
FILOGENETICI

Analisi filogenetica – The
MEME Suit RICERCA DI
DOMINI NON
CONSERVATI

OUTPUT DI
MAST (MEME)
DA FILE html

= dominio di transmembrana+sito di clivaggio
OUTPUT DI
MAST
(MEME) DA
FILE html
I motivi 2+5+6 sono presenti solo nel cluster Gallus gallus
Il motivo 1 è presente in tutte le sequenze, tranne nelle sequenze di Homo Sapiens
(la sequenza 7 e la 8) e in una di Gallus gallus, la sequenza 10
I motivi 3 e 4 sono condivisi da tutte le sequenze.
All’interno del dominio 4 nella mia sequenza proteica, si riconosce il dominio
transmembrana recuperato dalle informazioni fornitemi da TMHMM e PSort
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

ANALISI DI
PREDIZIONE DI
SEGNALE DI
SECREZIONE E
PRESENZA DI
DOMINI
TRANSMEMBRANA

RISULTATI
RIPORTATI SU
GENEDOC

Interpretazione funzionale di
dati derivanti da esperimenti
di microarray
J Clin Invest. 2016 Jan;126(1):181-94. doi: 10.1172/JCI83013. Epub 2015 Nov 30.
SLAMF1 regulation of chemotaxis and autophagy determines CLL patient response.
Bologna C, Buonincontri R, Serra S, Vaisitti T, Audrito V, Brusa D, Pagnani A, Coscia M, D'Arena G, Mereu
E, Piva R, Furman RR, Rossi D, Gaidano G,Terhorst C, Deaglio S.
Abstract
Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a variable disease; therefore, markers to identify aggressive forms
are essential for patient management. Here, we have shown that expression of the costimulatory molecule
and microbial sensor SLAMF1 (also known as CD150) is lost in a subset of patients with an aggressive CLL
that associates with a shorter time to first treatment and reduced overall survival. SLAMF1 silencing in CLL-
like Mec-1 cells, which constitutively express SLAMF1, modulated pathways related to cell migration,
cytoskeletal organization, and intracellular vesicle formation and recirculation. SLAMF1 deficiency
associated with increased expression of CXCR4, CD38, and CD44, thereby positively affecting chemotactic
responses to CXCL12. SLAMF1 ligation with an agonistic monoclonal antibody increased ROS
accumulation and induced phosphorylation of p38, JNK1/2, and BCL2, thereby promoting the autophagic
flux. Beclin1 dissociated from BCL2 in response to SLAMF1 ligation, resulting in formation of the
autophagy macrocomplex, which contains SLAMF1, beclin1, and the enzyme VPS34. Accordingly,
SLAMF1-silenced cells or SLAMF1(lo) primary CLL cells were resistant to autophagy-activating
therapeutic agents, such as fludarabine and the BCL2 homology domain 3 mimetic ABT-737. Together, these
results indicate that loss of SLAMF1 expression in CLL modulates genetic pathways that regulate
chemotaxis and autophagy and that potentially affect drug responses, and suggest that these effects underlie
unfavorable clinical outcome experienced by SLAMF1(lo) patients.
RIPORTARE
DUE
ABSTRACT

Biochemistry (Mosc). 2014 Dec;79(12):1405-11. doi: 10.1134/S0006297914120165.
Upstream open reading frames regulate translation of the long isoform of SLAMF1
mRNA that encodes costimulatory receptor CD150.
Putlyaeva LV1, Schwartz AM, Korneev KV, Covic M, Uroshlev LA, Makeev VY, Dmitriev
SE, Kuprash DV.
Abstract
More than 40% of human genes contain upstream open reading frames (uORF) in their 5'-
untranslated regions (5'-UTRs) and at the same time express at least one truncated mRNA
isoform containing no uORF. We studied translational regulation by four uORFs found in the
5'-UTR of full-length mRNA for SLAMF1, the gene encoding CD150 membrane protein.
CD150 is a member of the CD2 superfamily, a costimulatory lymphocyte receptor, a receptor
for measles virus, and a microbial sensor on macrophages. The SLAMF1 gene produces at least
two mRNA isoforms that differ in their 5'-UTRs. In the long isoform of the SLAMF1 mRNA
that harbors four uORFs in the 5'-UTR, the stop codon of uORF4 overlaps with the AUG codon
of the main ORF forming a potential termination-reinitiation site UGAUG, while uORF2 and
uORF3 start codons flank a sequence identical to Motif 1 from the TURBS regulatory element.
TURBS was shown to be required for a coupled termination-reinitiation event during
translation of polycistronic RNAs of some viruses. In a model cell system, reporter mRNA
based on the 5'-UTR of SLAMF1 short isoform, which lacks any uORF, is translated 5-6 times
more efficiently than the mRNA with 5'-UTR from the long isoform. Nucleotide substitutions
disrupting start codons in either uORF2-4 result in significant increase in translation efficiency,
while substitution of two nucleotides in TURBS Motif 1 leads to a 2-fold decrease in activity.
These data suggest that TURBS-like elements can serve for translation control of certain
cellular mRNAs containing uORFs.
PMID: 25716736 DOI: 10.1134/S0006297914120165
RIPORTARE
DUE
ABSTRACT

Utilizzo di String 9.1
RICERCA DI
INTERAZIONI
FRA PROTEINE
NOTE E
PREDETTE

Controllo sul foglio <<gene list up-dn>>. Il gene SLAMF1 è DOWN
REGOLATO.
Collegamento: link all’esperimento (geni down):
http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/geneset_page.jsp?geneSetN
ame=GSE13411_NAIVE_VS_IGM_MEMORY_BCELL_UP
Resting human memory B cells are intrinsically programmed for enhanced survival and
responsiveness to diverse stimuli compared to naive B cells.
Good KL1, Avery DT, Tangye SG.
Abstract
Enhanced secondary Ab responses are a vital component of adaptive immunity, yet little is
understood about the intrinsic and extrinsic regulators of naive and memory B cells that result in
differences in their responses to Ag. Microarray analysis, together with surface and intracellular
phenotyping, revealed that memory B cells have increased expression of members of the TNF
receptor, SLAM (signaling lymphocytic activation molecule), B7, and Bcl2 families, as well as the
TLR-related molecule CD180 (RP105). Accordingly, memory B cells exhibited enhanced survival,
proliferation, and Ig secretion, and they entered division more rapidly than did naive B cells in
response to both T cell-dependent and T cell-independent stimuli. Furthermore, both IgM and
isotype-switched memory B cells, but not naive B cells, costimulated CD4+ T cells in vitro
through a mechanism dependent on their constitutive expression of CD80 and CD86. This study
demonstrates that up-regulation of genes involved in activation, costimulation, and survival
provides memory B cells with a unique ability to produce enhanced immune responses and
contributes to the maintenance of the memory B cell pool.
RECUPERO
DELL’ABSTRACT
DA GENE
EXPRESSION
OMNIBUS [ DA
GSEA]

ORGANIZZAZIONE
DELL’ESPERIMENTO
DA GENE
EXPRESSION
OMNIBUS.
Four subsets of human splenic B cells (naïve, IgM-memory, Ig isotype
switched memory and plasma cells).
Sort-purified and analysed immediately ex vivo; performed in duplicate.

Tools di Enrichment Analysis:
KEGG Analysis
Wikipathways Analysis
Drug association Analysis
Analisi funzionale dei risultati di
microarray - Webgesalt
La mia proteina non è presente né in
KEGG, né in Wikipathway Scelta dei
pathway più significativi
WEBGESALT
CLASSE I

PATHWAYS &
DRUGS PIÙ
SIGNIFICATIVI
KEGG Pathway #Gene Statistics
Metabolic pathways 37
C=1130;O=37;E
=10.30;R=3.59;r
awP=2.83e-
11;adjP=7.92e-
10
Glycolysis /
Gluconeogenesis
9
C=65;O=9;E=0.5
9;R=15.19;rawP
=8.06e-
09;adjP=1.13e-
07
Epithelial cell signaling in
Helicobacter pylori
infection
6
C=68;O=6;E=0.6
2;R=9.68;rawP=
3.75e-
05;adjP=0.0003
B cell receptor signaling
pathway
6
C=75;O=6;E=0.6
8;R=8.78;rawP=
6.53e-
05;adjP=0.0004
WikiPathway #Gene Statistics
Glycolysis and
Gluconeogenesis
9
C=50;O=9;E=0
.46;R=19.75;ra
wP=7.13e-
10;adjP=1.43e-
08
B Cell Receptor
Signaling Pathway
10
C=114;O=10;E
=1.04;R=9.63;r
awP=1.03e-
07;adjP=1.03e-
06
Regulation of toll-like
receptor signaling
pathway
10
C=154;O=10;E
=1.40;R=7.13;r
awP=1.69e-
06;adjP=1.13e-
05
Prolactin Signaling
Pathway
7
C=92;O=7;E=0
.84;R=8.35;raw
P=2.23e-
05;adjP=0.0001
AhR pathway 5
C=39;O=5;E=0
.36;R=14.07;ra
wP=2.73e-
05;adjP=0.0001

Drug #Gene Statistics
cefacetrile 10
C=100;O=10;E=0.
91;R=10.97;rawP
=2.94e-
08;adjP=1.69e-07
netilmicin 10
C=97;O=10;E=0.8
8;R=11.31;rawP=
2.19e-
08;adjP=1.69e-07
cefotaxime 10
C=100;O=10;E=0.
91;R=10.97;rawP
=2.94e-
08;adjP=1.69e-07
immune globulin 23
C=624;O=23;E=5.
69;R=4.04;rawP=
2.13e-
08;adjP=1.69e-07
ciprofloxacin 10
C=111;O=10;E=1.
01;R=9.89;rawP=
8.02e-
08;adjP=3.69e-07
glutathione 15
C=341;O=15;E=3.
11;R=4.83;rawP=
7.10e-
07;adjP=2.72e-06
adenine 10
C=159;O=10;E=1.
45;R=6.90;rawP=
2.25e-
06;adjP=7.39e-06
nadh 12
C=243;O=12;E=2.
21;R=5.42;rawP=
2.83e-
06;adjP=8.14e-06
PATHWAYS &
DRUGS PIÙ
SIGNIFICATIVI

microarray - GSEA
GSEAL
CLASSE I +
CLASSE II

Gene list completa e GO, Gene list up e TFT (C3 TFT), Gene list dn e TFT (C3
TFT)
Risultati riportati nel file excel
OUTPUT
GSEAL

microarray - DAVID
DAVID
CLASSE III

Lista dei geni dei termini /
pathway di DAVID in cui è
presente il mio termine
KLF6
BAK1
PKNOX1
FYN
BCL6
LIG4
SLAMF1
LTB
SYK
microarray – STRING 9.1 multiple
names RICERCA DI
INTERAZIONI
FRA PROTEINE
CON UNA LISTA
SELEZIONATA

SLAMF1 è un membro della famiglia delle molecole attivanti i segnali dei linfociti. E’
un componente della CD2 superfamily,un recettore linfocitico costimulatorio, un
recettore per il virus del morbillo e un sensore microbico sulla superficie dei
macrofagi.
È presente in due isoforme, di cui una troncata(differiscono nel loro 5’ UTR).
Dimostra un’alta affinità nel self-ligand, importante nella stimolazione bidirezionale
tra cellule T e cellule B.
Il profilo di espressione genica di SLAMF1 è molto diverso tra cellule immunitarie
(PCs, naϊve e cellule di memoria) Ciò è probabilmente dovuto ad un cambiamento
nella fisiologia; inoltre ha un ruolo nella differenziazione e nella funzione delle cellule
durante la risposta immunitaria all’antigene. A questo proposito, SLAM1 è collegato ai
pathways di signaling dei Toll- like receptor e delle Chemochine
E’ associato a diversi fattori di trascrizione, tra cui anche stimolatori linfoidi (anche
collegati all’insorgenza di linfomi)
La down-regolazione di SLAMF1 è fisiologica nelle cellule di memoria (che up-
regolano geni per una veloce divisione cellulare), ma può essere anche patologica,
poichè strettamente collegata all’insorgenza di leucemie [Chronic lymphocytic
leukemia (CLL)]
CONCLUSIONI
CONCLUSIONI
BASATE SU:
-ABSTRACT
-ENRICHMENT
ANALYSIS
-NETWORK

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