Oxford Nanopore Stepik course - pt 1

1. Oxford Nanopore
курс в 4-х частях
Alexander Predeus
21-mar-2018

2. Часть 1. Знакомство с технологией Oxford Nanopore.
● Введение
● Сравнение возможностей секвенирования 2-го и 3-го поколений
● Преимущества и проблемы нанопорного секвенирования
● Краткая история Oxford Nanopore
● Разнообразие приборов от Oxford Nanopore

3. 1.1. Сравнение возможностей секвенирования 2-го и 3-го поколений

4. Секвенирование
• секвенирование - определение
последовательности ДНК
• возможные варианты:
• секвенирование фрагмента,
амплифицированного ПЦР
• секвенирование всех присутствующих
фрагментов (shotgun sequencing)
• секвенирование по Сэнгеру: фрагменты
до ~ 1000 пн

5. NGS: революция 2000-х
• Геном человека: 100 M$ → 1000 $

6. Фрагмент и прочтение
• длины фрагмента и
прочтений Illumina:
• MiSeq: 2x300 пн
• HiSeq: 2x250 пн
• NovaSeq: 2x150 пн
• фрагмент - до 800 пн
фрагмент (insert) двухцепочечной ДНК
адаптер 1 адаптер 2
прочтение 1 прочтение 2

7. Технологии NGS 3-го поколения
• Технологии, основанные на нанопорах (Oxford Nanopore)
• Single-molecule real time (PacBio)
• Не вышедшая на рынок технология от Roche

8. Нанопоры
• природный или
искусственный
протеин-нанопора
• ток через пору
пропорционален
размеру проходящего
нуклеотида

9. PacBio
• нано-колодец в алюминиевой подложке
• модифицированная полимераза на 5P-NTP

10. Длинные прочтения
● Длинные
прочтения всегда
содержат много
ошибок (15%)
● Инсерции и
делеции
встречаются
очень часто

11. 1.2. Преимущества и проблемы нанопорного секвенирования

12. Длинные прочтения
● Длинные
прочтения всегда
содержат много
ошибок (15%)
● Инсерции и
делеции
встречаются
очень часто

13. Ошибки и их распределение
● около 15% ошибок, особенно проблемны гомополимеры
● сильно зависят от алгоритма определения оснований (basecalling)
● PacBio имеет практически случайный профиль ошибок, а Nanopore - нет

14. Технология 2D и 1D^2
● метод секвенирования
двух комплементарных
нитей в одно прочтение
● позволяет
скорректировать ошибки:
точность ~5%

15. Отсутствие полимеразы
● прямое секвенирование - уникальное преимущество Nanopore
● полимераза ограничена по длине фрагмента (~ 10.000 п.н.)
● длина прочтения может достигать миллионов нуклеотидов!

16. Портативность
● ориентировка на работу в полевых условиях
● секвенирование на МКС
● секвенирование вируса Эбола в районе эпидемии

17. Цена!
● “Набор начинающего”
(starter pack) стоит
$1000+налоги
● в России доступен от
100 тыс. рублей
● включает секвенатор, 2
ячейки, и реактивы на 6
запусков

18. 1.3. Краткая история Oxford Nanopore

19. История идеи
● Транслокация ДНК под действием тока:
Daniel Branton, David Dreamer
● Структура альфа-гемолизина: Hagan Bailey
● Патент на секвенирование: Branton,
Dreamer, Church

20. Ранние версии прибора
● ранние версии прибора отличались
невысокой производительностью и
огромным процентом ошибок
● компания постоянно опаздывала к
назначенным датам и плохо
выполняла рыночные обязательства
● патентные тяжбы на использование
поры R7 (Mycobacterium smegmatis
porin) и технологии 2D

21. Новая пора R9.*
● Ячейки R9 (CsgG) стали
настоящим прорывом в
производительности (до 20 Гб)
● значительно более высокая
скорость протягивания ДНК
через пору -
до 250 п.н. в секунду!
● Самая современная версия -
9.4.1, 450 п.н. в секунду

22. Эволюция точности Nanopore
● процент ошибок сильно упал
ввиду улучшений в алгоритмах
● используется машинное
обучение и нейронные сети
● высокая производительность
ячеек и невысокой стоимостью
приборов открывают массу
новых возможностей

23. 1.4. Разнообразие приборов от Oxford Nanopore

24. MinION: рабочая нано-лошадка
● около 3000 приборов продано на данный момент
● стартовый набор (прибор, 2 ячейки, реактивы) - $1000 + налог
● требует компьютер с USB3.0, 500-1000 Гб места на SSD/быстром HDD
● в простейшем случае почти не требуют лабораторного оборудования
● можно секвенировать геномную ДНК, ампликоны, кДНК, РНК

25. GridION: птица-нанопятерка
● пять MinION + мощный сервер
● возможность стать Nanopore
Service Provider!
● цена $50000 в минимальной
комплектации (60 ячеек и 60
реакций), или право купить 450
ячеек по $300 ($125000)
● индивидуальные ячейки
идентичны MinION

26. PromethION: нано- Кадиллак
● Самый мощный прибор,
использующий другие ячейки (120 Гб)
● Пока находится в стадии “open alpha”
● Цена $135k, 48 ячеек
● Также оборудован мощной серверной
частью
● Требует отдельных вложений в
хранение данных (2Тб в день!)

27. SmidgeION: нано-нано-пора
● небольшой прибор,
подключаемый к смартфону
или планшету
● невысокая
производительность, но
высочайшая портативность
● не выпущен в продажу

28. Flongle: дешевле и меньше
● Для большинства пользователей нынешняя мощность ячеек избыточна
● Flongle должен стать более дешевой альтернативой
● Все ячейки Nanopore содержат электронный чип и требуют возврата
● Дальнейшие изменения перенесут чип на прибор