Oxford Nanopore Stepik course - pt2

1. Схема протокола Rapid Sequencing
Тагментация ДНК
Пришивание адаптеров
секвенирования

2. Что нужно для запуска Rapid?

3. Что нужно для запуска Rapid?

4. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation

5. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation
Covaris g-Tube
или
шприц

6. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation
Covaris g-Tube
или
шприц
21G 20 раз
или
26G 3-5 раз

7. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation
(FFPE Repair Mix)
End repair / dA-tailing module
Blunt/TA Ligase Mix
AMPure beads

8. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation
(FFPE Repair Mix)
End repair / dA-tailing module
Blunt/TA Ligase Mix
AMPure beads

9. Схема протокола 1D Genomic DNA by ligation

10. Очистка библиотеки
SPRI bead technology: Solid Phase Reversible Immobilization

11. Очистка библиотеки

12. Протокол 1D^2 by ligation

13. Схема протокола 1D^2 by ligation

14. Схема протокола 1D^2 by ligation

15. Баркодирование библиотек
• Лигирование баркодов
• Native barcoding kit для 1D

16. Баркодирование библиотек
• Лигирование баркодов
• Native barcoding kit для 1D
• Присоединение транспозомным
комплексом
• Rapid Barcoding Sequencing Kit

17. Баркодирование библиотек
• Лигирование баркодов
• Native barcoding kit для 1D
• Присоединение транспозомным
комплексом
• Rapid Barcoding Sequencing Kit
• Баркоды на ПЦР-праймерах
• PCR Barcoding Kit

18. Промывание ячейки
Flow Cell Wash Kit Раствор А
отделяет библиотеку от мембраны
Раствор В
промывает ячейку для немедленного использования
Раствор S
промывает ячейку и позволяет хранить ее

19. Схема протокола 1D Amplicon by ligation

20. Схема протокола 1D Amplicon by ligation

21. Промывание ячейки
Flow Cell Wash Kit

22. Требования к качеству ДНК
●Чистота ДНК по Nanodrop:
● OD 260/280 в пределах 1,8 – 2,0
● OD 260/230 не ниже 2.0
●Без детергентов и других ПАВ
●Размер фрагментов >30kb
●Соотношение концентраций согласно Qubit и Nanodrop должно быть
не больше, чем 1 : 1,5

23. Требования к качеству ДНК
Чистота ДНК по
Nanodrop:
■ OD 260/280 в пределах 1,8
– 2,0
■ OD 260/230 не ниже 2.0

24. ДНК должна быть высокомолекулярной
https://twitter.com/baptistemayjon1/status/818484473780203520
Длина прочтения == длина фрагмента ДНК

25. Сколько ДНК надо для протоколов без ПЦР?
Rapid 1D 1D^2 Direct cDNA Direct RNA
400 нг 1 - 2 мкг 1 - 2 мкг 250 нг 500 нг
очищенной от рРНК

26. Сколько ДНК надо для протоколов без ПЦР?

27. Часть 3.Применения нанопорного секвенирования.
● Основные стадии секвенирования на Oxford Nanopore
● Полногеномное секвенирование: соединяй и властвуй
● Секвенирование ампликонов: 16S, 18S, и другие
● Секвенирование кДНК и прямое секвенирование РНК
● Неофициальные подсказки: как повысить ваши шансы на успех?

28. 3.1. Основные стадии секвенирования на Oxford Nanopore

29. Выделение ДНК
С помощью колонок
30 kb

30. Выделение ДНК
С помощью колонок Genomic tips
50-100 kb30 kb

31. Выделение ДНК
Фенол-хлороформная экстракция
200-300 kb

32. Выделение ДНК
С помощью диализа Выделение ДНК в агарозе
~ 1000 kb150-250 kb

33. Подготовка к секвенированию

34. MinKNOW: центр управления секвенатором

35. Проверка прибора

36. Секвенирование