Конференция "Геномное секвенирование и редактирование 2018 (NGS 2018)", ИБХ РАН, 16-17 мая 2018 Алексей Аникаев, специалист по продукции QIAGEN, директор по продажам Медком "Новые разработки QIAGEN в жидкостной биопсии и пиросеквенировании".

1. Новые разработки QIAGEN в жидкостной
биопсии и пиросеквенировании
Алексей Аникаев
Специалист по продукции QIAGEN
Директор по продажам ООО Медком

2. Революция жидкостной биопсии
Жидкостная биопсия –
это новая и эффективная технология
детекции биомаркеров без необходимости
инвазивного вмешательства
Образцы:
Кровь, сыворотка, плазма
Анализируемый компонент:
бесклеточная свободно
циркулирующая мкРНК, мРНК, ДНК

3. Неинвазивное пренатальное тестирование (NIPT)
Революция жидкостной биопсии
от секвенирования фетальной ДНК в плазме матери…

4. Таргетная терапия рака (CDx)
Революция жидкостной биопсии
…до новаторских исследований в онкологии

5. Жидкостная биопсия –
новый инновационный метод
Diaz, Jr., L.A. and Bardelli, A. (2014)
“Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.” Am. Soc. Clin. Oncol. 32, 579.
• Позволяет проводить раннюю диагностику заболеваний
• Позволяет исследовать первичные опухоли и метастазы
с помощью простых неинвазивных тестов
• Позволяет контролировать фактический ответ пациента
на лечение
• Позволяет оценить генетическую гетерогенность
опухоли и осуществить мониторинг динамики ее роста
• Позволяет исследовать «дремлющие метастазы» или
явление «опухоли покоя»
• Более быстрый и дешевый метод тестирования по
сравнению с традиционным подходом

6. Свойства свободно циркулирующих нуклеиновых кислот,
присутствующих в образце крови, вызывают технические проблемы
при их анализе
Проблемы выделения и очистки циркулирующих ДНК/РНК
Низкая концентрация по сравнению с обычными образцами клеток или
тканей (1-100 нг/мл плазмы).
Циркулирующие ДНК и РНК являются сильно фрагментированными
ДНК: фрагменты
менее 500–1000 п.о.
Фетальная ДНК:
менее 500 п.о.
мРНК: полноразмерной
мало, 5’-концы более
нативны, чем 3’-концы
Требуется оптимизация метода экстракции ДНК/РНК
Большое количество
образца для получения
оптимального количества
Малый объем элюции для
получения высокой
концентрации
Эффективное выделение
фрагментов малой длины:
до 75 п.о. или ниже

7. 10 мл цельной крови
Красные кровяные клетки
(44% объема)
- Эритроциты
Лейкоцитарная пленка
(1% объема)
- Лейкоциты + CTCs*
Плазма (55% объема)
- цДНК
Тотальная ДНК ≈ ДНК из
лейкоцитарной пленки
~100-300 мкг
цДНК: <30 нг
(~0.01% от тотальной ДНК)
Опухолевая цДНК: <0.3 нг
(<1% от цДНК**)
Неинвазивные биомаркеры рака
Поиск иголки в стоге сена
*CTCs are very rare in non-metastatic disease (<5 CTCs / 10mL) and would account for a negligible amount of the DNA in the buffy coat.
** ctDNA in early stage solid tumors is expected to be <1% of total cfDNA. For comparison, fetal DNA (used in NIPT) is ~10% of total cfDNA.
300 пг ДНК: ~45 клеток
(~6.5 пг ДНК: 1 клетка)

8. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit
Набор для выделения свободно циркулирующей ДНК и РНК
Очистка и концентрирование:
Выделение цДНК из большого объема образца (от 1-5 мл) и
малым объемом элюции (20–150 мкл).
Простой протокол и высокая производительность:
• 4 этапа: лизис, связывание, промывка, элюция
• Быстрое выделение: 2 часа = 24 образца
• Без экстракции хлороформом и преципитации этанолом
• Удаление примесей и ингибиторов
• Совместимость с образцами плазмы, сыворотки, мочи
• Выход: до 1 мкг

9. Бесклеточная свободно циркулирующая фетальная ДНК
Разделение в геле фетальной цДНК из 10 мл образца материнской плазмы
(2й триместр):
• Тотальная циркулирующая ДНК в плазме присутствует в виде фрагментов <1000 п.о.
• Фрагменты фетальной ДНК короче 500 п.о.

10. Разделение в геле фетальной цДНК из 10 мл образца материнской плазмы
(2й триместр):
• Тотальная циркулирующая ДНК в плазме присутствует в виде фрагментов <1000 п.о.
• Фрагменты фетальной ДНК короче 500 п.о.
• Обогащение цДНК только нужной длины
Бесклеточная свободно циркулирующая фетальная ДНК
Выделение нужной
фракции цДНК -
фетальная цДНК

11. Выявление соматических мутаций в плазме

12. Выявление соматических мутаций в плазме

13. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.
Bettegowda C., et al. 2014. doi:10.1126/scitranslmed.3007094
Частота мутаций и концентрация образца
Количество фрагментов мутантной
ДНК варьируется в пределах
от <100 до >100,000 для 5 мл
Количество цДНК также
зависит от типа рака и
размера опухоли!
Необходимое количество
крови для эффективного
анализа цДНК: 10-20 мл

14. Универсальные панели генов
и наборы для создания библиотек QIAseq
Работа с любыми типами образцов и секвенаторами нового поколения

15. Высокие показатели однородности покрытия целевых участков
(127 онкогенов) для образцов плазмы
Показатели работы QIAseq cfDNA All-in-One Kit для
таргетного анализа генов

16. Чувствительная детекция низкочастотных мутаций (до 1%) в контрольных
образцах цДНК даже при умеренном покрытии
Показатели работы QIAseq cfDNA All-in-One Kit для
таргетного анализа генов

17. Система секвенирования GeneReader для
жидкостной биопсии
Система секвенирования NGS GeneReader позволяет выявлять варианты с
чувствительностью 1% в образцах цДНК

18. Копии вариантов вычисляются исходя и предположения, что 1 нг цДНК эквивалентен 360 геномным эквивалентам.
Для сравнения, результаты анализа контрольных образцов «Horizon Multiplex I cfDNA Reference Standards», изначально
разведенных до концентрации 1 нг/мкл, показаны для вариантов ΔE746 - A750 и L858R.
Показатели работы системы GeneReader на экспериментальных
образцах плазмы пациентов

19. От большего к меньшему…

20. В 2 раза меньше и в 3 раза
легче PyroMark Q24
PyroMark Q48 Autoprep:
самый компактный секвенатор с автоматизацией на борту
25 см
39 см
56 см
30 см
8,5 кг

21. Пробоподготовка на «PMQ 48»: 3 в 1
Не требуется доп. оборудование:
✓ Вакуумная станция
✓ Шейкер
✓ Термостат

22. Протокол работы PyroMark Q48 Autoprep

23. Готов для
следующего
запуска
Загружаем
диск
Загружаем
реагенты,
нуклеотиды,
буферы
(одна
загрузка!)
Пиросеквени
рование
Фабрика по генетическому профилированию
× 6
запусков
288 SNP в день!
Реакция пиросеквенирования за 30 мин
Общее время анализа 1 час

24. SNP анализ (AQ режим)

25. Секвенирование de novo (SEQ режим)

26. Анализ метилирования ДНК (CpG режим)

27. Области применения PyroMark Q48 Autoprep
Генетическое
тестирование
Эпигенетические
исследования
Микробиология
Анализ
резистентности к
лекарственным
препаратам
SNP анализ
Валидация NGS

28. Результаты генотипирования 23 пациентов по 12 локусам
Использовали 3 различных 4-plex миксов праймеров (6 запусков)
Данные предоставлены: Rainer W. Fürst, Institute of Diabetes Research, Helmholtz Center Munich, Germany

29. Спасибо за внимание!
+7 (985) 176-45-20
alexey.anikaev@med.com.ru
Компания Медком
- поставщик передовых технологий QIAGEN
для диагностики и исследований в онкологии и
медицинской генетике
Алексей Аникаев
Специалист по продукции QIAGEN
Директор по продажам ООО Медком