Teknik isolasi DNA dan RNA dari berbagai jenis mikroba

1. YONA OKTA SARI
1010413008
ISOLASI DNA DAN RNA
MIKROBA
Dosen Pembimbing : Dra. Elida Mardiah MS
DR. Zulkarnain Chaidir

2. PENGERTIAN DNA
(deoxyribonucleic acid)
DNA adalah asam nukleat yang mengandung instruksi
genetik yang digunakan dalam pengembangan dan
fungsi dari semua organisme hidup dikenal, dan
beberapa virus.
• Peran utama dari DNA adalah sebagai sandi
genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam
memproduksi
protein,
DNA
ditranskrip
menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan
untuk menghasilkan rantai asam amino alias
protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian
yang menyandikan protein inilah yang disebut
gen, sisanya tidak menyandikan protein atau
disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya
belum diketahui dengan baik.

3. Isolasi DNA
Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA
dari jaringan adalah dengan
memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri
DNA, RNA dan substansi dasar
lainnya
Prinsip Isolasi DNA
• Isolasi DNA dilakukan
dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari
bahan lain seperti
protein,lemak, dan
karbohidrat.
Isolasi
Ekstraksi
• Pemisahan DNA dari
bahan padat seperti
selulosa dan protein
• Menghilangkan
beberapa kontaminan
seperti senyawa
sekunder
(fenol), polisakarida, RN
A dan juga protein.
Pemurnian

4. Beberapa hal yang perlu
diperhatikan dalam mengisolasi
DNA
• Harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan
seperti protein dan RNA.
• Metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk
semua spesies.
• Metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA.
• Metodenya harus sederhana dan cepat.

5. PENGERTIAN MIKROBA
Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut
sebagai mikroba atau mikroorganisme atau
jasad renik. Jasad renik disebut sebagai
mikroba bukan hanya karena ukurannya yang
kecil, sehingga sukar dilihat dengan mata biasa,
tetapi juga pengaturan kehidupannya yang
lebih sederhana dibandingkan dengan jasad
tingkat tinggi.

6. JENIS-JENIS MIKROBA
Bakteri
Virus
Jamur
Alga
Khamir
• Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes, berkembang biak
secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat
fotosintetik
• Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme biologis. Virus jauh
lebih kecil daripada bakteri dan oleh karena itu dapat menerobos saringan bakteri dengan
mudahnya
• Jamur atau cendawan adalah tumbuhan yang tidak mempunyai klorofil sehingga
bersifat heterotrof.
• Alga merupakan protista yang bertalus memiliki pigmen dan klorofil.
• Khamir merupakan organisme eukariot uniseluler yang secara taksonomi termasuk kedalam
kingdom Eucaryota.

7. Pada kelompok prokaryot, umumnya hanya
ada satu unit bahan genetik utama yang
membawa semua informasi genetik yang
diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan
jasad tersebut.
Pemanenan
sel
Prinsip Isolasi
DNA Bakteri
(Plasmid)
• Pemanenan sel dilakukan dari biakan
yang telah diinkubasi sebelumnya
Perusakan
dan
pembuangan
dinding sel
• Perusakan dinding sel antara lain dapat
dilakukan dengan pemberian lisozim
lisis sel
• lisis sel biasanya digunakan sodium
dodesyl sulfat (SDS)
Pembuangan
remukan sel
• Pembuangan kontaminan sel dilakukan
dengan cara sentrifugasi
Pemisahan • Protein dan RNA masingDNA dari
masing dihilangkan
menggunakan kloroform dan
protein
RNAse
dan RNA

8. Kultur Bakteri
(E.Coli)
- Kultur selama 1 malam
- Sentrifuge (mengambil kultur dan
menghilangkan medium)
Larutan I
(glucose)
Jika ada larutan
berkonsentrasi tinggi
masuk ke dalam
sel, dengan sendirinya
membran sel akan
rusak
Larutan II
(NaOH & SDS)
NaOH : merusak membran sel
SDS : sabun untuk
menghancurkan membran sel
Metoda Isolasi
DNA Bakteri
Larutan III
(netralisasi)
- sentrifuge
Menggumpal & menyatu
Indikator untuk melihat lendirlendir dimulut tabung yang
menandakan bahwa bahwa
membran sel telah terpecah
Supernatan
(berisi DNA)
- Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol)
DNA bebas dari komponen lain
+ etanol 100% dan NaAc (membantu pengendapan)
Pengendapan
-
Inkubasi
Cuci dengan EtOH 70%
Keringkan
DNA murni

9. Prinsip Isolasi DNA Virus
(Bakteriophage)
Preparasi DNA bakteriophage atau virus, sedikit agak
berbeda dengan sel-sel bakteri, yaitu :
1. Phage diisolasi dari kultur sel-sel yang terinfeksi.
2. Dilakukan
sentrifugasi
dengan
ultra
sentrifugasi, sampai diperoleh supernatan berisi
phage dan terpisah dari kultur selnya (dalam
bentuk endapan atau pellet).
3. Tambahkan PEG (poli ethilen glikol) + NaCl
untuk presipitasi partikel phage, sentrifugasi dan
diperoleh pellet phage murni.

10. Isolasi DNA
Jamur
Misellium
Jamur
- Subkultur dalam medium PDB (Potato
Dextrose Broth)
- Isolasi menggunakan CTAB (Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide)
+ nitrogen cair ke dalam miselium
Terbentuk kristal
- Digerus dalam lumpang
Bubuk Misellium
+ larutan dapar mengandung CTAB
- Divortex beberapa menit
- Inkubasi suhu 65 C (2 jam)
- Sentrifugasi 5000 rpm (25 menit)
Endapan
+ kloroform : isoamylalcohol (24:1)
Vortex sampai homogen
Sentrifugasi 10000 rpm (10
menit)
Supernatan
- Pindahkan tabung baru
+ kloroform,isoamyl alcohol,isopropanol
- Simpan pada suhu -20 C (2 jam)
Campuran Larutan
- Sentrifugasi 10.000 rpm

11. Pelet
- Cuci dengan alkohol 80%
- Sentrifugasi
- Larutkan dengan TE
(TrisEDTA)
- Simpan pada suhu -20 C
Hasil Isolasi DNA

12. Isolasi DNA Khamir

14. Tahap
III
amplifikasi daerah
ITS (Internal
Transcribed
Spacer) dengan
metode PCR
1. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA
untai ganda akan membuka menjadi
dua untai tunggal.
2. Penempelan primer
Pada tahap penempelan primer
(annealing), primer akan menuju
daerah yang spesifik yang
komplemen dengan urutan primer.
3. Reaksi polimerisasi (Extension)
Primer yang telah menempel tadi
akan mengalami perpanjangan pada
sisi 3’nya dengan penambahan
dNTP yang komplemen dengan
templat oleh DNA polimerase.

15. Pengertian RNA
RNA merupakan singkatan dari
Ribonukleatid Acid atau Asam
ribonukleat. RNA merupakan substansi
genetik yang berperan sebagai perantara
dalam proses pengkodean protein dari
gen yang terdapat di dalam DNA.

16. Ekstrasi RNA
• mRNA merupakan materi genetik yang mengkode
suatu protein. mRNA prokariot dapat dipisahkan
dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT.
• RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan
menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk
mendegradasi DNA.

17. Tahap
Isolasi RNA
Penghancuran dinding sel.
- Kotoran akibat lisis sel
dipisahkan dengan cara
sentrifugasi.
- Kemudian molekul
nuleotida (DNA dan RNA)
yang telah dipisahkan
dibersihkan dari protein yang
masih ada dengan
menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian
kecil RNA juga dapat
dibersihkan. Sedangkan
choloform digunakan untuk
membersihkan sisa-sisa
protein dan polisakarida dari
larutan.
Penghilangan protein
dan DNA
Enzim DNAase digunakan
untuk menghancurkan
DNA sehingga RNA dapat
diisolasi secara utuh
Pemurnian RNA
Purifikasi RNA dapat
dilakukan dengan
mencampur larutan DNA
tersebut dengan PCl yang
berfungsi memekatkan,
memisahkan RNA dari
larutan, dan mengendapkan.

18. Metodemetode Isolasi
RNA
Rt-PCR
• Teknik RT PCR merupakan suatu
pengembangan dari teknik PCR
untuk melakukan analisis terhadap
RNA hasil transkripsi yang hanya
terdapat dalam jumlah yang sedikit
di dalam sel
GTC
• RNA diisolasi dengan cara
menghomogenasi jaringan pada
buffer ekstraksi yang mengandung
Guanidinium Thiocyanate (GTC)
untuk melisiskan sel dan
menonaktifkan RNase endogenous.

19. DAFTAR PUSTAKA
• Edining,Annisa Retno.2008.Skripsi Identifikasi Khamir
dari Perairan Mangrove dan Laut Cagar Alam
Pulau Rambut Berdasarkan Daerah Internal
Trancribed Spacer (ITS). Universitas Indonesia : Jakarta
• Syukur, Sumaryati dan Endang Purwati.2013. Bioteknologi
Prebiotik Untuk Kesehatan Masyarakat. Andi :
Yogyakarta
• http://journal.fmipa.itb.ac.id/jms/article/viewFile/189/186
• http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teachingresponsibility/general/dna-isolation/
• http://hendry1.wordpress.com/tag/jenis-mikroba/