Nhận file word miễn phí nhắn tin zalo 03838.288.54 nhé. Luận văn thạc sĩ : nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương của dẫn xuất từ hạt cây me.

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Văn Ngọc
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG
CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT CÂY ME
(Tamarindus indica L.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội - 2021

2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Nguyễn Văn Ngọc
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CẢM ỨNG SỰ HÌNH THÀNH XƯƠNG
CỦA DẪN XUẤT POLYSACCHARIDE TỪ HẠT ME
(Tamarindus indica L.)
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hướng dẫn 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Mai Phương
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Thị Hồng Minh
Hà Nội - 2021

3. 1
MỞ ĐẦU
Loãng xương đang là căn bệnh phổ biến toàn cầu. Loãng xương làm
tăng tính dòn của xương dẫn đến dễ bị gãy, vì thế ảnh hưởng nghiêm trọng
đến sức khỏe, cuộc sống của mỗi cá nhân và cả cộng đồng xã hội. Tổ chức y
tế thế giới đang rất quan tâm và mong muốn cải thiện được tình trạng này,
nhằm nâng cao sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống của con người. Tỷ lệ
người bị loãng xương đang ngày một tăng lên ở cả các nước phát triển và
đang phát triển, đặc biệt là với những người có tuổi. Các số liệu thống kê cho
thấy khoảng trên 200 triệu người trên toàn thế giới bị bệnh này và khoảng 2,8
triệu người Việt Nam đang mắc phải bệnh loãng xương.
Loãng xương xảy ra do sự mất cân bằng giữa sự mất xương và sự hình
thành xương, trong đó sự hình thành xương xảy ra chậm hơn sự mất xương.
Vì vậy, các nghiên cứu tập trung vào việc tìm kiếm các chất có hoạt tính làm
tăng sự hình thành xương hoặc làm giảm sự mất xương để điều trị loãng
xương đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm. Phần lớn các thuốc trên
thị trường là các tác nhân làm giảm sự mất xương. Trong khi đó, chỉ có rất ít
chất có khả năng cảm ứng làm tăng sự tạo xương. Thêm vào đó, việc sử dụng
các thuốc hóa học hiện nay để xử lý loãng xương có một số hạn chế về hiệu
quả cũng như gây phản ứng phụ khi sử dụng lâu dài. Do đó, việc phát hiện và
sử dụng những chất tự nhiên có khả năng cảm ứng tái tạo xương mới, ít gây
phản ứng phụ để xử lý bệnh loãng xương và duy trì độ bền của xương là
hướng nghiên cứu mới, có nhiều tiềm năng ứng dụng để điều trị bệnh loãng
xương cũng như các bệnh liên quan khác.
Theo thống kê của Viện Dược liệu thì nước ta có khoảng 4000 loài thực
vật được dùng làm thuốc ở các mức độ khác nhau. Các số liệu trên đây cho
thấy tiềm năng to lớn của nguồn dược liệu Việt Nam rất phong phú, có thể sử
dụng như nguồn nguyên liệu tiềm năng trong các nghiên cứu sàng lọc nhằm
tìm ra những hợp chất có hoạt tính dược học quý hiếm, trong đó có các chất
có tác dụng cảm ứng tái tạo xương mới và hiệu quả.

4. 2
Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản
địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế
giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam.
Polysaccharide từ hạt me (TSP) có nhiều hoạt tính sinh học quý và được ứng
dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. TSP có khả năng chống oxy
hóa, hạ cholesterol, giảm khả năng xơ vữa thành mạch máu. TSP cũng có thể
sử dụng như là một chất làm đặc và ổn định, làm tác nhân gel hóa, làm chất
làm ổn định nước đá tinh thể và thay thế tinh bột vì nó có tính chất tương tự
như tinh bột nhưng ổn định hơn. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong
điều trị bệnh về tiêu hóa và được sử dụng làm chất mang thuốc chữa bệnh đại
tràng. Liên quan đến hướng nghiên cứu về tác dụng lên bảo vệ xương, các
hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác dụng tích
cực đối với một số bệnh xương khớp. Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide
tự nhiên từ quả me cũng đang được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh
học scaffold ứng dụng trong y dược. Mặc dù các công trình công bố đã chứng
tỏ TSP và các dẫn xuất của nó có nhiều hoạt tính sinh học quý, có khả năng
ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhưng các nghiên cứu sâu
về cơ chế tác dụng của TSP và các dẫn xuất của nó đối với quá trình biệt hóa
tế bào tạo xương vẫn còn thiếu vắng. Cho đến nay, chưa có công trình nào
nghiên cứu một cách toàn diện và đầy đủ ảnh hưởng của TSP và các dẫn
xuất của nó, đặc biệt là dẫn suất sulphate, đến quá trình tái tạo xương
(TTX).
Xuất phát từ những tồn tại chung, xu hướng nghiên cứu hiện nay, cũng
như để góp phần khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên phong phú của nước ta,
chúng tôi thực hiện đề tài luận văn: “Nghiên cứu hoạt tính cảm ứng sự hình
thành xương của dẫn xuất polysaccharide từ hạt me (Tamarindus indica
L.)” nhằm đánh giá đầy đủ tác dụng cảm ứng sự hình thành xương của dẫn
xuất TSP tiềm năng trên mô hình in vitro.

5. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÃNG XƯƠNG
1.1.1. Lịch sử, định nghĩa, và phân loại loãng xương
1.1.1.1. Lịch sử bệnh loãng xương
Loãng xương được xác định xuất hiện từ thời Ai Cập cổ đại năm 990 –
TCN khi tìm thấy các xác ướp có bướu ở người hạ cấp. Thế kỷ 18, bác sĩ
phẫu thuật người Anh John Hunter đã phát hiện ra rằng khi xương mới được
đặt trong cơ thể, xương cũ sẽ bị phân hủy hoặc được tái hấp thụ. Quá trình
phân hủy hay tái hấp thu này được chứng minh là đóng vai trò quan trọng
trong bệnh loãng xương.
Năm 1830, nhà nghiên cứu bệnh học người Pháp Jean Lobstein nhận
thấy rằng xương của một số bệnh nhân bị thủng lỗ lớn hơn thông thường và
ông đã đặt ra thuật ngữ loãng xương (xương xốp) để mô tả sự thay đổi của
xương người.
Hình 1.1. Cấu trúc mô xương người bình thường so với người loãng xương [1]
Bình thường Loãng xương

6. 4
Mặc dù có lịch sử lâu đời nhưng định nghĩa bệnh loãng xương mới chỉ
được Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization - WHO) chính thức
đưa ra vào năm 1991 tại Thụy Sĩ và tiếp tục hoàn thiện cập nhật vào năm
2001[1].
Loãng xương được định nghĩa là một tình trạng rối loạn chuyển hóa
của bộ xương làm giảm sức mạnh của xương dẫn đến làm tăng nguy cơ gãy
xương. Sức mạnh của xương được phản ánh thông qua hai yếu tố: khối lượng
xương và chất lượng xương [2]. Đo mật độ xương sẽ cho ta biết lượng chất
khoáng trong 1 đơn vị diện tích hoặc thể tích của xương. Còn chất lượng
xương được đánh giá bởi các thông số: cấu trúc của xương, tốc độ chuyển hóa
của xương, độ khoáng hóa, mức độ tổn thương tích lũy, tính chất của các chất
cơ bản của xương.
1.1.1.2. Phân loại bệnh loãng xương
Dựa vào các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa xương, loãng xương có
thể được phân thành hai nhóm chính là loãng xương nguyên phát (type 1 và
type 2) do tuổi tác hoặc tình trạng mãn kinh và loãng xương thứ phát do một
số bệnh mạn tính hoặc liên quan đến sử dụng một số loại thuốc…
1.1.2. Cơ chế và các phương pháp điều trị bệnh loãng xương
1.1.2.1. Cơ chế
Loãng xương xuất phát từ sự mất cân đối giữa hai hoạt động tạo xương
và hủy xương mà cụ thể là lượng xương bị đào thải nhiều hơn lượng xương
mới thay.
Ở cấp độ phân tử, mô xương được cấu thành từ tế bào tạo xương
(osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast) và nhóm một số tế bào khác.
Những tế bào này tương tác với một số chất khoáng, protein, hormone và các
phân tử khác để nuôi dưỡng xương, liên tục đục bỏ xương cũ thay bằng
xương mới. Tế bào tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung
mô (mesenchymal stem cell – MSC) có tác động thay đổi đến cấu trúc xương,
tạo những lớp xương góp phần tạo lực của xương. Những tế bào này khi đặt
trong điều kiện thích hợp có thể chuyển hóa thành tế bào xương nhưng trong

7. 5
điều kiện khác chúng cũng có thể trở thành tế bào cơ, mỡ hoặc sụn. Tế bào
hủy xương (osteoclast) là những tế bào xuất phát từ tế bào tạo máu có chức
năng đục bỏ xương cũ hay xương bị tổn hại qua một quá trình phân hủy chất
khoáng. Trong điều kiện bình thương, chức năng của tế bào hủy xương và tế
bào tạo xương hoạt động mức độ tương đương nhau và tín hiệu của loại tế bào
này ảnh hưởng đến loại tế bào kia.
Trong cơ thể con người, mô xương được cấu thành từ trong bụng mẹ và
được làm mới duy trì sự phát triển qua hai quá trình là modelling và
remodelling. Hai quá trình này xảy ra với những cơ chế riêng biệt để biệt hóa
các nhóm tế bào xương, giúp đạt được sự tạo thành xương hoặc làm mới
xương. Hai quá trình này, phối hợp nhau trong quá trình phát triển xương để
định dạng xương thích hợp, duy trì nồng độ huyết thanh của các ion và sửa
chữa các vùng cấu trúc xương bị tổn thương.
Hình 1.2. Quá trình remodel [3]

8. 6
Quá trình remodel là quá trình chu chuyển xương từ lúc còn nhỏ đến
trước khi trưởng thành (18-20 tuổi). Chức năng của quá trình là hoàn chỉnh
khối xương làm cho xương thay đổi kích thước hình dạng và tăng trưởng.
Trong quá trình này, hai hoạt động tạo và hủy xương xảy ra một cách độc lập
tại một vị trí, hoạt động tạo xương diễn ra mạnh hơn hủy xương. Quá trình
remodel là quá trình diễn ra liên tục, suốt đời, nhưng tốc độ xảy ra giảm dần
theo tuổi tác. Chức năng của quá trình là duy trì mật độ xương, phân hủy
những mảng xương cũ hay xương bị tổn hại và thay thế bằng những mảng
xương mới. Remodel là quá trình rất cần thiết để duy trì lực của xương. Quá
trình này luôn xảy ra theo trình tự gồm: hoạt hóa (activation), hủy xương
(resorption), trung gian (reversal), hình thành xương (bone formation) và
khoáng hóa (mineralization).
Quá trình remodel được bắt đầu khi các tế bào hủy xương (osteoclast)
được biệt hóa và hoạt động để loại bỏ xương già, xương hỏng bằng cách hấp
thu các chất khoáng để lại những lỗ hổng trên bề mặt xương. Tế bào đơn nhân
(monocuclear cells) thu dọn các mảnh vụn được thải ra trong hoạt động hủy
xương và chuẩn bị bề mặt đã được phục hồi trước khi tế bào tạo xương
(osteoblast) sửa chữa xương bị tổn hại. Tiếp theo, tế bào tạo xương tổng hợp
các thành phần hữu cơ và vô cơ của xương, thay thế phần xương đã bị hấp thụ
thông qua quá trình biệt hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation). Sự
khoáng hóa xương (mineralization) và sự biệt hóa của một số tế bào tạo
xương thành tế bào xương (osteocytes) là giai đoạn cuối để hoàn thành quá
trình tái mô hình [4].
Trong quá trình remodel, hai hoạt động tạo và hủy xương diễn ra trên
bề mặt xương với tốc độ 2-10% xương hằng năm. Trước khi bước vào giai
đoạn trưởng thành hoạt động tạo xương diễn ra tương đương hoạt động hủy
xương, do đó mật độ xương đạt mức độ cao ở độ tuổi 20-30. Sau khi đạt mức
tối đa, xương bắt đầu suy giảm với tốc độ khác nhau theo độ tuổi. Sau thời kỳ
mãn kinh vài năm ở nữ và sau 50 tuổi ở nam, hoạt động hủy xương lấn át hoạt
động tạo xương, tỷ lệ hủy xương và tạo xương mất cân bằng mà cụ thể là sự
hình thành xương ít hơn sự hấp thụ xương, sẽ gây mất cân bằng nội mô xương

9. 7
và dẫn đến tình trạng cơ thể bắt đầu mất xương, mật độ xương, trọng lượng và
độ cứng của xương giảm dẫn đến tình trạng loãng xương.
Trong quá trình remodel, một số protein và các nhân tố như osterix
(OSX), COX2 và Runx2 tham gia vào quá trình làm tăng sự biểu hiện của
alkaline phosphatase (ALP), osteopontin (OPN) và osteocalcin (OSC). Đây là
những nhân tố quyết định sự tạo ra tế bào xương trưởng thành (mature
osteoblast) (Hình 1.3).
Tế bào gốc trung mô từ tủy xương (MSC) đến thời điểm này đã được
chứng minh là dòng tế bào gốc đa năng, với khả năng biệt hóa giới hạn trong
các dòng tế bào thuộc lớp trung mô như tế bào xương, sụn, và mỡ. Tuy nhiên,
một số thí nghiệm khác cũng cho thấy rằng dòng tế bào gốc này cũng có khả
năng biệt hóa thành tế bào gan, tế bào tim, tế bào thần kinh nhưng quá trình
biệt hóa rất nhiều giai đoạn và có tỉ lệ thành công thấp.
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình phát triển biệt hóa tế bào gốc (MSC) thành tế bào
tạo xương [5]

10. 8
Quá trình biệt hóa tế bào xương trưởng thành từ tế bào gốc MSC trải
qua 4 giai đoạn được chỉ ra trong hình 1.3. Bắt đầu của quá trình là từ tế bào
gốc ở tủy – MSC (1), trải qua giai đoạn tăng sinh - proliferation (2) để trở
thành tiền tế bào xương – pre-osteoblast (3) và qua giai đoạn khoáng hóa
(mineralization) để trở thành tế bào xương trưởng thành – mature osteoblast
(4) [2].
1.1.2.2. Các phương pháp điều trị loãng xương
Kiểm soát loãng xương có thể không dùng thuốc bao gồm việc cung
cấp đủ canxi và vitamin D, tập thể dục tăng cân, cai thuốc lá, hạn chế uống
rượu / caffein và các kỹ thuật phòng ngừa bị ngã.
Trong trường hợp phải điều trị loãng xương dùng thuốc thì định hướng
hiên nay tập trung vào hai hướng là:
 Ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hủy xương (osteoclast)
 Làm gia tăng các nhân tố tái tạo xương (TTX) thông qua biệt hóa các tế
bào tạo xương (osteoblast differntiation).
Hiệu quả điều trị của thuốc phụ thuộc vào tuổi tác, giới tính và sức
khỏe của bệnh nhân. Các chất ức chế đang được sử dụng là bisphosphonates,
chất chủ vận/ đối kháng estrogen [EAAs], estrogen, calcitonin và
denosumab). Bisphosphonates vẫn là lựa chọn điều trị hàng đầu và tiết kiệm
chi phí nhất cho bệnh loãng xương, nhưng ngày càng có nhiều lo ngại về tính
an toàn lâu dài của chúng. Tuy nhiên, không phải tất cả các loại thuốc điều
trị loãng xương đều được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA)
chấp thuận để điều trị loãng xương. Thuốc điều trị đầu tay cho hầu hết bệnh
nhân có nguy cơ gãy xương cao bao gồm alendronate, risedronate, zoledronic
acid và denosumab. Đối với những người không thể sử dụng liệu pháp uống
và có nguy cơ gãy xương cao, nên sử dụng teriparatide, denosumab hoặc axit
zoledronic. Đối với nam giới bị loãng xương, điều trị đầu tay là dung thuốc
bisphosphonates [6].

11. 9
Hầu hết những liệu pháp điều trị loãng xương hiện nay tập trung vào
giải pháp làm giảm sự mất xương nhưng không khôi phục lại được khối lượng
xương đã bị mất và độ cứng của xương, liệu pháp làm gia tăng TTX còn ít
được đề cập đến [6]. Vì vậy, hướng nghiên cứu và ứng dụng những nhân tố
(factor) kích thích TTX để phục hồi một phần khối lượng xương đã bị mất,
sửa chữa sự mất cân bằng các đặc điểm vi cấu trúc xương xốp do loãng xương
nhờ đó làm tăng độ cứng của xương và kết hợp giữa các nhân tố kìm hãm sự
mất xương với kích thích TTX đang là hướng nghiên cứu mới và đầy triển
vọng cho điều trị loãng xương.
Sử dụng các chất có khả năng cảm ứng TTX, người ta có thể tạo vật
liệu sinh học mới ở dạng “giá đỡ” ba chiều (3D scaffold) có khả năng điều trị
bệnh [6]. Vật liệu này là một khuôn ngoại bào nhân tạo với nhiều lỗ xốp và có
khả năng phân hủy sinh học, bao gồm các tế bào nuôi cấy, các phân tử tín
hiệu (các nhân tố tăng trưởng hay chất TTX) và khuôn 3D. Các tế bào và
phân tử tín hiệu sẽ được cấy vào khuôn 3D scaffold và sau đó được đưa vào
vùng xương cần ghép để cảm ứng sự tăng trưởng và sản sinh xương mới. Sau
khi scaffold được đưa vào cơ thể, tế bào sẽ bám dính, phân chia, biệt hóa, di
chuyển vào các lỗ scaffold, đồng thời tiết ra các thành phần nền ngoại bào cần
thiết để tạo mô và tổ chức hình thành mô khỏe mạnh bình thường [7].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu loãng xương trên thế giới và ở Việt
Nam
1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Trong các nghiên cứu đã được công bố, hợp chất berberine được
nghiên cứu khá nhiều và đã được chứng minh là có thể làm giảm loãng xương
bằng cách ức chế hoạt tính của tế bào hấp thụ xương osteoclast và kích thích
biệt hóa tế bào tạo xương osteoblast. Li và cs., [8] đã chứng minh rằng
berberine làm ngăn chặn sự suy giảm mật độ khoáng hóa xương in vivo và in
vitro bằng cách ức chế sự hấp thụ xương bởi tế bào hấp thụ xương osteoclast.
Ngoài ra, berberine còn cảm ứng sự chết tế bào hấp thụ xương osteoclast theo
con đường apoptosis. Nhóm nghiên cứu sau đó cũng đã chứng minh rằng
berberine có thể ngăn chặn sự mất xương ở những người bị loãng xương do

12. 10
sự già hóa [9]. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của berberine đến quá trình biệt
hóa tế bào tạo xương (osteoblast differentiation), Lee và cs., [10] đã cho thấy
berberine làm tăng sự hình thành xương (bone formation) thông qua việc hoạt
hóa nhân tố phiên mã chính trong quá trình tạo xương (Runx2) bởi protein
p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), từ đó chứng minh berberine
có thể là nhân tố tiềm năng để điều trị các rối loạn liên quan đến bao gồm
loãng xương, xương. Nghiên cứu của Han và cs., [11] đã chỉ ra hợp chất dẫn
xuất của berberine (berberine bioisostere Q8) có thể cảm ứng biệt hóa tế bào
tạo xương in vitro.
Trong một nghiên cứu khác với hợp chất từ quả me, Sundaram và cs.,
[12] đã chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me (tamarind
seed extract- TSE). TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn,
phân hủy xương và kháng viêm. Nghiên cứu của Sanyasi và cs., [13] đã mô tả
và xác định một hydrogel mới đóng vai trò là một vật liệu cho kỹ nghệ mô
xương (bone tissue engineering), trong đó carboxyl methyl tamarind
polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả me. Nhóm tác giả chứng
minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám dính, sự sinh trưởng một cách
hiệu quả các tế bào tiền tạo xương (bone precursor cells). Gần đây, nhóm
nghiên cứu này đã tìm ra một vật liệu mới được tổng hợp từ polysaccharide tự
nhiên có nguồn gốc từ bột quả me được gắn với acrylic acid (AA) là TKP –
AA có tiềm năng sử dụng như là vật liệu sinh học scaffold và cho kỹ nghệ mô
xương với giá thành thấp.
Lĩnh vực thiết kế chế tạo vật liệu sinh học scaffold sử dụng kỹ thuật in
3D (3D printing) đã được sử dụng nhiều trên thế giới. Kỹ thuật in 3D đã được
sử dụng rộng rãi cho việc chế tạo "giá đỡ" ứng dụng trong y học và tái tạo mô
hay kỹ nghệ mô tế bào (TE). TE là một công nghệ đầy triển vọng cho việc gia
tăng tái tạo và sửa chữa những sai sót của mô bởi sự tương tác giữa tế bào,
“giá đỡ” (scaffold) và tương thích những nhân tố tăng trưởng trên bề mặt “giá
đỡ”. Những đặc điểm này giúp cho vật liệu nhân tạo tương tự như mô tự
nhiên. Do đó, tế bào dễ dàng bám dính và tăng sinh trên vật liệu 3D.

13. 11
Nguyên lý chung cho việc chế tạo vật liệu 3D scaffold để điều trị bệnh
về xương là tạo vật liệu giá đỡ 3D (chất nền) mang các yếu tố bổ sung để giúp
cho tế bào xương có thể phát triển và biệt hóa. Sau đó, chất tự nhiên có hoạt
tính cảm ứng TTX được gắn trên chất nền sẽ cảm ứng tế bào xương, kích
thích quá trình biệt hóa tế bào, hình thành xương mới. Tuy nhiên, nhiều vật
liệu giá đỡ 3D không có khả năng tự hủy trong cơ thể sau khi đã hình thành tế
bào xương mới do đó bệnh nhân cần phải thực hiện lại phẫu thuật nhằm đem
vật liệu đó ra khỏi cơ thể. Các nghiên cứu theo hướng này đang được tiến
hành mạnh mẽ nhằm khắc phục nhược điểm này bằng cách sử dụng chất nền
sinh học và hướng tới ứng dụng điều trị
Hàng loạt các nghiên cứu trên các đối tượng thực vật khác nhau đã cho
thấy triển vọng của việc phát hiện các chất tự nhiên có hoạt tính TTX từ thực
vật [14,15,16]. Tuy nhiên, các nghiên cứu theo hướng này còn chưa nhiều và
còn thiếu vắng các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng ở mức phân tử cũng
như những đánh giá đầy đủ trên mô hình in vivo nhằm mục đích ứng dụng
trong điều trị hay tạo vật liệu cho TE.
1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú, chứa đựng kho
tàng vô giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học và dược lý. Rất nhiều loài thực
vật được sử dụng như là nguồn dược liệu quí trong nhân dân để chữa trị bệnh
với tính an toàn và hiệu quả cao, trong đó có những loại cây được sử dụng lâu
đời để điều trị các bệnh về xương khớp như Mimosa pudica L., Solanum
procumbens, Piper lolot. Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú và tiềm
năng để cung cấp các chất có hoạt tính cảm ứng sự hình thành xương.
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính cảm
ứng TTX tiềm năng, có thể ứng dụng và ít tác dụng phụ cho điều trị loãng
xương và các bệnh xương khớp đang là vấn đề còn mới mẻ và cũng nhận được
sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Hướng nghiên cứu các hợp chất tự nhiên
có khả năng ứng dụng trong điều trị loãng xương mới chỉ được thực hiện trên
mô hình in vivo. Trong khi đó, các nghiên cứu trên mô hình in vitro còn rất
hạn chế. Nhóm nghiên cứu của trường Đại học Tôn Đức Thắng đã tiến hành

14. 12
khảo sát tác dụng của cao xương cá sấu hoa cà trên mô học xương đùi chuột
nhắt trắng bị gây loãng xương cảm ứng bởi prednison (corticoid). Chuột thí
nghiệm bị loãng xương sau đó được điều trị bằng alendronat (5 mg/kg) hay
cao xương cá sấu hoa cà ở cả hai liều uống 1.89 g/kg và 3.77 g/kg trong 4
tuần. Kết quả cho thấy, việc sử dụng cao xương cá sấu hoa cà có tác dụng làm
giảm thiểu các khuyết hỏng do prednison gây ra trong cấu trúc xương, làm
tăng sự hiện diện của các tế bào xương (cốt bào, hay osteocyte cells) ở khu
vực bị loãng xương, phục hồi lại sự hiện diện của các nguyên bào xương (tế
bào tạo xương, hay osteoblast cells) tại những vị trí mà xương bị thiếu hụt.
Điều này chứng tỏ quá trình khôi phục xương đang diễn ra để lặp lại sự cần
bằng trong quá trình tái cấu trúc xương [16]. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa
đi sâu tìm hiểu cơ chế và đường hướng phân tử của cao xương cá sấu hoa cà
đối với sự TTX. Có thể thấy, phần lớn các nghiên cứu hiện nay sử dụng mô
hình gây loãng xương in vivo trên chuột do phù hợp với điều kiện nghiên cứu
ở Việt Nam so với các mô hình in vivo trên các động vật khác trên thế giới.
Tuy nhiên, việc sử dụng mô hình in vivo trên chuột cũng còn nhiều hạn chế
trong các nghiên cứu sàng lọc cũng như nghiên cứu cơ chế phân tử.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của Tô Thanh Thúy, trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội lại tập trung theo hướng phát triển,
chuyển hóa xương trên mô hình cá medaka và zebrafish và sàng lọc các thuốc
và hợp chất tự nhiên có tác dụng đến chuyển hóa xương và chống loãng xương
[17,18]. Nhóm nghiên cứu sử dụng mô hình cá chuyển gen rankl:HSE:CFP
mang cấu trúc gen chuyển bao gồm một promoter cảm ứng nhiệt điều khiển
hai chiều đồng thời gen rankl (receptor activator of niclear factor kappa-β
ligand) và gen mã hóa cho protein chỉ thị huỳnh quang CFP (complement
factor properdin) để sàng lọc các hoạt chất chống loãng xương. Ấu trùng cá
này khi bị sốc nhiệt sẽ biểu hiện Rankl ngoại sinh làm tế bào hấp thụ xương
hình thành và hoạt động, gây ra sự phá hủy mô xương đang được khoáng hóa
tạo ra kiểu hình giống loãng xương ở giai đoạn phát triển rất sớm. Trong một
nghiên cứu gần đây, ấu trùng cá medaka chuyển gen mô phỏng bệnh loãng
xương được điều trị bằng hai loại thuốc là etidronate và alendronate (hai loại
biphosphonates thông dụng để điều trị bệnh loãng xương trên người). Sử dụng

15. 13
các kỹ thuật hình ảnh, các kết quả cho thấy tác dụng ức chế hoạt tính của tế
bào hấp thụ xương một cách có hiệu quả và phụ thuộc nồng độ, làm duy trì và
phục hồi độ toàn vẹn xương. Nhóm tác giả đã kết luận mô hình cá medaka là
phù hợp để nghiên cứu sàng lọc thuốc chống loãng xương in vivo [18]. Tuy
vậy, cơ chế phân tử của thuốc cần sàng lọc (chất cần nghiên cứu) đối với bệnh
loãng xương vẫn chưa được thực hiện trên mô hình cá này. Như vậy, có thể
thấy rằng các nghiên cứu trong nước đối với các chất có khả năng TTX, đặc
biệt là trên các chất tự nhiên còn rất hạn chế và chưa được đầu tư nghiên cứu
chuyên sâu.
Với tamarind seed polysaccharide (TSP) và dẫn suất dạng sulfate của
nó (TSPS), nhóm nghiên cứu của Bùi Ngọc Tân và cs., [19, 20] đã nghiên cứu
chiết tách và bước đầu xác định thành phần hóa học của TSP từ quả me. Sau
đó, nhóm nghiên cứu này cũng đã tổng hợp dẫn suất TSPS và đánh giá một số
hoạt tính sinh học của dẫn suất thu được. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu về
các hoạt tính sinh học, đặc biệt là hoạt tính cảm ứng TTX của các dẫn suất
sulfate này vẫn chưa được thực hiện.
1.2 TỔNG QUAN VỀ POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ ME
1.2.1 Giới thiệu về cây me
Cây me (Tamarindus indica L.) thuộc họ Đậu (Fabaceae), là cây bản
địa của vùng nhiệt đới châu Phi nhưng được phân bố rộng rãi trên toàn thế
giới ở trên 50 quốc gia và cũng được trồng phổ biến ở Việt Nam. Cây me
được sử dụng như một loại thảo dược tại nhiều quốc gia trên thế giới như Ấn
Độ và Châu Phi [21].

16. 14
Hình 1.4. Cây me (Tamarindus indica L.)
Các bộ phận của cây me được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau
trong lĩnh vực thực phẩm hay dược phẩm. Cây me cao 15 đến 30 m, tán cây
rộng, nhiều lá. Lá cây me có dạng kép lông chim chẵn, dài từ 8 cm đến 10 cm,
gồm 10 đến 20 đôi lá chét thuôn không cân xứng, chóp lõm, dài 20 mm, rộng
2mm. Hoa trắng nhạt có những vệt đỏ hay trắng, mọc thành chùm đơn ở kẽ lá
hay thành chùy tận cùng. Quả dài mọc thõng xuống, hơi dẹt, dài 7-12 cm,
rộng 25 mm, dày 10 mm. Vỏ quả ngoài mỏng, cứng, giòn, màu hung đỏ, vỏ
quả giữa có xơ, vị chua, sau khi loại hết xơ, thịt thì phần hạt ở giữa có màu
nâu nhạt hay vàng nhạt. Quả chứa 3-5 hạt dẹt, nhẵn màu nâu đỏ, bóng. Mùa
quả vào tháng 10-11.
Các bộ phận của cây me như quả, hạt, lá, hoa và vỏ cây me đều được sử
dụng với mục đích hóa học thực vật và dược phẩm. Lá và hoa me có thể được
sử dụng như một loại rau trong bữa ăn truyền thống của nhiều dân tộc.
Đặc biệt, quả me và hạt me đã được nhiều tác giả nghiên cứu về thành
phần và tác dụng trong hóa học thực vật và dược phẩm. Trong quả me có
chứa chủ yếu hơn 10% acid hữu cơ (9,4% acid citric, 1,55% acid tactric,
0,45% acid malic), kali bitactrat 3,25%, đường 12,5%, gồm 4,70%, pectin
6,25%. Ngoài ra còn có 34,35% xơ, nước 27,55%. Trong hạt có glucose,
xylan, protein, chất béo, muối vô cơ. Trong đời sống quả me được sử dụng
theo mùa vụ, như làm thực phẩm, tạo hương vị, gia vị trong món cà ri, súp và

17. 15
cũng là thành phần chính trong một số loại nước ép và đồ uống. Người ta có
thể dùng quả me để ăn trực tiếp hoặc thêm vào trong đồ uống và cũng có thể
chế biến thành mứt, kẹo. Nước quả me là loại đồ uống bổ dưỡng, được nhiều
nước trên thế giới sử dụng và có nhiều cách thức chế biến khác nhau. Tại một
số quốc gia châu Phi, nước quả me được trộn với tro gỗ để trung hòa vị chua
của acid tartaric. Tuy nhiên phương pháp phổ biến nhất là thêm đường để tạo
vị ngọt cho đồ uống. Phần lớn sản phẩm đồ uống có nước me được sản xuất
thương mại. Đôi khi nước quả me được cho vào trong đồ uống có cồn [22].
Trong y học, theo đông y quả me có vị chua, tính mát, có tác dụng
thanh nhiệt, giúp tiêu hoá, lợi trung tiện và nhuận tràng. Vỏ cây me có vị chát,
có tác dụng làm săn da, dùng làm thuốc cầm máu, điều trị một số bệnh về tiêu
hóa (kiết lỵ, ỉa chảy..) và nấu nước để ngậm chữa viêm lợi [21].
Lá me có tác dụng giải độc, trị bệnh ngoài da, lá me thường được dùng
để nấu nước tắm cho trẻ em đề phòng bệnh ngoài da vào mùa hè. Thịt me, lá
và hoa được kết hợp với nhau trong nhiều bài thuốc đông y để đắp vào các
khớp bị đau. Theo kinh nghiệm dân gian các bộ phận của cây me còn có tác
dụng như: Quả me có tác dụng chữa triệu chứng nôn nghén, chán ăn ở phụ nữ
mang thai, điều trị nôn mửa, đầy hơi và khó tiêu; chữa cảm lạnh. Hạt me có
tác dụng tẩy giun, lá me có tác dụng chữa rôm sảy, mẩn ngứa, vỏ cây me có
tác dụng chữa táo, phòng và chữa viêm lợi, viêm nha chu. Hạt me rang được
coi là một loại gia vị đặc biệt trong thực phẩm [21].
Theo y học phương Tây, quả me được sử dụng như một phương thuốc
lợi tiểu điều trị chứng rối loạn mật, vàng da và tiêu chảy, giúp hệ thần kinh
hoạt động tốt (hàm lượng thiamin 29%), thiamin là một loại vitamin B có vai
trò quan trọng trong các hoạt động của dây thần kinh và cơ bắp. Me là một
nguồn cung cấp vi chất cho cơ thể như Mg2+
, Ca2+
. Quả me là một trong
những nguồn cung cấp chất xơ cao nhất trong các loại trái cây, giúp ngăn
ngừa táo bón (hàm lượng chất xơ 20%). Chất xơ có tác dụng điều hòa nhu
động ruột và được coi như một loại thuốc nhuận tràng tự nhiên và không gây
tác dụng phụ. Quả me có thành phần kali cao gấp hai lần lượng kali trong
chuối. Do đó, quả me có tác dụng kiểm soát huyết áp tốt không kém gì chuối.

18. 16
Nước me giúp ổn định huyết áp bằng cách kiểm soát các tác động của natri
trong cơ thể, tránh để tình trạng lượng natri tăng cao làm cho huyết áp tăng
[22].
Quả me cũng được biết đến như một loại thuốc chữa bệnh thiếu máu
(hàm lượng sắt 2,8%). Vì vậy, đây cũng là loại trái cây rất tốt cho phụ nữ
mang thai. Giúp kiểm soát mức cholesterol (hàm lượng niacin 1,2%). Me
chứa khá nhiều chất niacin, một loại vitamin B rất quan trọng với sức khỏe.
Chất này có thể giúp giảm cholesterol xấu và tăng lượng cholesterol tốt trong
cơ thể. Thành phần của me bao gồm chất riboflavin sẽ giúp chuyển hóa
carbohydrate trong cơ thể thành năng lượng cho nên có thể cung cấp năng
lượng mà không gây béo (hàm lượng riboflavin 9%). Quả me có tác dụng hỗ
trợ cơ chế đông máu (hàm lượng calcium 7%). Quả me là một trong những
loại trái cây giàu canxi. Canxi (với sự giúp đỡ của vitamin K) đóng một vai
trò rất quan trọng trong quá trình đông máu. Vì vậy, quả me được coi là loại
quả có tác dụng ổn định cơ chế đông máu. Quả me cũng có tác dụng giảm sốt
và bảo vệ chống lại cảm lạnh (dùng thịt quả me đun với nước dùng để uống).
Quả me giúp cơ thể tiêu hóa thức ăn, vỏ của hạt me là một phương thuốc hiệu
quả chống tiêu chảy và bệnh lỵ. Mặc dù đã có nhiều tác giả đã công bố về các
ứng dụng đa dạng của cây me và được đưa vào sử dụng trong cuộc sống. Tuy
nhiên cây me vẫn còn có rất nhiều tiềm năng giá trị sử dụng khác nữa bởi vậy
cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về giá trị của cây me đặc biệt là trong
lĩnh vực dinh dưỡng và dược phẩm [22].
1.2.2. Cấu trúc hóa học của TSP
Theo Joseph và cs. [22] polysaccharide phân lập được từ quả me thuộc
lớp chất xyloglucan, có liên kết -(1-4)-D-glucoside là mạch chính, tại vị trí
C6 là liên kết với -D-xylopyranose và liên kết với -D-galactopyranose-(1-
2)--Dxylopyranose. Chuỗi này đƣợc lập lại nhiều đơn vị theo dạng XXXG,
bao gồm ba nhóm đơn vị bị xylosyl hóa glucopyranose (X) và được phân cách
bằng một glucopyranose (G), và có thể một vài nhóm xylose được liên kết với
galactopyranose (L) theo Hình 1.5.

19. 17
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học xyloglucan của
tamarind seed polysaccharide (TSP)
Gần đây, cấu trúc của TSP được mô tả có dạng heptasaccharide
(Glc4Xyl3, theo kiểu XXXG), octasaccharide (Glc4Xyl3Gal, theo kiểu
XXLG), và monosaccharide (Glc4Xyl3Gal2, theo kiểu XLLG) đã được đề
cập.
Nhiều tính chất của xyloglucan (khả năng tạo gel, độ tan…) phụ thuộc
vào trọng lượng phân tử, một số polysaccharide có trọng lượng phân tử nhỏ
đều có các hoạt tính sinh học quý giá và được sử dụng trong y học.
TSP chiết trong nước có dạng gel và kết tủa trong dung môi hữu cơ,
TSP có trọng lượng phân tử từ 700–2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành
phần hạt me phụ thuộc vào nguồn gốc. TSP được sử dụng để kiểm soát liều
lượng thuốc và không gây bất kỳ phản ứng phụ nào, có thể tạo khuôn với
natri alginate để làm bao cho viên thuốc. Người ta đã tạo dẫn chất sulfate hóa
và cetyl hóa của polysaccharide để làm tăng khả năng chống oxy hóa, kháng
vi sinh vật kiểm định. Gần đây, TSP đã được xác định là chất không gây ung
thư, là chất kết dính có nguồn gốc tự nhiên, và là chất mang có khả năng giữ
thuốc cao [22].

20. 18
1.2.3. Phân lập TSP từ hạt me
TSP có thể được phân lập bằng các kỹ thuật khác nhau thông qua
phương pháp hóa học, phương pháp enzyme sử dụng protease và kết hợp của
protease với siêu âm cường độ cao. Trong phương pháp hóa học, bột hạt
ngâm nước được đun sôi trong nước. Sau đó, chất nhầy được lọc và thêm vào
một lượng acetone bằng nhau để kết tủa polysaccharide, sau đó được cô đặc
và sấy khô. Trong phương pháp enzyme, bột nhân trộn với ethanol được xử lý
bằng protease. Sau đó, dung dịch được ly tâm và phần nổi phía trên được
thêm vào ethanol để kết tủa, sau đó được tách ra và làm khô. Độ tinh khiết
của TSP có thể được xác định bởi sự vắng mặt của protein. TSP có thể biến
tính tạo thành kết tủa không hòa tan, do đó làm cho việc tách TSP trở nên khó
khăn hơn. Vì thế, loại bỏ các protein là mục tiêu chính trong tất cả các các
phương pháp phân lập TSP [22].
1.2.4. Ứng dụng của polysaccharide từ quả me
Polysaccharide chiết xuất từ hạt me đã được biết đến với nhiều hoạt
tính sinh học khác nhau, có thể ứng dụng trong dược phẩm. Ví dụ, hoạt tính
kháng u và kích thích miễn dịch của polysaccharide PST001 được phân lập từ
hạt me (T. indica) đã được Aravind và cs., công bố [23]. Kết quả thu được đã
chỉ ra rằng PST001 ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác
nhau. Hơn nữa, độc tính của PST001, khả năng làm giảm khối u và điều hòa
miễn dịch cũng được đánh giá trong các nghiên cứu in vivo. Các tác giả đã
cho thấy PST001 làm giảm đáng kể khối u và cải thiện mạnh mẽ hoạt động
điều hòa miễn dịch [23]. Hơn nữa, TSP này cũng đã được đánh giá các đặc
tính hóa học, bao gồm độ ẩm, độ tro, pH, hàm lượng khoáng chất, khả năng
giữ nước, tính chất vi lượng, hàm lượng đường tổng số, hàm lượng sulphate,
protein và axit uronic [23]. Ngoài ra, gần đây TSP này cũng được đánh giá về
ảnh hưởng của nó lên quá trình tiêu hóa và lên men in vitro, ảnh hưởng đến
thành phần hệ vi sinh vật đường ruột [24].
Do TSP là một polymerđa chức năng, có nhiều đặc tính lý hóa đặc biệt
như đóng vai trò của chất ổn định, chất làm đặc, chất kết dính, chất làm chậm
giải phóng, chất điều chỉnh chất tạo huyền phù, chất tăng độ nhớt, chất tạo

21. 19
nhũ, như một chất mang trong vận chuyển thuốc mới để uống, uống, ruột kết,
hệ thống mắt, chế tạo nano, băng vết thương, thực phẩm, mỹ phẩm, bánh kẹo,
bánh, v.v. TSP được sử dụng khá rộng rãi trong các ngành công nghiệp dược
phẩm, thực phẩm.
Trong công nghiệp thực phẩm, TSP từ hạt me có thể có các ứng dụng
như là chất làm đặc và chất ổn định, tác nhân gel hóa, chất làm ổn định nước
đá tinh thể và thay thế tinh bột vì tính chất của nó tương tự như tinh bột
nhưng ổn định hơn [22].
Trong y học, TSP được thử nghiệm trong nhãn khoa và có hiệu quả
trong việc thử nghiệm áp lực nội nhãn của sản phẩm nhỏ mắt và đã được thử
nghiệm trên thỏ. TSP đã được thử nghiệm có hiệu quả trong điều trị bệnh về
tiêu hóa và được sử dụng là chất mang của thuốc chữa bệnh đại tràng [22].
Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu tạo dung dịch polysaccharide với tỷ
lệ dung môi khác nhau. Nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa cấu trúc
và hoạt tính sinh học của TSP. Một số polysaccharide có tác dụng tốt trong
nhãn khoa. Gần đây các nghiên cứu đã khẳng định TSP chiết từ hạt me có khả
năng ổn định huyết áp và lipid máu. TSP đã được nghiên cứu và thử nghiệm
trên bệnh nhân cao huyết áp. Ngoài ra, TSP còn làm tăng cường khả năng
chống viêm và làm thuốc giảm đau. Dịch gel của TSP đã đựợc thử nghiệm in
vitro trong việc chống lại hiện tượng đục thủy tinh thể. Hỗn hợp của TSP và
acid hyaluronic là nước mắt nhân tạo được sử dụng cho hội chứng khô mắt.
TSP có thể được sử dụng là thành phần chính tá dược trong thuốc kháng sinh
ưa nước và kị nước. TSP kết hợp với pectin có lượng methoxyl cao (6,8-
8,4%) có khả năng thúc đẩy sự phát triển gel và ổn định nhiệt. Một số kết quả
nghiên cứu TSP và sản phẩm biến tính của TSP đã thể hiện tốt khả năng làm
chất mang cho thuốc và kiểm soát liều lượng nhả thuốc khi sử dụng qua
đường uống [22].
Trong dược phẩm, để phát triển một tá dược mới chất này phải không
có độc tính, có khả năng tương thích và có tính kinh tế. Các đặc tính này được
thể hiện ở polysaccharide, đặc biệt là TSP (Bảng 1.1). Vì thế, TSP là ứng viên

22. 20
đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp dược phẩm và các ngành công nghiệp
thực phẩm.
Bảng 1.1. Các ứng dụng của TSP trong dược phẩm [22]
Ứng dụng Dạng sử dụng Các thuốc đã sử dụng
Chất hòa tan và nhũ hóa
Chất gắn kết
Chất điều biến kiểm soát
nhả
Chất điều biến nhả
thuốc đường uống
Mắt
Chất mang hướng đích
Đại tràng
Hạt nano
Màng bọc vết thương và
làm lành vết thương
Dạng uống
Viên
Hạt composit,
Chất nền matrix,
Viên tan,
Viên ngậm
Dạng gel
Thuốc nhỏ mắt
Viên tan
Viên
Hạt nano
Film
Nimesulfate, Paracetamol
Tramadol HCl, ibuprofen
Diclofenac sodium
Composite beads
Diclofenac sodium
Matrix, Paclitaxel
Ketoprofen, Lamivudine,
Diclofenac sodium
Buccal drug release
modifier, Buccal tablets
Nitrendipine,Metronidazole
Nifedipine,Timolol,
Pilocarpine, Eyedrops
Ketotifene fumarate
Ibuprufen, Pushyanuga
churna, Triphala churna
Tropicamide
Povidoneiodine,
Epichlorohydrin

23. 21
1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về polysaccharide
trên các bệnh xương khớp
Gần đây polysaccharide từ hạt me (TSP) được quan tâm nghiên cứu
nhiều do những tính chất đặc biệt của nó. TSP là một polymer tự nhiên có
trọng lượng phân tử từ 700 – 2500 kDa. TSP chiếm khoảng 65% thành phần
hạt me, phụ thuộc vào nguồn gốc và phương pháp chiết tách [25]. TSP không
tan trong dung môi hữu cơ, phân tán tốt trong nước ấm tạo thành dung dịch có
độ nhớt cao. TSP có các đặc trưng đặc biệt như khả năng tạo gel ở khoảng pH
rộng, không bị ảnh hưởng khi đun sôi, do vậy được sử dụng nhiều trong thực
phẩm [25]. Hơn thế nữa, TSP còn được sử dụng trong phẫu thuật nhãn khoa
để làm chất kết dính các tế bào kết mạc và chữa lành vết thương giác mạc
[26].
Các hợp chất tách chiết từ hạt me cũng đã được chứng minh là có tác
dụng tích cực đối với một số bệnh xương khớp. Nghiên cứu của Sundaram và
cs., [12] đã chứng tỏ hiệu quả chống viêm khớp của dịch chiết hạt me
(tamarind seed extract, TSE). TSE có tính chất bảo vệ sụn và xương bằng
cách ức chế các hoạt động tăng cường của metalloproteinases (MMPs),
hyaluronisases (Haase), exoglycosidases, capthepsis. Nó cũng làm giảm nhẹ
mức tăng các chất trung gian gây viêm như interleukin (IL) - 1β, các nhân tố
hoại tử (tumor necrosis factor) – α, IL-6, IL-23 và cyclooxygenase-2. Nhóm
tác giả kết luận rằng TSE đóng vai trò là một nhân tố ức chế sự thoái hóa sụn,
phân hủy xương và kháng viêm.
Ngoài ra, các hợp chất polysaccharide tự nhiên từ quả me cũng đang
được nghiên cứu theo hướng tạo vật liệu sinh học scaffold ứng dụng trong y
dược. Polysaccharide này đã được nghiên cứu sử dụng trong kỹ nghệ mô
xương. Vật liệu tổng hợp nano hydroxyapatite/chitosan-me (n-HA/CS-TSP)
với tỷ lệ phội hợp khác nhau đã được chế tạo [27] và đã thể hiện các đặc tính
mong muốn cho kỹ nghệ mô xương như: bề mặt xốp và thô, tăng cường độ ổn
định nhiệt và cường độ nén với mô đun cao nhất, tăng cường chức năng sinh
học, phản ứng không độc với tế bào xương MG-63 và có khả năng tương
thích tốt. Các tác giả kết luận rằng vật liệu nano n-HA/CS-TSP có thể là giải

24. 22
pháp thay thế đầy hứa hẹn để ứng dụng trong kỹ nghệ mô xương. Nghiên cứu
của Sanyasi và cs., [13] đã mô tả và xác định một hydrogel mới đóng vai trò
là một vật liệu cho kỹ nghệ mô xương (bone tissue engineering), trong đó
carboxyl methyl tamarind polysaccharide là một polymer bán tổng hợp từ quả
me. Nhóm tác giả đã chứng minh rằng vật liệu này là thích hợp cho sự bám
dính, sự sinh trưởng một cách hiệu quả cho các tế bào tiền tạo xương (bone
precursor cells). Kết quả nghiên cứu còn cho thấy vật liệu hydrogel này không
có bất kỳ độc tính nào và thích hợp cho tế bào người, vì thế nó có tiềm năng
sử dụng trong kỹ nghệ mô xương cũng như là các ứng dụng thương mại trong
tương lai. Gần đây, nhóm nghiên cứu này cũng đã tìm ra một vật liệu mới
được tổng hợp từ polysaccharide có nguồn gốc từ bột quả me (tamarind
kernel polysaccharide -TKP) được gắn với acrylic acid (AA) là TKP-AA. Vật
liệu mới tạo được thích hợp cho việc sinh trưởng và biệt hóa của tế bào xương
cũng như các tế bào khác. TKP-AA cũng thích hợp cho tế bào tạo xương biệt
hóa và kích thích sự khoáng hóa xương in vitro. Ngoài ra, TKP-AA còn có
thể sử dụng cho sự sinh trưởng của tế bào tạo xương có nguồn gốc từ tế bào
gốc trung mô. Nhóm tác giả gợi ý rằng TKP-AA có tiềm năng sử dụng như là
vật liệu sinh học scaffold và đặc biệt là cho kỹ nghệ mô xương với giá thành
thấp [13]. Tuy vậy, tại thời điểm này, nhóm tác giả vẫn chưa đánh giá toàn
diện được tác dụng tái tạo xương của TKP in vitro và in vivo cũng như chưa
đi sâu tìm hiểu cơ chế và đường hướng phân tử mà TKP làm gia tăng sự hình
thành xương. Đây là những dẫn liệu rất quan trọng, giúp làm sáng tỏ cơ chế
tác dụng của TKP đối với quá trình TTX và khẳng định khả năng ứng dụng
của nó.
Cấu trúc phân tử của polysaccharide sẽ điều chỉnh các hoạt động sinh
học của TSP, do đó việc sửa đổi phân tử và cải thiện cấu trúc của
polysaccharide có thể giúp cải thiện các đặc điểm sinh học nội tại của chúng
và thậm chí tạo ra các đặc tính chức năng mới, ưu việt hơn [28, 29]. Sự biến
đổi sulfatecủa polysaccharide giúp tăng cường mạnh mẽ các hoạt tính sinh
học của chúng, ví dụ như chống đông máu, chống oxy hóa, điều hòa miễn
dịch, chống khối u, chống virus và các hoạt động khác [30]. Có thể thấy rằng

25. 23
cho đến nay, các nghiên cứu đầy đủ về tác dụng cảm ứng TTX của TSP cũng
như dẫn suất của nó vẫn chưa được thực hiện.
Tại Việt Nam, cây me được trồng rộng rãi ở nhiều tỉnh từ Bắc Ninh,
Vĩnh Phú tới các tỉnh Tây Nguyên, miền Trung, miền Nam và các Hải đảo.
Quả me được sử dụng chủ yếu làm thực phẩm, nứớc sốt, gia vị... Tuy nhiên,
cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về polysaccharide có nguồn gốc từ quả
me ở Việt Nam được công bố. Nghiên cứu gần đây nhất về TSP là của tác giả
Bùi Ngọc Tân [19,20] đã xác định thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính
sinh học của polysaccharide từ hạt me. Kết quả nghiên cứu cho thấy dẫn xuất
sulfate hóa làm tăng khả năng ly giải cục máu đông, khả năng chống đông tụ
máu và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định còn dẫn xuất acetyl hóa làm
tăng khả năng chống oxy hóa so với mẫu TSP tự nhiên. Như vậy, mặc dù đã
có các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của TSP trong
lĩnh vực kỹ nghệ mô, việc đánh giá hoạt tính tái tạo xương của TSP và các
dẫn xuất của nó một cách chi tiết trên cả mô hình in vitro và in vivo vẫn chưa
được thực hiện.
Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp các dẫn suất
polysaccharide dạng sulfate hóa và lần đầu tiên đánh giá ảnh hưởng của
TSP và TSPS lên sự biệt hóa của tế bào xương in vitro thông qua việc xác
định ảnh hưởng của chúng lên hoạt tính enzyme ALP và sự khoáng hóa
của tế bào tạo xương. Nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm sáng tỏ tác
dụng và tiềm năng ứng dụng của dẫn suất tổng hợp được.

26. 24
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Dựa trên các kết quả điều tra về hàm lượng TSP và hoạt tính sinh học
của quả me ở các vùng nguyên liệu khác nhau, chúng tôi đã thu thập nguyên
liệu quả me từ tỉnh Sơn La cho nghiên cứu này. Mẫu nguyên liệu được TS.
Nguyễn Thị Thanh Hương phân loại và lưu giữ mẫu vật tại Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
- Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống nghiệm, giấy lọc, phễu, pipet, micropipet
10-1000 µl, bình đựng nước cất và các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm.
- Thiết bị: Tủ sấy, máy cô quay chân không, máy lắc voltex, tủ nuôi cấy
tế bào, tủ an toàn sinh học, máy đo pH, máy ly tâm, máy đo phổ cộng hưởng
từ hạt nhân NMR.
2.1.3. Hóa chất
- Tế bào tiền tạo xương osteoblast MC3T3-E1 được mua từ hãng Sigma
(Hoa Kỳ).
- Enzyme alkaline phosphatase (ALP), một chỉ thị đặc trung cho sự tạo
xương và chất nhuộm Alizarin red S (dẫn xuất anthraquinone) để đánh giá sự
hình thành canxi được mua từ hãng Sigma (Hoa Kỳ).
- Các môi trường nuôi cấy tế bào được mua từ hãng Invitrogen (Hoa
Kỳ).
- Pullulan, chất chuẩn polysaccharide được mua từ hãng Sigma (Hoa
Kỳ).
- Các hóa chất còn lại đạt mức độ tinh sạch phân tích.

27. 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Chiết tách TSP từ hạt me
Quả me sau khi thu hái được rửa sạch chất bẩn dưới vòi nước rồi sấy ở
60o
C – 70o
C trong 48 giờ, sau đó vỏ quả được loại bỏ và tách riêng phần hạt
me và thịt me. Phần hạt me được tách bỏ vỏ cứng sau đó được nghiền nhỏ và
giữ trong bình hút ẩm. Việc tách chiết TSP từ hạt me được thực hiện theo quy
trình của Deveswaran và cs., [26]. Cụ thể như sau: mẫu bột me (20 g) được
hòa trong 200 mL nước cất và khuấy đều, sau đó thêm 800 mL nước sôi.
Dung dịch được đun sôi trong 20 phút và để qua đêm để loại bỏ protein và
phần sợi, sau đó ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút. Phần cặn không
tan được loại bỏ và thu lại phần dịch trên tủa. Dịch ly tâm được cất quay loại
dung môi, thêm hai phần thể tích ethanol vào dịch cô quay (vừa bổ sung vừa
khuấy) để thu được TSP. Mẫu sau khi chiết tách được loại bỏ protein theo
phương pháp của Oliveira và cs., [31]. Để tinh sạch thêm TSP, màng thẩm
tách đã được sử dụng. TSP thu được sau thẩm tách được sử dụng để điều chế
các dẫn xuất sulphate.
2.2.2. Tổng hợp dẫn xuất sulfate hóa của TSP (TSPS)
Dẫn xuất sulfate của TSP (TSPS) được điều chế theo phương pháp của
Fan và cs., [32] và Chen và cs., [33]. Quá trình này được thực hiện theo 04
bước như sau:
i - Tạo tác nhân sulfatehóa: Phản ứng hóa học tạo tác nhân sulfate hóa được
tiến hành theo phương trình:
4NaHSO3 + NaNO2 (NaSO3)3N + Na2SO3 + 2H2O
ii – Thực hiện phản ứng: Tác nhân sulfate hóa được điều chỉnh pH bằng natri
hydroxide, sau đó thêm dung dịch TSP (1.5g TSP hòa trong 30mL nước) và
khuấy mạnh, phản ứng được thực hiện tại 50o
C trong 4 giờ.
iii – Thu nhận dẫn suất sulfate: Hỗn hợp được cất loại bỏ dung môi, kết tinh
lại và rửa nhiều lần bằng ethanol. TSPS sau đó được sấy khô tại 40o
C trong
48 giờ.

28. 26
iv - Điều chế các dẫn xuất sulfate hóa có mức độ sulfatekhác nhau: dựa theo
phản ứng giữa TSP với tác nhân sulfatecó tỷ lệ số mol của NaHSO3 và
NaNO2 khác nhau để thu được các mẫu TSPS có mức độ sulfatehóa khác
nhau.
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc
2.2.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR)
Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) là phương pháp vật lý được sử
dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic
polysaccharide nói riêng. Phương pháp này cung cấp những thông tin về cấu
trúc quan trọng để xác định kiểu nhóm chức trong phân tử polysaccharide.

29. 27
Bảng 2.1. Một số nhóm đặc trưng và băng sóng hấp thụ trong phổ FT-IR
của polysaccharide
Phổ FT-IR đã được áp dụng thành công để phân tích các
polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất
polysaccharide từ rong biển. Bảng 2.1 đưa ra các nhóm đặc trưng và băng
sóng hấp thụ trong phổ FT-IR của polysaccharide.
Trong thí nghiệm này, mẫu TSP và dẫn xuất TSPS được ép viên với
KBr theo tỷ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR được đo trên
máy Nicolet iS50 FTIR (Thermo Scientific) trong vùng dải sóng 4000-400
cm-1
.

30. 28
2.2.3.2. Phương pháp phổ NMR
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để
nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide. Trong phương pháp nghiên cứu cấu
trúc của polysaccharide thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng.
Trong một số trường hợp phổ 1H-NMR còn dùng để định lượng
polysaccharide có trong mẫu phân tích Phổ NMR được thể hiện bằng độ
chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Đặc trưng
phổ 1H- NMR và 13C-NMR của glucan được thể hiện trong Hình 2.1. Trong
phổ 1H- NMR tất cả độ dịch chuyển hóa học của carbohydrate bao gồm
mono-, oligo-, và polysaccharide có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6 ppm trong
chất nội chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học proton anomer của mỗi
monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình  hay . Ví
dụ như với protonanomer sẽ xuất hiện tại δ 5–6 ppm trong khi đó với
proton - anomer là tại vùng δ 4–5 ppm. Phổ 13C-NMR thường có tín hiệu
yếu hơn nhưng có những lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu
trúc polysaccharide vì độ dịch chuyển hóa học trong phổ 13C-NMR được trải
rộng trên thang đo (Hình 2.1). Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C-NMR
đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H-NMR. Trên phổ 13C-
NMR các tín hiệu carbon anomer xuất hiện tại vùng δ 90–110 ppm trong khi
đó các tín hiệu của carbon không ở vị trí anomer xuất hiện tại δ 60 và 85 ppm.
Với polysaccharide có nhóm deoxy như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại
vùng trường cao hơn (15–20 ppm). Với hai loại proton anomer, tín hiệu của
carbon-anomer xuất hiện tại δ 95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết
carbon-anomer xuất hiện tại δ 100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa
nhóm acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện
tại δ 170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl
như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ
60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2
có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2, 3 trong furanose) sẽ
xuất hiện tại vùng 65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong
pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía

31. 29
trường yếu 5–10 ppm. Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharide
chưa xác định ngay được cấu trúc mà cần được so sánh với các giá trị của phổ
đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc dùng phổ 2D-NMR và một số kỹ
thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharide.
Tuy nhiên, có sự xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton
trong quá trình định lượng polysaccharide. Do vậy phổ 13C-NMR với kỹ
thuật đo đặc biệt cũng có thể dùng để định lượng polysaccharide vì các tín
hiệu của carbon anomer được tách riêng trong phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton (1H-NMR) của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết
của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay
lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các cộng hưởng
proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4 đến 5,8 ppm. Như
vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của tín hiệu các cộng hưởng proton
anomer ta cũng có thể đánh giá tỷ lệ của các monosaccharide. Về mặt này kết
quả phân tích hoá học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H-NMR. Nhìn
chung, kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hoá
học.

32. 30
Hình 2.1. Phổ NMR của -D-glucan. a) Phổ 1H-NMR của (13) và (14)
-D-glucan; b) Phổ 13C-NMR của (13) và (14) -D-glucan
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được
dự đoán vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng
chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào
việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC. Từ
các thông số độ chuyển dịch hóa học của C1, H1 thông qua phổ tương tác dị
hạt nhân 1H – 13C HSQC có thể đưa ra được cấu trúc hóa học cơ bản của
monosaccharide (Bảng 2.2).

33. 31
Bảng 2.2. Độ chuyển dịch hoá học δ(ppm) từ cơ sở dữ liệu sugabase của
dạng glucose,galactose và xylose dung môi D2O
Các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon tương
ứng với các nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết
glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh
(> 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học
của các monomer không thế. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin
giống với những phân tích khi methyl hoá. Trật tự các monomer trong mạch
polysaccaride được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện
thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và
NOESY.
Trong thí nghiệm ở đây, việc chuẩn bị mẫu được thực hiện bằng cách
hòa tan 5 mg polysaccharide tinh khiết đông khô trong 600 μL nước
deuterium (D2O). Dung dịch được khuấy trong 2 giờ ở 40°C và sau đó đông
khô. Quá trình này được lặp lại hai lần. Phổ 1H NMR của TSP và TSPS trong
D2O được ghi lại trên máy đo phổ Bruker Avance 500 MHz (Bruker Biospin,
Đức) sử dụng TMS (tetramethyl silane) làm chất nội chuẩn. Sự thay đổi hóa

34. 32
học được biểu thị bằng ppm. Phân tích được thực hiện tại Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3.3. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để
phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột.
GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm trọng
lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc trưng cơ
bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của nó. GPC
được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymertổng hợp hay
các polymertự nhiên như polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự
phân bố trọng lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức
tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer, và các
chất phụ gia. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC được đưa ra trên sơ đồ
hình 2.2.
Hình 2.2. Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC
Trọng lượng phân tử trung bình của dẫn xuất TSP được xác định bằng
hệ thống sắc ký GPC P100 (Aligent technologies, Hoa Kỳ) với dòng chảy duy
trì 1mL/phút, pha động là NaNO3 0.1N, sử dụng detector RI, cột đo TSK
G3000-PW, nồng độ mẫu TSP là 0.001 mg/mL, nhiệt độ là 30o
C. Các dữ liệu

35. 33
được xử lý bằng phần mềm Jiangshen Workstation. Phân tích được thực hiện
tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp xác định hình thái bề mặt TSP dưới kính hiển
vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM), là
một loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt
mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét
trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi
nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt
mẫu vật. Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống như việc tạo ra
chùm điện tử trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử được phát ra
từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trường...), sau đó
được tăng tốc. Tuy nhiên, thế tăng tốc của SEM thường chỉ từ 10 kV đến 50
kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bước sóng
quá nhỏ vào một điểm kích thước nhỏ sẽ rất khó khăn. Điện tử được phát ra,
tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài
nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các
cuộn quét tĩnh điện. Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm
điện tử hội tụ. Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn phụ thuộc vào tương tác
giữa vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử. Khi điện tử tương tác với bề mặt
mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân
tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này.
Trong thí nghiệm này, hình thái bề mặt của TSP và TSPS được xác
định bằng phương pháp đo dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao
(FE-SEM, Hitachi-S4800, Japan). Phân tích được thực hiện tại Viện Khoa học
Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.5. Phương pháp đo mức độ sulfate hóa
Hàm lượng S được xác định trực tiếp bằng phương pháp cảm ứng
ghép Plasma - Quang phổ phát xạ quang học (ICP-OES) sử dụng máy đo
Perkin Elmer Optima 2000 (Anh Quốc). Thí nghiệm được thực hiện tại Đại

36. 34
học Khoa học và Công nghệ, Hà Nội. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp
này là sự kích hoạt các nguyên tử S trong plasma Ar và định lượng phổ phát
xạ thu được ở một bước sóng đặc trưng. Cường độ của phổ phát xạ S là hàm
trực tiếp của nồng độ S trong dung dịch, không phụ thuộc vào loại hợp chất
chứa S và trạng thái oxi hóa của nguyên tử S được phân tích. Phương pháp
ICP-OES đã được sử dụng thành công để phân tích S trong mô thực vật sau
quá trình phân hủy và oxy hóa mẫu với các hỗn hợp axit và chất oxy hóa khác
nhau. Nó cũng phải phù hợp để xác định các hợp chất hữu cơ S, nếu loại trừ
các ảnh hưởng của chất nền và nhiễu. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả
các mẫu được phân tích mà không cần tiền xử lý bằng thiết bị Perkin Elmer
Optima 2000 (Anh Quốc) ở vạch phát xạ S  = 180,669 nm trong hai lần xác
định lặp lại. Mức độ sulfatehóa (DS) được tính theo công thức sau:
DS = 2.25 x S (%)/C (%)
2.2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học
2.2.6.1. Nuôi cấy và biệt hóa tế bào tiền tạo xương
Dòng tế bào tiền tạo xương MC3T3-E1 (Sigma, Hoa Kỳ) được sử dụng
trong các thí nghiệm in vitro để đánh giá khả năng tạo xương của chất nghiên
cứu. Tế bào MC3T3-E1 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10%
FBS (fetal bovine serum) trong bể ủ nhiệt 37o
C và CO2 5%. Sự biệt hóa tế bào
được thực hiện trong môi trường osteogenic differentiation medium (ODM)
bao gồm DMEM chứa FBS 5%, penicillin-streptomycin 1%, ascorbic acid
100 µg/mL, dexamethasone 10 nM và β- glycerophosphate10 mM.
2.2.6.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
Khả năng sống sót của tế bào được đánh giá bằng phương pháp MTT.
Nguyên tắc của phương pháp này là đánh giá hoạt động trao đổi chất của tế
bào sống thông qua hoạt động của enzyme oxidoreductase phụ thuộc
NADPH. Enzyme này sẽ khử thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

37. 35
diphenyltetrazolium bromide (MTT) có màu vàng thành sản phẩm formazan
có màu tím và không tan. Giá trị OD đo được của formazan sau khi hòa tan
trong dung môi thích hợp sẽ phản ánh mức độ hoạt động của enzyme, tương
ứng với độ sống sót của tế bào. Cụ thể, tế bào được nuôi cấy lặp lại 3 lần
trong đĩa 96 giếng ở mật độ 5×103
tế bào/giếng và bổ sung các hàm lượng
khác nhau của các chất cần nghiên cứu (dẫn xuất TSP), hoặc không bổ sung
những chất này để làm mẫu đối chứng. Sau khi ủ 24 giờ, tế bào được rửa lại
và thêm vào 100 µl MTT (1 mg/mL) và ủ tiếp trong 4 giờ. Cuối cùng, DMSO
(150 µL) được thêm vào và đo OD ở 540 nm. Khả năng sống sót của tế bào
được so sánh ở các giếng có bổ sung các nồng độ khác nhau của chất quan
tâm so với mẫu không có bổ sung chất quan tâm. Từ kết quả MTT sẽ lựa chọn
được nồng độ chất thích hợp mà không làm ảnh hưởng đến sự sống sót của tế
bào cho các nghiên cứu in vitro tiếp theo để đánh giá ảnh hưởng của chất
quan tâm đến sự biệt hóa tế bào tạo xương [34].
2.2.6.3. Đánh giá hoạt tính enzyme alkaline phosphatase (ALP)
Hoạt tính enzyme ALP được đánh giá theo phương pháp được mô tả bởi
Nguyen et al [34]. Để đánh giá hoạt tính ALP, tế bào MC3T3-E1 được nuôi
cấy trong đĩa 24 giếng trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS. Môi
trường nuôi cấy sau đó được thay thế bằng môi trường DMEM mới có bổ
sung chất nghiên cứu, hoặc không bổ sung những chất này để làm đối chứng
và ủ trong 48 giờ. Sau đó, tế bào được rửa với đệm PBS kết hợp với đệm
carbonate buffer (pH 10.3) 25 mM có chứa 0.1% Triton X-100. Tiếp đó, tế
bào được ủ trong 1 giờ ở 37o
C với đệm carbonate 250 mM có chứa 1.5 mM
MgCl2 và 15 mM p-NPP. Với sự hiện diện của ALP, chất p-NPP sẽ được
chuyển đổi thành para-nitrophenol (có màu vàng) và inorganic phosphate. Sau
đó, hoạt tính ALP trong các mẫu được đo ở bước sóng 405 nm bằng máy đo
quang phổ. Hoạt tính ALP được tính toán dựa theo công thức sau:
𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝐴𝐿𝑃 (%) =
𝐴 − 𝐴𝑜
𝐴𝑜
𝑥 100%
Trong đó: - A là độ hấp thụ của tế bào được bổ sung chất nghiên cứu,
- Ao là độ hấp thụ của tế bào không được bổ sung chất nghiên cứu

38. 36
2.2.6.4. Đánh giá hoạt tính khoáng hóa xương
Hoạt tính khoáng hóa của tế bào được đánh giá theo phương pháp được
mô tả bởi Nguyen et al., [34]. Mức độ khoáng hóa được xác định bằng cách
nhuộm tế bào với alizarin red-S trong đĩa 6 giếng. Tế bào được nuôi cấy trong
môi trường DMEM có chứa vitamin C (50 µg/mL) và β-glycerolphosphate
(10 mM) trong 2 tuần cùng với nồng độ thích hợp của chất cần nghiên cứu,
hoặc không bổ sung chất nghiên cứu để làm đối chứng. Sau đó, tế bào được
rửa hai lần với PBS, cố định trong cồn lạnh đá 70% (v/v) trong 1 giờ và được
làm khô trong không khí. Dung dịch ethanol 100% được dùng để cố định tế
bào và chất nền được nhuộm với alizarin red-S 40 mM (pH 4,2) trong 1 giờ
và được rửa kỹ với nước. Tiếp theo, tế bào được rửa trong 15 phút với
cetylpyridium chloride 10% được pha trong 10 mM đệm phosphate natri (pH
7.0). Sự nhuộm màu của tế bào thể hiện mức độ khoáng hóa và mật độ quang
học được đo ở 562 nm để xác định mức độ nhuộm màu của tế bào trong các
mẫu nghiên cứu và đối chứng. Hoạt tính khoáng hóa xương được tính toán
dựa theo công thức dưới đây:
𝐻𝑜ạ𝑡 𝑡í𝑛ℎ 𝑘ℎ𝑜á𝑛𝑔 ℎó𝑎 (%) =
𝐴 − 𝐴𝑜
𝐴𝑜
𝑥 100%
Trong đó: - A là độ hấp thụ của tế bào được bổ sung chất nghiên cứu,
- Ao là độ hấp thụ của tế bào không được bổ sung chất nghiên cứu.
2.2.7. Xử lý thống kê
Các số liệu được phân tích thống kê sử dụng t-test hoặc ANOVA khi so
sánh nhiều mẫu với P < 0,05.

39. 37
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. TINH SẠCH TSP TỪ HẠT ME
Bột hạt me khô xay (20 g) được hòa với nước cất (1000 mL) sau đó
được khuấy và đun nóng ở 100°C trong 20 phút. Dung dịch huyền phù sau đó
được làm nguội đến nhiệt độ phòng, để qua đêm để loại bỏ protein và chất xơ
rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu phần hòa
tan và loại bỏ phần cặn không hòa tan. Trong bước tiếp theo, dung dịch hòa
tan được cất cô quay để thu cặn và sau đó cho thêm hai thể tích ethanol để thu
được polysaccharide hạt me (TSP). Các mẫu TSP thu được sẽ được tinh sạch
bằng túi thẩm tách SnakeSkin để thu được TSP có độ tinh khiết cao (Hình
3.1). Sơ đồ quá trình thu nhận TSP được trình bày ở hình 3.2 với hiệu suất đạt
13,4%.
A B
Hình 3.1. Sản phẩm TSP từ hạt me. A) Bột hạt me đun trong nước trong 20
phút; B) TSP thu được sau khi kết tủa trong ethanol và lọc qua rây (kích
thước 0.125 mm).

40. 38
Hình 3.2. Sơ đồ quá trình thu nhận TSP từ hạt me
3.2. TỔNG HỢP CÁC DẪN SUẤT SULFATE CỦA TSP
3.2.1. Tổng hợp dẫn suất TSPS
Quá trình sulfatehóa polysaccharide của hạt me được thực hiện theo
phản ứng như mô tả của Fan và cs., [32] và Chen và cs., [33]. Sơ đồ phản ứng
được minh họa trong Hình 3.3.
Bột nguyên liệu
Ly tâm 5000 rpm/20 phút
Dịch huyền phù
Dịch trên tủa
Thêm nước, đun ở 100
o
C, 20 phút
Tủa ethanol
Tủa ethanol
TSP
Thẩm tích trong nước cất

41. 39
Hình 3.3. Phản ứng tổng hợp TSPS từ TSP của hạt me (Fan và cs., [32]
Sơ đồ quá trình thu nhận TSP được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ quá trình thu nhận TSPS từ hạt me
Trong thí nghiệm này, dung dịch Na2NO3 5% được thêm vào dung dịch
NaHSO3 đã chuẩn bị trước trong nước cất. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng
Bột TSP Tác nhân sulphate hóa
TSPS thô
50
o
C, 20 phút,
Cô quay thu chất khô
TSPS tinh sạch
Rửa ethanol lặp lại,
Sấy ở 40o
C trong 48 giờ

42. 40
ở 90°C trong 90 phút và được trung hòa bằng NaOH 15% đến pH 9.0 để tạo
tác nhân sulphat hóa. Sau đó, bột khô nguyên liệu hạt me (1 g) được thêm vào
dung dịch tác nhân sulphat hóa này. Hỗn hợp phản ứng được làm ấm đến
50°C trong 4 giờ và ethanol (40 mL) được thêm vào hỗn hợp để tạo kết tủa.
Kết tủa sau đó được thu lại bằng cách lọc qua màng lọc. Dung dịch tủa được
thẩm tách và được làm đông khô để thu được TSPS của hạt me đã được
sulfate hóa. Hiệu suất chuyển hóa từ TSP sang TSPS của quy trình đạt 86,5%.
3.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của dẫn suất TSPS
TSP được cấu tạo bởi các đơn vị đường, bao gồm α-D-xylopyranose, β-
D-galactopyranose và glucose, được liên kết thông qua liên kết glycosidic để
tạo thành polymerphân nhánh [35]. Phổ 1
H-NMR của TSP và TSPS (Hình
3.5) cho thấy xuất hiện một vùng tín hiệu dày đặc giữa δ 3,00 ppm đến δ 5,00
ppm là đặc trưng của polysaccharide, điều này xác nhận sự hiện diện của
nhiều gốc đường tương tự.
Kết quả thu được trong hình 3.6 cho thấy có các proton α-anomeric ở
vùng 5–5,6 ppm và các proton vòng ở vùng 3,4–4,4. Các tín hiệu giữa δ 3,90–
3,50 ppm tương ứng với các nhóm CH2 của arabinose. Các tín hiệu proton của
các đơn vị đường trong khoảng  4,32-3,80 ppm góp phần tạo ra các nhóm
methine oxy hóa của phân tử đường. Các tín hiệu đơn lẻ dịch chuyển ở  5,53
ppm, 5,33 ppm và 4,95 ppm được cho là các proton α-anomeric và β-
anomeric. Phân tích 1
H-NMR này phù hợp với dữ liệu được công bố bởi
Chawananorasest và cs., [35] So với phổ 1
H NMR của TSP, các tín hiệu
proton của TSPS đã bị dịch chuyển một chút về mặt hóa học sang trường cao
hơn trong NMR. Đây có thể là do ảnh hưởng của quá trình sulfatehóa TSP

43. 41
Hình 3.5. Phổ 1
H-NMR của TSPS và TSP trong D2O.
.
3.2.3. Hình thái bề mặt của TSP và TSPS
Hình ảnh SEM về hình thái bề mặt của TSP và TSPS trong hình 3.6.
Hình ảnh thu được cho thấy TSP có bề mặt nhẵn và kín, trong khi TSPS có bề
mặt tương đối xốp và thô. Điều này chỉ ra rằng sự kết hợp của các nhóm
sulfate đã tạo ra ảnh hưởng đáng chú ý đến hình thái bề mặt của TSPS. Hơn
nữa, bề mặt thô và xốp của mẫu TSPS có thể thúc đẩy sự kết dính của tế bào,
sự gắn kết của tế bào, sự phát triển của mô và cung cấp chất dinh dưỡng cho
vị trí tái tạo mô [ 27]. Do đó, việc gắn thêm các nhóm sulfate trong TSPS dẫn

44. 42
đến bề mặt thô và xốp và có thể đã giúp làm tăng các hoạt động sinh học của
TSPS so với TSP.
Hình 3.6. Hình thái bề mặt của TSP và TSPS dưới kính hiển vi điện tử quét
(SEM). TSP (A, B) và TSPS (C, D). A and C: Hình ảnh SEM images ở độ
phóng đại 3 kx. C and D: Hình ảnh SEM images ở độ phóng đại 30 kx.
3.2.4. Phổ hồng ngoại (FT-IR) của TSP và TSPS
Phổ FT-IR được sử dụng để nghiên cứu dao động của các phân tử và liên
kết phân cực giữa các nguyên tử khác nhau. Số liệu trong Hình 3.7 cho thấy

45. 43
rằng phổ FT-IR của TSP và TSPS đã hiển thị các đỉnh trong vùng 3447 và
3436 cm-1
, tương ứng với dao động kéo dài hydroxyl của các mẫu
polysaccharide. Bên cạnh đó, các đỉnh hấp thụ cụ thể của sulfat được tìm thấy
trong TSPS, nhưng không được tìm thấy trong mẫu TSP. Chúng bao gồm sự
xuất hiện của các cực đại ở 1260 cm-1
, tương ứng với sự kéo dài S = O và ở
873 cm-1
, biểu thị một dao động C-S-O đối xứng liên kết với một nhóm C-O-
SO3. Những phân tích này đã khẳng định sự thành công của quá trình sulfate
hóa TSP.
Hình 3.7. Phổ FT-IR của TSP và TSPS.
3.2.5. Xác định mức độ sulfate hóa của TSPS
Một trong những phương pháp tin cậy để xác định lượng sulfate có mặt
là phân tích nguyên tố. Với phương pháp này, lượng sulfate trung bình trên
mỗi khối lượng của polymerhoặc phân tử nhỏ có thể được xác định. Nếu
người ta biết khối lượng phân tử của polyme, thì lượng sulfate trung bình của
mỗi monome được ước tính bằng mức độ %. Mức độ DS được xác định bằng

46. 44
phương trình chuyển đổi phần trăm hàm lượng sulfate (S%) sang mức độ thay
thế (DS) là đại diện cho số lượng sulfate trung bình trên dư lượng monomer
được sử dụng. Kết quả về DS của TSPS và TSP được trình bày trong Bảng
3.1.
Bảng 3.1. Mức độ sulfatehóa của TSPS
Mẫu S (%) DS (%)
TSPS 4.86 ± 1.14 0.31 ± 0.06
TSP 0.3 ± 0.15 ND
(Số liệu được trình bày là giá trị trung bình của ba phép xác định độc lập
được lặp lại. ND: Không phát hiện)
Mặc dù phương pháp này không xác định được (các) vị trí của (các)
nhóm sulfate hoặc số lượng chính xác các sulfate có trong mỗi đơn phân, dữ
liệu thu được đã cho thấy TSPS được tổng hợp thành công với DS là 0,31 ±
0,06, trong khi DS của TSP không thể phát hiện được. Kết quả này phù hợp
với các dữ liệu được báo cáo bởi Xie và cs., [28].
3.2.6. Xác định khối lượng phân tử (Mw) của TSP và TSPS
Khối lượng phân tử (Mw) của TSP và TSPS được xác định bằng cách
sử dụng sắc ký thấm gel hiệu năng cao (HPGPC). Dung dịch mẫu (20 μL)
được bơm vào HPGPC trong mỗi lần chạy với hệ thống Agilent 1260 HPLC
(Agilent, Hoa Kỳ). Pullulan được sử dụng làm chất chuẩn và Mw của TSP và
TSPS được ước tính dựa trên phương trình của đường chuẩn.
Kết quả thu được ở Hình 3.8 cho thấy Mw của TSP và TSPS ước tính
lần lượt là 1,37 x 106
và 1,34 x 106
. Kết quả của chúng tôi tương tự với Mw

47. 45
của polysaccharide tự nhiên và phù hợp với dữ liệu của Xie và cs., [34] đã
báo cáo trước đó.
Hình 3.8. Phổ GPC của TSPS và TSP sử dụng chất chuẩn là pullulan.
3.3. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CẢM ỨNG GIA TĂNG SỰ HÌNH THÀNH
XƯƠNG CỦA DẪN SUẤT TSPS
Sự biến đổi sulfate của polysaccharide được cho là giúp tăng cường mạnh
mẽ các hoạt tính sinh học của chúng [29, 30]. Hiện tại chưa có các nghiên cứu
đầy đủ về tác dụng cảm ứng TTX của TSP cũng như dẫn suất sulfate của nó.
Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá ảnh hưởng của TSP và
TSPS lên sự biệt hóa của tế bào xương in vitro thông qua việc xác định ảnh
hưởng của chúng lên hoạt tính enzyme ALP và sự khoáng hóa của tế bào tạo

48. 46
xương là hai chỉ thị quan trọng cho giai đoạn sớm và muộn của quá trình biệt
hóa của tế bào xương.
3.3.1. Đánh giá độc tính của TSPS lên dòng tế bào tạo xương
osteoblast
Tác dụng gây độc tế bào của các nồng độ TSP và TSPS khác nhau trên
tế bào tiền nguyên bào MC3T3-E1 được xác định bằng phương pháp MTT.
Số liệu ở hình 3.10 cho thấy là cả TSP và TSPS đều không gây độc đối với sự
tăng sinh của tế bào MC3T3-E1 ở nồng độ thử nghiệm trong 3 ngày nuôi cấy.
Không những thế, cả TSP và TSPS đều làm tăng khả năng sống của tế bào
sau khi xử lý (Hình 3.9) (P>0,05). Do đó, nồng độ của các mẫu nằm trong
khoảng từ 5 - 40 µg/mL đã được chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các thí
nghiệm tiếp theo.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của TSP và TSPS lên khả năng tăng sinh của tế bào
MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu. Kết quả
trình bày là giá trị trung bình ± SD.

49. 47
3.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của TSPS lên hoạt tính enzyme ALP
Sự biệt hóa của tế bào xương (nguyên bào xương) có thể được xác định
trong ba giai đoạn gồm: i) giai đoạn tăng sinh tế bào; ii) giai đoạn chất nền
trưởng thành; và iii) giai đoạn khoáng hóa. Trong quá trình tăng sinh tế bào
và giai đoạn trưởng thành chất nền, hoạt tính của enzyme phosphatase kiềm
(ALP) được thể hiện rất mạnh. Do đó, hoạt tính ALP có thể được sử dụng như
một chỉ thị để xác định xem liệu việc xử lý mẫu có thể tạo ra sự biệt hóa tế
bào nguyên bào xương hay không. Kết quả hiển thị trong Hình 3.10 chỉ ra
rằng TSPS có thể gây tăng hoạt tính ALP một cách có ý nghĩa thống kê sau 5
ngày xử lý ở nồng độ 20 µg/mL và 40 µg/mL. Ở các nồng độ 5 và 10 µg/mL,
TSPS không có ảnh hưởng đến hoạt tính củe enzyme này (Hình 3.10).
Hình 3.10. Ảnh hưởng của TSP và TSPS lên hoạt tính ALP của tế bào
MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu; Kết quả
trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; * p ≤ 0.05.
Hoạt tính ALP tăng khoảng 20% và 27% lần lượt ở các nồng độ 20 và

50. 48
40 µg/mL, trong khi đó, xử lý TSP đã không làm tăng hoạt tính ALP của tế
bào xương ở tất cả các nồng độ đã thử nghiệm sau 5 ngày (P<0,05). Do đó có
thể kết luận rằng dẫn xuất sulfatecủa TSP có hoạt tính cảm ứng TTX.
3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng của TSPS lên hoạt tính khoáng hóa của
tế bào tạo xương
Quá trình khoáng hóa xương là quá trình mà mô hữu cơ trở nên cứng
bởi sự lắng đọng sinh lý của muối canxi, được gọi là giai đoạn cuối của quá
trình biệt hóa nguyên bào xương. Trong nghiên cứu này, độ khoáng hóa của tế
bào xương được đo bằng phương pháp nhuộm alizarin red S của tế bào nuôi
cấy khi xử lý với TSP và TSPS và sau đó định lượng hàm lượng canxi bằng
mật độ quang học.
Hình 3.11. Ảnh hưởng của TSPS và TSP lên hoạt tính khoáng hóa xương của
tế bào MC3T3-E1. Control: mẫu đối chứng không bổ sung chất nghiên cứu;
kết quả trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn; * p ≤ 0.05, ** p ≤
0.01.

51. 49
Kết quả thu được trong Hình 3.11 và 3.12 cho thấy rằng TSPS đã giúp
sự khoáng hóa của tế bào xương diễn ra mạnh mẽ hơn sau 4 tuần nuôi cấy so
với các tế bào không được xử lý. Kết quả cũng chỉ ra rằng các tín hiệu khoáng
hóa ở các mẫu thí nghiệm xử lý với TSP là tương tự với nhóm không được xử
lý sau 4 tuần. Trong khi đó, xử lý tế bào với TSPS đã đẩy nhanh quá trình
khoáng hóa ở tất cả các nồng độ được thử nghiệm. Cụ thể là sự khoáng hóa
trong các tế bào MC3T3-E1 sau khi xử lý bằng TSPS ở các nồng độ 10, 20 và
40 μg/mL đã tăng lên lần lượt là 51,7%, 57,6% và 62,8% sau 4 tuần xử lý.
Hình 3.12. Hình ảnh nhuộm tế bào osteoblast MC3T3-E1 hình thành khoáng
hóa khi có mặt của TSPS. Tế bào được nhuộm alizarin Red-S trong 4 tuần sau
khi xử lý mẫu. Quá trình hình thành khoáng hóa được tăng lên một cách phụ
thuộc vào liều lượng. Mỗi giá trị là giá trị trung bình của các mẫu cấy ba lần
và mỗi vạch chỉ ra trung bình ± S.D. * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01.
Tác dụng ức chế loãng xương của polysaccharide từ một số nguồn tự
nhiên cũng đã được công bố. Ví dụ như polysaccharide từ cây Achyranthes
bidentata Blume, một cây thuốc được trồng phổ biến ở Trung Quốc và các
nước châu Á, có nhiều đặc tính dược lý, chẳng hạn như chống HIV, chống lão
hóa, chống stress oxy hóa và có hoạt tính bảo vệ xương [36]. Các tác giả đã
chứng minh rằng các polysaccharide của A. bidentata có tiềm năng đặc biệt
Đối chứng

52. 50
trong việc phòng và điều trị loãng xương thông qua việc tăng cường vi kiến
trúc xương và rút ngắn giai đoạn giai đoạn các dấu ấn sinh học chuyển hóa
xương, thúc đẩy sự biệt hóa của các tế bào tạo xương MC3T3-E1 thông qua
việc tăng sinh tế bào, tăng hoạt động ALP, tăng sự khoáng hóa và tăng sự
biểu hiện của một số gene đánh dấu liên quan đến quá trình hình thành xương
như Osx, Ocn và Bsp [36]. Nghiên cứu của Ou và cs., [37] cũng chỉ ra rằng
polysaccharide của Astragalus membranaceus (APS) có thể ức chế chứng
loãng xương ở chuột bằng cách tăng khối lượng xương và hàm lượng canxi
trong máu, cải thiện stress oxy hóa. Kết quả này có thể là do ảnh hưởng của
APS đối con đường tín hiệu FoxO3/Wnt2.
Như vậy, ác số liệu thu được trong nghiên cứu này bước đầu đã chỉ ra
rằng quá trình sulfatehóa TSP đã giúp làm tăng cường cả hoạt tỉnh ALP và
khả năng khoáng hóa xương của tế bào ở các nồng độ thấp là 10, 20 và 40
μg/mL so với TSP (P<0.05), tức là có thể kích thích sự biệt hóa tế bào tạo
xương ở cả giai đoạn đầu và giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa. Các kết quả
thu được là những số liệu mới về hoạt tính cảm ứng tái tạo xương của TSPS,
gợi ý dẫn suất này có tiềm năng ứng dụng trong trị liệu các bệnh về xương.
Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn để tìm ra cơ chế phân tử, các con đường
phân tử liên quan đến sự cảm ứng hình thành xương cũng như các thí nghiệm
đánh giá hoạt tính trên các mô hình in vivo là cần thiết để khẳng định tiềm
năng của TSPS cho các ứng dụng trị liệu.