Predavanje za laboratorijske tehničare

1. Kvantiferon test u reumatologiji
Miloš Stefanović, laboratorijski tehničar

2. IGRA (Interferon-γ release assays) testovi
2001. god. FDA agencija (uprava za hranu i lekove) odobrila je
komercijalne testove za imunodijagnostiku TB koji se izvode in vitro u
uzorcima krvi.
Postoje dve generacije komercijalnih ELISA testova:
●
QuantiFERON TB Gold test
●
T-SPOT.TB (ELISPOT),
enzimski imunospot test

3. Princip QuantiFERON TB Gold testa
● Q-TB Gold test meri stvaranje IFN-γ nakon inkubiranja ispitivanog uzorka (16-
24h) sa kompleksom specifičnih antigena M.tuberculosis.
● Ovaj test meri koncentraciju solubilnog IFN-γ u 1 ml pune krvi.

4. Imunodijagnostika aktivne tuberkuloze (TB) i
latentne tuberkulozne infekcije (LTB)
●
Pod aktivnom tuberkulozom (TB) se podrazumeva infekcija izazvana
bakterijom M.tuberculosis koja ima svoju kliničku sliku, radiološku
sliku i bakteriološki nalaz. Bolest je infektivna, može se preneti na zdrave
osobe.
●
Latentna tuberkulozna infekcija (LTB) se definiše kao infekcija
M.tuberculosis complex-om, koja se potvrđuje pozitivnom reakcijom na
kožni test tuberkulinom (PPD test) i/ili pozitivnim Q-TB testom bez i
jednog kliničkog ili radiološkog znaka aktivne bolesti. Ona nije infektivna i ne
može se preneti na druge osobe.
●
Testovi koji se koriste u kliničkoj praksi za otkrivanje osoba sa LTB su in
vivo PPD test i in vitro Q-TB test koji otkrivaju upamćeni imuni
odgovor na antigene bakterija.

5. Prednosti QuantiFERON TB Gold testa u odnosu
na PPD test (tuberkulinski kožni test)
● Standardizovano je uzorkovanje krvi
● Samo jedna poseta pacijenta je dovoljna za testiranje
● Procenjuje se odgovor na više antigena istovremeno
● Rezultati nisu subjektivni i manja je greška u očitavanju
● Ne zavise od prethotne vakcinacije BCG vakcinom

6. Izvođenje QuantiFERON TB Gold testa
1.Vađenje krvi
2.Inkubiranje krvi
3.Centrifugiranje krvi
4.QFT ELISA test
5.Izračunavanje i tumačenje rezultata

7. Vađenje krvi
● Po 1ml krvi se vadi u tri specifično
spremljene epruvete (NIL, TB
ANTIGEN i MITOGEN)
● NIL epruveta (sivi čep) je negativna
kontrola. Sadrži fiziološki rastvor.
● TB ANTIGEN epruveta (crveni čep),
sadrži specifične TB antigene.
● MITOGEN epruveta (ljubičasti čep)
je pozitivna kontrola. Sadrži
fitohemaglutinine.
● Nakon vađenja krvi sve tri epruvete je
potrebno promućkati deset puta da bi
se unutrašnjost epruveta prekrila
krvlju.

8. Inkubiranje krvi
● Preporučuje se inkubiranje
uzoraka odmah nakon vadjenja
● Uzorci mogu da stoje na sobnoj
temperaturi do 16 časova ali se
ne smeju lediti ili držati u
frižideru
● Inkubiranje se vrsi na
temperaturi od 37 °C, od 16 do
24 časa
● Nakon inkubiranja uzorci se
mogu čuvati tri dana na
temperaturi od 4°C do 27°C pre
centrifugiranja

9. Centrifugiranje krvi
● Epruvete sa inkubiranim uzorcima se
centrifugiraju 10 min. na 3000 o/min
● Svaka epruveta sadrži gel koji razdvaja
krvnu plazmu od ćelija krvi nakon
centrifugiranja i olakšava izdvajanje
plazme
● Plazma može biti crvenija nego obično
● Ako se ELISA test ne obavlja istog dana,
plazma se može čuvati u epruveti do
mesec dana na temperaturi od 2°C do
8°C
● Za duže čuvanje potrebno je izdvojiti
plazmu u plastične epruvete i čuvati na
temperaturi nižoj od -20°C

10. QFT ELISA test
● QFT ELISA test se koristi
za merenje količine IFN-γ u
svakom uzorku plazme
● Ploča za ELISA test ima 96
polja na kojima je moguće
odraditi 28 uzoraka
● Pri svakom izvođenju testa
potrebno je odraditi 4
standarda kao kontrolu
● Standardi se dobijaju u
pakovanju i svaki ima
određenu vrednost IFN-γ

11. QFT ELISA test
● Pre testiranje je potrebno kalibrisati ELISA komponente na sobnoj
temperaturi najmanje 60 min.
● Prvo se u svako polje dodaje po 50µl konjugata, a zatim po 50µl
plazme i standarda koji se inkubiraju na sobnoj temperaturi 120 min.
● Nakon toga sledi ispiranje pa dodavanje po 100µl enzimskog
supstrata u svako polje na ploči i inkubira se 30 min.
● Za zaustavljanje reakcije se dodaje po 50µl enzimskog rastvora
(stopera)
● U roku od 5 min. treba izmeriti optičku gustinu svakog polja pomoću
čitača za mikroploče sa filterom od 450nm
● Dobijene vrednosti se koriste za izračunavanje rezultata

12. Izračunavanje i tumačenje rezultata
● QFT Analysis Software se
koristi za analizu podataka i
izračunavanje rezultata.
● Ovaj softver obavlja procenu
kvaliteta testa, generiše krivu
standarda i obezbeđuje rezultate
testiranja za svakog pacijenta.

13. Izračunavanje i tumačenje rezultata
● Pozitivan rezultat - Ukazuje na
mogućnost postojanja LTB (vrednosti za
IFN-γ u TB ANTIGEN epruveti su
iznad vrednosti od vrednosti u NIL
epruveti)
● Negativan rezultat - Znači da je veoma
mala šansa da je prisutna LTB
● Neodređeni rezultat - Izostanak
očekivanog rezultata u + i/ili - kontroli.
Ukazuje na tehničku grešku, rukovanje
uzorkom, skladištenje, zamrzavanje pre
inkubacije što dovodi do ćelijske anergije
(odsustvo reakcije na antigene) ili
ukazuje na imuni status testirane osoba,
dugoročna imunosupresija koja dovodi
do T ćelijske anergije

14. Izračunavanje i tumačenje rezultata
● Rezultate Q-TB testa uvek treba tumačiti u skladu sa drugim kliničkim i
laboratorijskim ispitivanjima
● Kod obolelih od RA zbog same prirode bolesti, a posebno zbog primene
imunosupresivne terapije snižen je imuni odgovor i postoji veliki rizik za TB
● Pre uključivanja imunosupresivne terapije po preprukama i vodičima
obavezno uraditi PPD i Q-TB test.
● Ako je pozitivan PPD obavezno uraditi i Q-TB ili ponoviti PPD test.
● U slučaju pozitivnog Q-TB testa doneti odluku o terapiji i hemoprofilaksi
(izonijazid).

15. Rezultat Q-TB GOLD testa bolesnika Instituta za
reumatologiju na biološkoj terapiji za decembar 2014
Pozitivni 5 Negativni 11
0
2
4
6
8
10
12

16. Rezultat koji izdaje laboratorija