Phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin giải phẫu bệnh

2. NHUỘM HE LÀ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM THƯỜNG
QUY TRONG GIẢI PHẪU BỆNH

3. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HE

4. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HE
❑ HE là phương pháp thường quy trong xét
nghiệm giải phẫu bệnh.
❑ Được sử dụng rộng rãi.
❑ Thích hợp với hầu hết các loại mô và cơ
quan.

6. DEPARAFFINIZATION- LOẠI SÁP
❑ LOẠI SÁP BẰNG XYLEN
❑ NỒNG ĐỘ XYLEN TĂNG DẦN
❑ TỐC ĐỘ LOẠI XYLEN PHỤ THUỘC VÀO
CÁC YẾU TỐ SAU:

7. Deparaffinization
❑ Nhiệt độ của mẫu mô
❑ Nồng độ của Xylen
❑ Thời gian
❑ Động tác
Xylen 1 Xylen 2 Xylen 3

8. Rehydration: Graded alcohol
❑ Cồn tuyệt đối vs Xylen
❑ Rửa nước thật sạch
❑ Tuyệt đối không bỏ qua nước
❑ Tủa trắng đục
Alcohol
100%
Alcohol
96%
Alcohol
80%
Alcohol
70%
Water

9. Nuclear stain: Haematoxylin

10. Các loại Hematoxylin

11. ✓ Nhuộm bằng Hematoxylin
✓ Mẫu mô nhuộm quá màu
(overstained) với hematoxylin.
✓ Chất biệt hoá (Differentiator) được sử
dụng để loại thuốc nhuộm thừa
✓ Quy trình nhuộm tiếp tục với chất
nhuộm nền (Eosin)
REGRESSIVE (QUÁ MÀU)

12. ✓ Nhuộm bằng Hematoxylin
✓ Mô được nhuộm bằng Hematoxyline ở
một điểm.
✓ Không có chất loại màu Hematoxyline
thừa.
✓ Quy trình tiếp tục nhuộm bằng chất
nhuộm nền (Eosin).
PROGRESSIVE (TẮC MÀU)

13. Staining Systems
(Progressive v/s Regressive)
Regressive:
Stain Regress
(Harris hematoxylin)
Progressive:
Stain Rinse
(Mayer’s, Gill’s I & II)
Tiếp tục nhuộm
Tiếp tục nhuộm

14. SO SÁNH 2
PHƯƠNG PHÁP
• Progressive staining (tắc màu):
– Cường độ màu được kiểm soát thông qua
sự thay đổi thời gian nhuộm.
– Hematoxylin chỉ nhuộm một lần.
• Regressive staining (quá màu):
– Mẫu mô nhuộm quá màu với
Hematoxyline.
– Nền được loại bỏ bằng chất biệt hoá.

15. Harris Hematoxylin
• Harris hematoxylin:
– Thường được sử dụng nhất.
– Mạnh, regressive stain
• Harris hematoxylin nhuộm nhân
sắc nét.
• Bắt buộc phải lọc trước khi nhuộm.

16. Differentiation (biệt hóa)
• Dung dịch biệt hóa
• Tăng nồng độ (H+)
• Bẻ gãy liên kết
+ Gắn kết giữa Al+3 và mẫu mô.
+ Gắn kết giữa Al+3 và mẫu mô.
• Quá lâu sẽ loại màu thừa ra khỏi mẫu
mô và làm mờ.

17. Differentiation (biệt hóa)
❑Sử dụng dung dịch acid để loại màu thừa.
❑Dung dịch Differentiation thường là acid
mạnh. 70% alcohol with 0.5-1.0% HCl
❑ Harris hematoxylin:
❖1.0% or 0.5% HCl in 70% alcohol.
❖Thời gian 2-10 s

18. BLUING
❑Chuyển màu nhân từ đỏ sang xanh/tím
❑Bluing là chất kiềm khoảng pH từ 7.5-9.0
là tối ưu
❖Nước máy
❖Nước Scott’s tap
❖Ammonia
❖Lithium Carbonate
❖Dung dịch đệm

19. BLUING
❑Bluing là tăng độ tương phản của phết
nhuộm HE.
❑Màu Hematoxylin đổi sang xanh/tím.

20. CHÚ Ý
❑ Nước máy- pH không ổn định
❑ Ammonia water- pH có thể quá cao. Cod
thể trôi mẫu.
❑ Scott’s tap water or buffered có pH ổn
định thích hợp với mẫu mô.

21. Counterstain (nhuộm nền): Eosin
❑Alcoholic eosin Y công thức tương phản với
Hematoxyline.
❑Nhuộm hồng cầu màu "bright red/pink" và
collagen, cơ và bào tương các sắc thái
"orange/pink".
❑Eosin là thuốc nhuộm acid
❑Nguồn điện tích âm
❑Eosin gắn với nguồn proteins điện tích
dương ở bào tương và mô liên kết

22. • Nhuộm nền là một kỹ thuật được sử dụng
để phân biệt giữa các loại tế bào hoặc cấu
trúc khác nhau.
• Nhuộm nền bao gồm việc sử dụng một
loại màu nhuộm trái ngược, được áp dụng
sau khi màu nhuộm chính đã được sử
dụng.
• Màu nhuộm chính được hấp thụ bởi các tế
bào hoặc cấu trúc quan tâm, trong khi
màu nền được hấp thụ bởi các tế bào
hoặc cấu trúc khác trong mẫu, cho phép
chúng được phân biệt với nhau.

23. • Ví dụ, trong kỹ thuật nhuộm Gram, màu
nhuộm chính (tím gentian) được sử dụng
để nhuộm tất cả các tế bào vi khuẩn,
nhưng màu nền (safranin hoặc fuchsine)
được sử dụng để nhuộm các loại vi khuẩn
Gram âm, có một lớp peptidoglycan mỏng
hơn trong tường vi khuẩn của họ và xuất
hiện màu hồng hoặc đỏ dưới kính hiển vi,
trong khi các vi khuẩn Gram dương sẽ
xuất hiện màu tím.

24. (pH effects)
• Eosin Y mang điện tích âm pH of 3.5 và cao
hơn.
• Gắn với điện tích dương ở mô.
• Cường độ nhuộm phụ thuộc vào pH.
• Trên mức pH 5 thì cường độ nhuộm
giảm đáng kể.
Dưới mức pH 4 cũng không tối ưu.

25. Chế phẩm thương mại:
– Alcoholic eosins
– Nước eosins
– Eosins với phloxine
• Eosins có thể khác nhau tuỳ nồng độ,
tính chất dung môi và pH.
EOSINS
(formulations)

26. Relationship of pH and charge
pH of dye solution (+) charge on tissue
Low pH solutions increase the number of
charged groups within the tissue

27. Relationship of pH and charge
pH of dye solution (+) charge on tissue
High pH solution decreases the number of charged
groups within the tissue

28. (pH effects)
• Khi pH tăng độ nhuộm Eosin giảm
– Dư nước máy.
– Loại "bluing "không tốt

29. (pH effects)
• pH 3 – 4:
– Liên kết dương giữa các protein tăng
– Các nhóm axit của eosin trở thành proton và
eosin trở thành trung tính
– Eosin liên kết không đặc hiệu.
– Sự nhuộm giảm.

30. EOSINS
(pH effects)
Eosin Y Staining
pH = 4.3 pH = 5.2

31. EOSINS
(pH effects)
Eosin Y Staining
pH = 4.3 pH = 5.2

32. The H and E Stain
(balance of coloration)

33. The H and E Stain
(balance of coloration)

34. Dehydration
❑ Loại nước dần
❑ Màu Eosin thừa
❑ Có nhúng xylen hay không?
Alcohol
96%
Alcohol
96%
Alcohol
96%
Alcohol
100%

35. Clearing and mounting
PERMOUNT CANADA KEO TH

36. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
✓CẮT LỌC BỆNH PHẨM
✓XỬ LÍ MÔ
✓ ĐÚC KHỐI
✓ CẮT MỎNG
✓ NHUỘM

40. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – CHUẨN BỊ
❑ THIẾT BỊ, DỤNG CỤ GÌ?
❑ HÓA CHẤT, THUỐC NHUỘM GÌ?
❑ VẬT TƯ TIÊU HAO GÌ? CHÚ Ý?
❑ NHỮNG VPP CẦN THIẾT

41. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – TIẾN HÀNH
❑ NHỮNG BƯỚC NÀO?
❑ Ý NGHĨA CỦA MỖI BƯỚC?
❑ ĐANG SỬ DỤNG HÓA CHẤT, THUỐC
NHUỘM NÀO?
❑ YÊU CẦU CỦA HC, TN?
❑ LỌC THUỐC NHUỘM?
❑ PHA THUỐC NHUỘM? DD MẸ, TỈ LỆ
PHA? HOÀN NGUYÊN?

42. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – TIẾN HÀNH
❑ MÔ TẢ NGẮN GỌN, RÕ RÀNG, DỄ
HIỂU
❑ CÓ HƯỚNG DẪN NHANH

43. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – KẾT QUẢ
❑ TIÊU CHUẨN ĐẠT YÊU CẦU, PHƯƠNG
PHÁP KIỂM TRA

44. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – ĐBCL
❑ KHẮC PHỤC CÁC SỰ CỐ VÀ SAI SÓT
TRONG QUÁ TRÌNH NHUỘM NHƯ THẾ
NÀO?

45. THIẾT KẾ QUY TRÌNH – SAU XÉT
NGHIỆM
❑ VÀO SỔ
❑ VỆ SINH 5S
❑ CHUẨN BỊ HÓA CHẤT, THUỐC NHUỘM
CHO ĐỢT NHUỘM TIẾP THEO

46. TRÌNH BÀY QUY TRÌNH BẠN VỪA THIẾT KẾ
NẾU CHƯA HỢP LÝ, KHÔNG SAO HÃY TIẾP TỤC
HOÀN THIỆN

47. HÃY LÀ PHIÊN BẢN TỐT NHẤT CỦA CHÍNH MÌNH