Phân Lập Và Tuyển Chọn Các Chủng Vi Khuẩn Có Hoạt Tính Cao Trong Quá Trình Lên Men Chượp Mắm Cát Hải

1. TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM
NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI
LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Hà Nội – Năm 2017

2. TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM
NGUYỄN THỊ NGÂN HÀ
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN
CÓ HOẠT TÍNH CAO TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN
CHƢỢP MẮM CÁT HẢI
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số: 15BCNTP-06
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC :
1. TS. Bùi Thị Thu Hiền
2. PGS. TS. Khuất Hữu Thanh
Hà Nội – Năm 2017

3. I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng.
Tôi xin cam đoan, các thông tin đƣợc trích dẫn trong luận văn này đã đƣợc ghi
rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2017
Ngƣời viết báo cáo
Nguyễn Thị Ngân Hà

4. II
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã
nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của gia đình, các thầy cô giáo và bạn bè, đồng
nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Thị Thu Hiền, Trƣởng phòng
Nghiên cứu Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản và PGS.TS. Khuất
Hữu Thanh, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trƣờng Đại học
Bách Khoa Hà Nội đã truyền cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu và tận
tình hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của phòng Nghiên cứu Công nghệ Sau
thu hoạch, Viện Nghiên cứu Hải sản đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề
tài.
Tôi xin dành những dòng cuối để cảm ơn bố mẹ, chồng con và những ngƣời
thân trong gia đình đã dành thời gian cho tôi, thay tôi làm mọi công việc gia đình và
luôn động viên tôi yên tâm học tập, công tác. Tôi cũng dành sự trân trọng với bạn
bè, đồng nghiệp đã luôn ở bên tôi trong những lúc khó khăn để vƣơn lên trong học
tập, công tác và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện luận
văn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2017
Ngƣời viết báo cáo
Nguyễn Thị Ngân Hà

5. III
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT .............................. VI
DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH.............................................................................................VIII
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1 KHÁI QUÁT VỀ NƢỚC MẮM....................................................................3
1.1.1 Khái niệm................................................................................................3
1.1.2 Các loại nƣớc mắm .................................................................................3
1.1.3 Đặc điểm chung của nƣớc mắm..............................................................4
1.2. NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT NƢỚC MẮM...................................................9
1.2.1 Cá ............................................................................................................9
1.2.2 Nƣớc......................................................................................................12
1.2.3 Muối......................................................................................................12
1.2.4 Enzyme protease...................................................................................13
1.3. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁ Ở CÁT HẢI....................16
1.3.1 hái quát về công nghệ sản xuất nƣớc mắm Cát Hải...........................16
1.3.2 Quy trình sản xuất .................................................................................17
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ LĨNH VỰC SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ
CÁ…......................................................................................................................22
1.4.1 Nghiên cứu bổ sung protease trong sản xuất nƣớc mắm ........................22
1.4.2 Nghiên cứu tạo hƣơng nhờ vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm ..........24
1.5. VAI TRÕ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƢỚC
MẮM. ....................................................................................................................25
1.6. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG NƢỚC MẮM........27
1.6.1 Ảnh hƣởng của độ muối .......................................................................27
1.6.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ........................................................................28
1.6.3 Ảnh hƣởng của pH................................................................................28
1.6.4 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất...........................................................28

6. IV
1.6.5 Ảnh hƣởng của diện tích tiếp xúc.........................................................28
1.6.6 Ảnh hƣởng của chất hoạt hoá ...............................................................29
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............30
2.1. NGUYÊN LIỆU ..........................................................................................30
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.........................................................................30
2.2.1 Hóa chất................................................................................................30
2.2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu.............................................................30
2.3. MÔI TRƢỜNG PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY VI SINH VẬT...................31
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................31
2.4.1 Định lƣợng và phân lập vi khuẩn hiếu khí tổng số...............................31
2.4.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease định
t nh ….................................................................................................................32
2.4.3 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng định t nh ......32
2.4.4 Giải trình tự đoạn ARNr 16S................................................................33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..............................35
3.1. SỰ BIẾN ĐỘNG MẬT ĐỘ VI HUẨN Ở CHƢỢP MẮM TRONG CÁC
GIAI ĐOẠN LÊN MEN HÁC NHAU...............................................................35
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI HUẨN CHỊU MẶN CÓ HOẠT TÍNH
CAO.......................................................................................................................39
3.2.1 Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh protease trong các
chƣợp lên men nƣớc mắm ..................................................................................39
3.2.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn yếm kh chịu mặm có khả năng sinh
hƣơng trong các chƣợp lên men nƣớc mắm.......................................................41
3.2.3. Định tên đến loài các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt t nh cao phân
lập đƣợc từ các chƣợp lên men nƣớc mắm bằng kỹ thuật phân tử.....................42
3.3. NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CÁC ĐIỀU IỆN NUÔI CẤY TỚI
HẢ NĂNG SINH TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG VI HUẨN M1, M2, H10
VÀ H12..................................................................................................................49
3.3.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ.......................................................................49
3.3.2 Ảnh hƣởng của pH ...............................................................................50

7. V
3.3.3 Khảo sát đặc tính chịu mặn của các chủng vi khuẩn ...........................50
3.4. NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH SỬ DỤNG TRONG
SẢN XUẤT NƢỚC MẮM TỪ CÁC CHỦNG VI HUẨN M1 VÀ H12...........51
3.4.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy chế phẩm .................................................51
3.4.2. Nghiên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm............................................52
KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................55

8. VI
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
VK Vi khuẩn
g/l Gam/lít
Naa Nito acid amin
Nts Nito tổng số
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam
CH Cát Hải
Môi trƣờng NA Môi trƣờng Nutrient Agar
Môi trƣờng MRS Môi trƣờng De Man, Rogosa and Sharpe
CFU/ gram Tổng số khuẩn lạc / gam
CT Công thức

9. VII
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Tên các loại nƣớc mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở cá nƣớc khác
nhau.............................................................................................................................3
Bảng 1.2: Hàm lƣợng axit amin trong nƣớc mắm mg ml .. ......................................5
Bảng 1.3: Thành phần các chất bay hơi trong nƣớc mắm...........................................7
Bảng 1.4: Thành phần hóa học của cá ......................................................................10
Bảng 1.5. Thành phần hóa học cá biển .....................................................................10
Bảng 1.6: Các acid amin chủ yếu % trong các protein khác nhau .........................12
Bảng 1.7: Yêu cầu cảm quan của nƣớc mắm............................................................20
Bảng 1.8: Các chỉ tiêu hóa học của nƣớc mắm.........................................................21
Bảng 1.9: Chỉ tiêu vi sinh của nƣớc mắm.................................................................21
Bảng 3.1: Số lƣợng các loại khuẩn lạc quan sát trên các môi trƣờng NA 25%
NaCl và MRS 25% NaCl.......................................................................................39
Bảng 3.2: Một số chủng vi khuẩn có hoạt t nh protease cao nhất ...........................41
Bảng 3.3: Đánh giá cảm quan các mẫu nghiên cứu..................................................42
Bảng 3.4: Đánh giá chất lƣợng chế phẩm vi sinh sử dụng trong sản xuất nƣớc mắm
sau bảo quản..............................................................................................................53

10. VIII
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Quy trình sản xuất nƣớc mắm Cát Hải – Hải Phòng ................................19
Hình 3.1: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh trong mẫu chƣợp ở các giai đoạn
lên men khác nhau trên môi trƣờng NA và môi trƣờng NA 25% NaCl..................36
Hình 3.2: Sự biến động mật độ vi khuẩn hiếu kh trong mẫu chƣợp ở các giai đoạn
lên men khác nhau trên môi trƣờng MRS và môi trƣờng MRS 25% NaCl...........37
Hình 3.3: Hình ảnh số lƣợng và các loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu kh mọc trên môi
trƣờng NA 25% NaCl. Hình ảnh chụp từ c ng nồng độ pha loãng mẫu ở chƣợp
lên men ở tháng 1 A và chƣợp lên men tháng 12 B . ...........................................38
Hình 3.4: hả năng sinh protease của 87 chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm.40
Hình 3.5: hả năng sinh protease của một số chủng vi khuẩn hoạt t nh cao ..........40
Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN tổng
số. ..............................................................................................................................43
Hình 3.7: huẩn lạc và tế bào chủng M1. huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế
bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy....................................................................................44
Hình 3.8: huẩn lạc và tế bào chủng M2. huẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi cấy, tế
bào chụp sau 24 giờ nuôi cấy....................................................................................45
Hình 3.9: Cây phát sinh chủng loại của chủng M1 và M2 và các loài vi khuẩn thuộc
nhóm Bacillus amyloliquefaciens xây dựng dựa trên đoạn gene 16S rRNA............46
Hình 3.10: huẩn lạc và tế bào chủng H12 ..............................................................47
Hình 3.11: Cây phát sinh chủng loại của chủng H12 với các loài có quan hệ họ hàng
gần trong chi Lysinibacillus dựa vào trình tự gen rRNA 16S……………..……..48
Hình 3.12: Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn .................50
Hình 3.13: hả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn...........................................51
Hình 3.14: Ảnh hƣởng của nhiệt độ sấy đến khả năng sống sót của tế bào trong chế
phẩm sau khi sấy .......................................................................................................52

11. 1
MỞ ĐẦU
Nƣớc mắm là một loại nƣớc chấm quen thuộc đƣợc ƣa chuộng nhất ở nƣớc ta
và không thể thiếu trong mỗi bữa ăn hàng ngày. Nƣớc mắm có giá trị dinh dƣỡng
cao, hấp dẫn ngƣời ăn bởi hƣơng vị đậm đà, đặc trƣng mà không loại sản phẩm nào
có thể thay thế đƣợc.
Nƣớc mắm là một mặt hàng chính của ngành thủy sản. Sản xuất nƣớc mắm
tiêu thụ khoảng 40-60% tổng số cá đánh bắt và đƣợc chế biến khắp nơi trên toàn
quốc. Nƣớc mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi ở
Việt Nam mà hiện nay còn đƣợc ƣa chuộng ở nhiều nƣớc trên thế giới. Mỗi quốc
gia có quy trình sản xuất nƣớc mắm khác nhau, tạo hƣơng vị riêng đặc trƣng cho
từng quốc gia, dân tộc: Jeot-kal ở Hàn Quốc, Shottusuru ở Nhật, Nam-pla ở Thái
Lan, Budu ở Malaysia…
Nƣớc mắm xuất hiện ở khắp mọi nơi, từ bữa ăn gia đình tới các bữa tiệc nhà
hàng, khách sạn ch nh điều đó nói lên t nh quan trọng của nƣớc mắm đối với đời
sống ẩm thực của dân tộc Việt Nam. Nƣớc mắm sản xuất theo phƣơng pháp cổ
truyền ở Việt Nam có mùi vị thơm ngon đặc trƣng. Tuy nhiên, nó có nhƣợc điểm là
hàm lƣợng nitơ không cao, chu kì sản xuất quá dài (từ 6 tháng đến 1 năm hoặc có
thể lâu hơn), tỷ lệ thu hồi không cao, thời gian ủ càng dài thì tỷ lệ thu hồi càng thấp,
giá thành sản phẩm cao vì vậy không kinh tế.
Mặt khác, trong quá trình ủ ch n cần sử dụng rất nhiều nhân công để theo dõi
“chăm sóc” hàng ngày với các hoạt động khấy đảo, phơi nắng, kéo rút… Để sản
xuất ra 1 l t nƣớc mắm thành phẩm thì công nhân phải tốn rất nhiều “mồ hôi và
công sức” nhƣng hiệu quả kinh tế mang lại không cao, thị trƣờng tiêu thụ hạn chế,
phản hồi từ ngƣời tiêu d ng không tốt nhƣ: vị quá mặn, màu không ổn định, bao bì
đơn giản không bắt mắt, thiếu quảng bá hình ảnh thƣơng hiệu…

12. 2
Nhằm rút ngắn chu kỳ sản xuất, nâng cao hƣơng vị và chất lƣợng nƣớc mắm,
đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của thị trƣờng, góp phần giảm giá thành trong sản
xuất nƣớc mắm theo phƣơng pháp truyền thống là vấn đề cần thiết hiện nay.
Xuất phát từ yêu cầu đó tôi đã tiến hành đề tài : “Phân lập và tuyển chọn các
chủng vi khuẩn có hoạt tính cao trong quá trình lên men chượp mắm Cát Hải”.

13. 3
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1 Khái quát về nuớc mắm
1.1.1 Khái niệm
Nƣớc mắm là một dung dịch bao gồm các acid amin, muối NaCl và các chất
thơm, đƣợc tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzyme protease và
vi sinh vật có trong cá.
Nƣớc mắm là sản phẩm truyền thống của Việt Nam. Nƣớc mắm có từ lâu
đời, nó đã gắn liền với đời sống hàng ngày, mang nét đặc trƣng rất riêng.
1.1.2 Các loại nƣớc mắm
Nƣớc mắm đƣợc sản xuất từ cá và muối không chỉ đƣợc sử dụng rộng rãi ở
Việt Nam mà còn đƣợc ƣa chuộng tại nhiều nƣớc trên thế giới. Đặc biệt, nƣớc mắm
đƣợc sản xuất ở hầu hết các nƣớc Châu Á. Mỗi nƣớc có điều kiện sản xuất khác
nhau tạo ra sản phẩm có giá trịnh dinh dƣỡng và giá trị cảm quan khác nhau mang
hƣơng vị riêng đặc trƣng cho từng quốc gia, dân tộc.
Bảng 1.1: Tên các loại nước mắm và tỷ lệ phối trộn tạo sản phẩm ở cá nước khác
nhau
Nƣớc sản
xuất
Tên gọi Điều kiện và thời gian lên men
Nhật Bản Shottsuru Uwo-
shoyu
Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối + gạo lên men và koji
(3:1), Thời gian lên men 6 tháng
Hàn Quốc Jeot-kal Tỷ lệ 4 : 1 = Cá : Muối (6 tháng)
Việt Nam Nƣớc mắm Tỷ lệ 3 : 1 - 3 : 2 = Cá : Muối (6-12 tháng)
Thái Lan Nam-pla Tỷ lệ 5 : 1 = Cá : Muối (5-12 tháng)
Malaysia Budu Tỷ lệ 5 : 1 - 3 : 1 = Cá : Muối đƣờng + me (3-12
tháng)
Philippine Patis Tỷ lệ 3 : 1 - 4 : 1 = Cá : Muối (3-12 tháng)
Các loại nƣớc mắm ở Việt Nam
Trên thị trƣờng Việt Nam hiện nay có rất nhiều thƣơng hiệu nổi tiếng về
nƣớc mắm truyền thống, nhƣng đặc trƣng nhất và mang nét riêng của mỗi vùng
miền vẫn là nƣớc mắm Cát Hải (Hải Phòng , nƣớc mắm Phan Thiết (Bình Thuận),

14. 4
nƣớc mắm Phú quốc iên Giang . Hiện nay, trên thị trƣờng nƣớc mắm truyền
thống đƣợc phân loại theo độ đạm, có 4 loại cơ bản: loại cao đạm 40-60g gN/l; loại
33-35gN l, 27-30gN l và loại 15-18gN/l
1.1.3 Đặc điểm chung của nƣớc mắm
Theo Nguy n Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, Nguy n Việt Dũng, Nguy n Anh
Tuấn xuất bản năm 2011, thành phần dinh dƣỡng của nƣớc mắm là sự kết hợp tổng
hòa giữa các thành phần hóa học cơ bản và các thành phần tạo giá trị cảm quan
màu, m i, vị… . Thành phần của nƣớc mắm biến đổi liên tục trong quá trình chế
biến. Nƣớc mắm đƣợc chế biến theo phƣơng pháp cổ truyền sau 6 tháng coi nhƣ là
đã ch n và thành phần của chúng cũng tạm coi nhƣ đã ổn định, tuy vậy từ sau 6
tháng chúng vẫn tiếp tục biến đổi.
1.1.3.1 Độ mặn
Độ mặn là một trong những đặc điểm quan trọng để phân biệt nƣớc mắm
truyền thống và công nghiệp. Theo phƣơng pháp truyền thống, nƣớc nắm Cát Hải
đƣợc dùng muối để chế biến và bảo quản nên độ mặn phải đạt trong khoảng từ 245
– 290g muối/ lít sản phẩm theo quy định của của TCVN 5107-2003.
Trên thực tế, nếu độ mặn giảm xuống thấp hơn thì nƣớc mắm sẽ nhanh
chóng bị hƣ thối trong khoảng từ 7 – 10 ngày. Do đó, các loại mắm công nghiệp có
vị nhạt hơn thƣờng phải thêm nhiều chất bảo quản để lƣu giữ đƣợc trong thời gian
dài.
Với phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm Cát Hải, chƣợp đƣợc phơi nắng đánh
đảo đến trên 12 tháng nên hơi nƣớc sẽ bay lên và mất đi, lƣợng muối ở lại chỉ khi
đạt ngƣỡng nhƣ trên mới kết tinh thành hạt. hi đó, lƣợng muối trong phần nƣớc đã
đạt đến bão hòa.
1.1.3.2. Độ đạm
Các chất có đạm chiếm hàm lƣợng chủ yếu trong nƣớc mắm và nó cũng là
thành phần quyết định giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm.

15. 5
Bảng 1.2: m lượng a it amin trong nước mắm mg ml Đỗ Đình ọc, 1990)
Theo Đỗ Đình Học 1990 hàm lƣợng axit amin trong ba loại nƣớc mắm
bảng 1.2), các chất có đạm trong nƣớc mắm bao gồm nitơ toàn phần, nitơ axit
amin, nitơ các chất bay hơi chủ yếu là NH3 … Ngƣời ta đã dựa vào lƣợng nitơ toàn
phần để phân hạng nƣớc mắm. Nƣớc mắm có thành phần dinh dƣỡng cao là vì nó
có đầy đủ các axit amin mà đặc biệt là các axit amin thiết yếu nhƣ valin, lơxin,
isolơxin, threonin, methionin, lysin, phenylalanin, triptophan và histidin.
Các th nghiệm nhỏ chế biến nƣớc mắm từ cá cơm đại diện cho cá nổi và cá
lƣợng đại diện cho cá đáy cho thấy hàm lƣợng các axit amin ở nƣớc cá cơm cao
hơn nhiều ở cá lƣợng là xistin, lysin, histidin, axit aspactic, treonin và alanin. Riêng
phenylalanin, xerin, tyrisin thì ở cá lƣợng cao hơn cá cơm một t. Từ đó cho ta thấy
thành phần hóa học của nƣớc mắm có khác nhau theo các nguyên liệu đem chế

16. 6
biến, các axit amin có hàm lƣợng cao trong nƣớc mắm cá cơm và cá lƣợng là:
tyrosin, lơxin isolơsin, lysin và xêrin; với hàm lƣợng trung bình là axit glutamic,
arginnin, treonin ở cá cơm và axit aspactic ở cá lƣợng ; với hàm lƣợng t là xistin,
lysin, alanin, prolin, phenylalanin…
1.1.3.3 Màu sắc
Nƣớc mắm ngon thƣờng có màu từ vàng rơm đậm đến vàng cánh gián, với
trạng thái: trong suốt, độ sánh cao, không có váng trên mặt, thể hiện nguồn nguyên
liệu cá tƣơi ngon và chất lƣợng. Nƣớc mắm ngon sau thời gian mở nắp và tiếp xúc
với không kh sẽ chuyển màu sẫm hơn. Đây chính là hiện tƣợng tự nhiên của nƣớc
mắm truyền thống, khi độ đạm trong nƣớc mắm bị oxy hóa. Thêm vào đó, cũng nên
chú ý quan sát kỹ chai nƣớc mắm dƣới ánh sáng và dốc ngƣợc chai. Nếu nƣớc mắm
trong và không có cặn là tốt, còn nếu có cặn và lắc không tan thì đó là tạp chất.
1.1.3.4 . Hƣơng vị
Thành phần các chất bay hơi của nƣớc mắm rất phức tạp và nó quyết định
hƣơng vị của nƣớc mắm. Theo nghiên cứu của Nonaka và cộng tác viên cho thấy
trong hợp chất bay hơi của nƣớc mắm có 12 loại trung t nh, bốn loại axit bay hơi,
tám loại amin bay hơi và bảy loại cacbonyl bay hơi nhƣ ở hình dƣới.
Hàm lƣợng các chất bay hơi trong nƣớc mắm mg 100g nƣớc mắm:
- Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde)
- Các acid bay hơi: 404-533 (propionic)
- Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin)
- Các chất trung t nh bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde)

17. 7
Bảng : Th nh ph n các ch t a h i trong nước mắm
Bản chất của quá trình sản xuất nƣớc mắm là quá trình thủy phân protein
trong cá nhờ hệ enzyme proteaza thành các sản phẩm pepton → polypeptid →
peptid → axit amin. Do vậy, trong sản xuất nƣớc mắm, quá trình thủy phân là yếu
tố mở đầu cho việc hình thành mùi vị và màu sắc của sản phẩm. Phản ứng thủy
phân tạo ra các axit amin sau đó các axit amin biến đổi theo bốn chiều hƣớng khác
nhau theo sơ đồ.
Protein
(1)
Thủy phân
Protease
Axit amin
Vi sinh vật gây hƣơng Tạo mùi
Tạo vị ngọt đặc trƣng
(2)
(3)
Oxy hóa phi enzyme
Melanoidin
Màu sắc
đặc trƣng
(4)
NH3 Mùi vị đặc trƣng

18. 8
Theo sơ đồ trên:
Phản ứng theo chiều hướng (1), axit amin là cơ chất dinh dưỡng của vi sinh
vật gây hương, các vi sinh vật này hấp thụ axit amin, làm biến đổi tạo ra các chất
bay hơi tạo m i cho nƣớc mắm.
Phản ứng theo chiều hướng (2) là axit amin tạo nên vị ngọt đặc trưng của
nước mắm: Các axit amin này là sảm phẩm cuối cùng của phản ứng thủy phân
protein, vị ngọt của nƣớc mắm phụ thuộc nhiều vào hàm lƣợng và thành phần các
axit min.
Phản ứng theo chiều hướng (3) là một số axit amin bị oxy hóa tạo nên màu
sắc đặc trưng cho nước mắm hoặc tham gia phản ứng hóa học tạo màu, tạo mùi.
Màu sắc và mùi vị của nƣớc mắm dần dần đƣợc hình thành do quá trình sinh học,
hóa học xảy ra. Quá trình tạo màu đƣợc quyết định bởi những phản ứng oxy hóa
xảy ra không ngừng và là sự tổng hợp hòa giữa các chất tạo thành cùng màu sắc,
mùi vị đặc trƣng cho sản phẩm nƣớc mắm. Sự thay đổi về màu sắc trong quá trình
chín của chƣợp nguyên nhân do chính bản thân nguyên liệu và do phản ứng của các
axit amin gây nên nhƣ phản ứng oxy hóa nhƣ phản ứng melanoidin,
quinonmonin,… tạo sẫm màu cho sản phẩm.
Phản ứng theo chiều hướng (4) là một phần axit amin bị phân hủy bởi vi sinh
vật tạo ra NH3, chất này cũng tham gia tạo nên mùi vị cho nƣớc mắm. Lƣợng axit
amin còn lại sẽ tạo nên vị ngọt cho nƣớc mắm.
Trong quá trình ủ chín dịch đạm có hai phản ứng di n ra đồng thời để hình
thành nên mùi mắm đặc trƣng. Một là, phản ứng thủy phân protein do enzyme xúc
tác vẫn hoạt động, nhƣng với tốc độ yếu hơn so với điều kiện thủy phân tối ƣu. Hai
là, vi sinh vật sẽ sử dụng các nguồn chất hữu cơ sẵn từ các sản phẩm của phản ứng
thủy phân có để sinh tổng hợp tạo nên các chất m i đặc trƣng nhƣ 2 -
methylpropanal, 2 - methylbutanal, 2 – ethylpyridine và trisulfide dimethyl.
Nhƣ vậy, quá trình ủ ch n là công đoạn quan trọng để hình thành các giá trị
đặc trƣng màu sắc; mùi; vị cho nƣớc mắm truyền thống mà ở phƣơng pháp sản xuất
nƣớc mắm ngắn ngày và nƣớc mắm công nghiệp không thể có. Trong quá trình ủ
chín xảy ra hàng loạt các phản ứng thủy phân ở các cấp độ khác nhau, kết hợp với

19. 9
hoạt động của các chủng vi sinh vật tạo lên sự biến đổi theo chiều hƣớng có lợi và
hình thành mùi vị đặc trƣng cho nƣớc mắm.
Qua các tài liệu tổng quan cho thấy hệ vi sinh vật đóng vai trò quan trọng và
có tính chất quyết định đến việc hình thành hương vi đặc trưng của nước mắm.
Nguồn nguyên liệu, quy trình sản xuất khác nhau sẽ có những hệ vi sinh vật gây
hương khác nhau. Trong pham vi luận văn sẽ hoàn thiện quy trình tạo hương nước
mắm đặc sản Cát Hải (từ cá quẩn, cá nhâm) bằng chế phẩm vi sinh.
1.2. Nguyên liệu sản xuất nƣớc mắm
1.2.1 Cá
Nguyên liệu ch nh d ng để sản xuất nƣớc mắm là các loại cá. Nó đóng vai
trò quan trọng, quyết định nhiều đến phần chất lƣợng và giá thành của nƣớc mắm,
do vậy, việc lựa chọn loại cá để đƣa vào sản xuất cũng là một vấn đề đáng quan tâm
và đƣợc nhà sản xuất hết sức coi trọng.
Nƣớc mắm chủ yếu đƣợc sản xuất từ các loại cá biển nhỏ nhƣ: cá nục, cá
tráp, cá liệt, cá tạp… là những loài cá có giá trị kinh tế thấp. Tuy nhiên, việc sử
dụng loại cá gì còn phụ thuộc vào từng vùng miền, từng mùa vụ khác nhau.
Các loài cá nhƣ cá Quẩn (cá Nục – Chi cá Nục Decapterus thuộc họ cá Khế
Carangidae), cá Nhâm (cá Trích – Clupeidae đƣợc phần lớn cơ sở sản xuất nƣớc
mắm lựa chọn, nguyên nhân chính là loài cá này có nguồn cung cấp dồi dào, giá
thành rẻ, d kiếm. Mặt khác, nƣớc mắm làm từ cá Nhâm cho màu nƣớc mắm đẹp
nhất (màu cánh dán), cá Quẩn cho lƣợng nƣớc mắm cốt nhiều hơn.
Vì cá là nguồn nguyên liệu ch nh để sản xuất ra nƣớc mắm nên ảnh hƣởng
trực tiếp tới chất lƣợng nƣớc mắm, do đó khi lựa chọn cá để làm mắm, cần phải đạt
các yêu cầu sau:
- Nên sử dụng loại cá gầy, có hàm lƣợng lipit thấp (nên < 0,1%)
- Nên sử dụng các loại cá có k ch thƣớc nhỏ, vì vậy sẽ không tốn nhân công
cho công đoạn xử lý nguyên liệu, đồng thời k ch thƣớc nhỏ diện tích bề mặt tiếp
xúc giữa muối và cá sẽ tăng lên làm cho quá trình thủy phân di n ra nhanh chóng.

20. 10
- Tuyệt đối không dùng các loại cá có chứa độc tố để làm nguyên liệu chế biến
nƣớc mắm. Nhƣ trong cá nóc có độc tố tetrodotocxin, không bị thủy phân trong quá
trình chế biến nƣớc mắm và không mất đi khả năng gây độc tố cho ngƣời sử dụng.
Thành phần hóa học của cá gồm: nƣớc, protide, lipid, glucid, muối vô cơ,
vitamine,... trong đó nƣớc chiếm tỉ lệ rất lớn, protide và lipid chiếm một phần đáng
kể, glucid trong cá thƣờng rất ít và tồn tại dƣới dạng glycogen. Các thành phần này
khác nhau và thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới t nh, điều kiện sinh sống.
Ngoài ra, các yếu tố nhƣ thành phần thức ăn, môi trƣờng sống, kích cỡ cá và các
đặc tính di truyền cũng ảnh hƣởng đến thành phần hóa học, đặc biệt ở cá nuôi.
Thành phần hóa học của cá ở từng cơ quan, bộ phận có sự khác nhau.
Bảng 1.4: Thành ph n hóa học của cá
Thành phần
Chỉ tiêu
Nƣớc Protein Lipid Muối vô cơ
Thịt cá 48 – 85,1 10,3 – 24,4 0,1 – 5,4 0,5 – 5,6
Trứng cá 60 – 70 20 – 30 1 – 11 1 – 2
Gan cá 40 – 75 8 – 18 3 – 5 0,5 – 1,5
Da cá 60 – 70 7 – 15 5 – 10 1 – 3
Sự khác nhau về thành phần hóa học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh
hƣởng đến mùi vị và giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm, việc bảo quản tƣơi nguyên
liệu và qui trình chế biến.
Bảng 1.5. Thành ph n hóa học cá biển
TT
Thành phần hóa học (%
khối lƣợng) Nƣớc Protein Lipit
Tên loại cá
1 Nục sổ 76.80 21.75 0.85
2 Mối thƣờng 77.50 19.26 1.80
3 Trích 75.90 21.76 3.15
4 Phèn hai sọc 76.20 20.35 2.20

21. 11
5 Lƣơn ngắn 79.30 19.03 1.21
6 Cơm 75.14 11.25 2.10
7 Mòi 76.60 9.37 14.40
8 Lẹp 81.84 10.00 1.40
9 Chuồn 76.17 9.75 7.50
Nƣớc: Đóng vai trò và chức năng quan trọng trong đời sống, chất lƣợng của
cá. Nƣớc tham gia vào phản ứng sinh hoá, vào các quá trình khuếch tán trong cá,
tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển.
Lipid: Cá sử dụng chất béo nhƣ là nguồn năng lƣợng dự trữ để duy trì sự
sống trong những tháng m a đông, khi nguồn thức ăn khan hiếm. Hàm lƣợng lipid
trong cá dao động nhiều (0,1-30%).
Protein: Có thể chia protein của mô cơ cá ra thành 3 nhóm sau:
- Protein cấu trúc: Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin,
chiếm khoảng 70 - 80% tổng lƣợng protein (so với 40% trong các loài động vật có
vú). Các protein này hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá
cao (> 0,5 M). Các protein cấu trúc có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động
của cơ.
- Protein tƣơng cơ: Gồm myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm
khoảng 25-30% tổng luợng protein. Các protein này hòa tan trong nuớc,
trong dung dịch muối trung tính có nồng dộ ion thấp <15M . Đa số
protein tƣơng cơ là các enzyme tham gia vào sự trao đổi chất của tế bào, nhƣ sự
chuyển hoá năng lƣợng trong điều kiện yếm khí từ glycogen thành ATP.
- Protein mô liên kết: Bao gồm các sợi collagen. Chiếm khoảng 3% tổng
lƣợng protein trong cá xƣơng và khoảng 10% trong cá sụn. Có trong mạng luới
ngoại bào, không tan trong nuớc, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ
ion cao.
Protein của cá có thành phần acid amin gần giống protein trong cơ thịt của
động vật có vú, mặc d đặc tính vật lý có thể khác nhau đôi chút. Điểm đẳng điện
(pI) của protein cá vào khoảng pH 4,5 - 5,5. Tại giá trị pH này, protein có độ hòa

22. 12
tan thấp nhất. Giống nhƣ protein trong sữa, trứng và thịt của động vật có vú, protein
trong cá có tất cả các acid amin chủ yếu và có giá trị sinh học rất cao.
Bảng 1.6: Các acid amin chủ yếu (%) trong các protein khác nhau
Acid amin Cá Sữa Thịt bò Trứng
Lysine 8.8 8.1 9.3 6.8
Trytophan 1.0 1.6 1.1 1.9
Histidine 2.0 2.6 3.8 2.2
Phenylalanine 3.9 5.3 4.5 5.4
Leucine 8.4 10.2 8.2 8.4
Isoleucine 6.0 7.2 5.2 7.1
Threonine 4.6 4.4 4.2 5.5
Methionine-cystine 4.0 4.3 2.9 3.3
Valine 6.0 7.6 5.0 8.1
1.2.2 Nƣớc
Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình
thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân tốt nhất là
khoảng 30 – 40% so nguyên với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10%
muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 540
C – 580
C trong suốt thời gian lên men
là 64 – 72 giờ.
1.2.3 Muối
Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc mắm, thiếu
muối nƣớc mắm sẽ không hình thành đƣợc.
Nhờ khả năng hút nƣớc nên muối đƣợc dùng tồn trữ thực phẩm, ức chế đƣợc
vi sinh vật phát triển trong thực phẩm trừ các loại vi sinh vật chịu mặn
Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc mắm phải là muối ăn
(NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn
cao, màu trắng óng ánh, không đóng cục, không có vị đắng chát.

23. 13
1.2.4. Enzyme protease
Quá trình chế biến nƣớc mắm các thành phần cơ thịt cá bị biến đổi mà chủ
yếu là protein bị thủy phân dƣới tác dụng của các enzyme có sẵn trong bản thân cá
thành các sản phẩm trung gian và cuối cùng là các acid amin.
Nhƣ vậy sản phẩm thủy phân của protein là bao gồm các polypeptide,
peptone, peptide và các acid amin. Trong hầu hết các acid amin thu nhận đƣợc khi
thuỷ phân protein đều ở dạng L - α amino acid. Vị của acid amin phụ thuộc vào cấu
trúc không gian, dạng L có vị đắng, dạng D có vị ngọt, còn acid amin có gốc R
mạch vòng có cả vị đắng và vị ngọt.
Quá trình thủy phân là một quá trình phức tạp vì t nh đặc hiệu enzyme chỉ
tác dụng lên một vài cơ chất đặc biệt nào đó và một vài kiểu liên kết nhất định.
-Nhómproteasecótácdụngthủyphânproteinnhƣpepsin,trypsin,papain,bromelin.
- Nhóm peptidase có tác dụng thủy phân các polypeptide, nhóm này gồm các
enzyme nhƣ carboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase.
Sự tham gia của enzyme trong quá trình theo cơ chế xúc tác gồm 3 bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein, bƣớc này
xảy ra nhanh và không bền.
Bƣớc 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ các mối
liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. hi đó phức chất ES đồng thời xảy ra
hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến cực hóa các mối liên kết
tham gia vào phản ứng và sự biến dạng mối hình học của nối liên kết đồng hóa trị
trong phân tử protein cũng nhƣ trung tâm hoạt động của enzyme làm cho quá trình
thủy phân di n ra d dàng hơn.
Bƣớc 3: Giai đoạn tạo thành các acid amin, peptid cấp thấp, giải phóng enzyme.
Các hệ enzyme tham gia vào quá trình chế biến nước mắm
Trong quá trình chế biến nƣớc mắm có rất nhiều hệ enzyme tham gia nhƣng
chủ yếu là hệ enzyme tham gia vào quá trình thủy phân protein, gồm có
metaloprotease và serin-protease, acid protease.
Hệ enzyme Metalo-protease
Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu đƣợc nồng độ cao nên
ngay từ đầu đã hoạt động mạnh và giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme

24. 14
có hoạt t nh khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đâu
là nhóm thủy phân enzyme trung t nh, pH tối th ch từ 5-7.
Hệ enzyme serin-protease
Hệ này tồn tại nhiều trong nội tạng cá, điển hình là enzyme trypsin. Ở giai
đoạn đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm hệ enzyme hoạt động yếu, sau phát triển
dần và đạt giá trị cực đại vào tháng thứ 3 rồi giảm dần đến khi chƣợp ch n. Hệ
enzyme này luôn bị ức chế bởi chuỗi các acid amin trong cấu trúc của enzyme.
Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH 9.
Hệ enzyme acid-protease
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme
này d bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thƣờng nó chỉ tồn tại một thời
gian ngắn ở thời kỳ đầu của quá trình thủy phân. Loại enzym này đóng vai trò thứ
yếu trong quá trình sản xuất nƣớc mắm.
Nguồn thu nhận enz me protease:
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số và một số loại nấm men.
 Vi khuẩn
Lƣợng protease sản xuất từ vi khuẩn đƣợc ƣớc t nh vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lƣợng enzyme đƣợc sử dụng .
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có t nh đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein .
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
Nguy n Trọng Cẩn và cs, 1998 . Các vi khuẩn thƣờng tổng hợp các protease hoạt
động th ch hợp ở v ng pH trung t nh và kiềm yếu.
Các protease trung t nh của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp pH 5-8) và có
khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung t nh tạo ra dịch thủy phân protein thực
phẩm t đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dƣỡng. Các protease

25. 15
trung t nh có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ƣa béo và thơm. Chúng
đƣợc sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số
giống thuộc chi Clostridium.
 Protease của Bacillus ƣa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lƣợng phân
tử từ 20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH
rộng 7-12 . Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn protease đƣợc ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola,
A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum … Các loại nấm mốc này có khả
năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung t nh. Nấm mốc đen tổng hợp
chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác nhƣ: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho
mát.
 Xạ khuẩn
Về phƣơng diện tổng hợp protease, xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu t hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, ngƣời ta cũng đã tìm đƣợc một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao nhƣ: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus...
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn đƣợc biết nhiều là pronase Nhật đƣợc
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc t nh đặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô cũ ,
ngƣời ta cũng tách đƣợc chế phẩm tƣơng tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết đƣợc keratinase thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm đƣợc sản xuất có tên là M-Zim d ng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt t nh elastase cao, do đó chúng đƣợc d ng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết
peptide định trƣớc. Yếu tố tăng cƣờng quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine đƣợc lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.

26. 16
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu th ch hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn d ng trong công nghệ và đời sống. D ng nguồn vi sinh vật có
những lợi ch ch nh nhƣ sau:
+ Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
+ Chu kỳ sinh trƣởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
+ Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme d dàng theo hƣớng có lợi định
hƣớng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi .
+ Giá thành tƣơng đối thấp vì môi trƣờng tƣơng đối rẻ, đơn giản, dể tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trƣờng hợp cần lƣu ý khả năng sinh độc tố gây độc,
gây bệnh để có biện pháp phòng ngừa, xử lý th ch hợp.
1.3. T nh h nh sản xuất nƣớc mắm t cá ở Cát Hải
1.3.1 Khái quát về công nghệ sản xuất nƣớc mắm Cát Hải
Cát Hải đƣợc biết đến là 1 trong 4 vựa mắm nổi tiếng của cả nƣớc: Nha
Trang, Phan Thiết, Phú Quốc, Cát Hải. Nếu nhƣ ba vựa mắm trên sản xuất nƣớc
mắm từ nguồn nguyên liệu ch nh là cá cơm thì Cát Hải lấy cá quẩn, cá nhâm…làm
nguyên liệu. Nƣớc mắm Cát Hải rất đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng địa phƣơng và
các tỉnh lân cận. Nƣớc mắm Cát Hải đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp truyền thống,
sản phẩm của công ty nổi tiếng từ vài chục năm nay với thƣơng hiệu uy tín trên thị
trƣờng. Nƣớc mắm Cát Hải có màu cánh dán, trong, không vẩn đục, m i thơm đặc
trƣng, giàu chất dinh dƣỡng, có vị mặm nhƣng không gắt, hậu vị rõ.
Do quy trình sản xuất nƣớc mắm truyền thống của Việt Nam, với nguồn
nguyên liệu khác nhau cá cơm, cá nục, cá nhâm, cá quẩn… , phƣơng pháp chế biến
khác nhau nhƣ đánh khuấy của Cát Hải (Miền Bắc), gài nén của Phú Quốc (Miền
Nam , đánh khuấy kết hợp với gài nén của Phan Thiết (Miền Trung thì hƣơng nƣớc
mắm của mỗi vùng miền cũng khác nhau.
Công nghệ sản xuất nƣớc mắm Cát Hải là phƣơng pháp đánh khuấy cho
thêm nƣớc lã và cho muối nhiều lần, lại đƣợc phơi nắng (tiếp nhiệt tự nhiên do đó

27. 17
đã phát huy đƣợc tác dụng của enzyme trong cá và enzyme của vi sinh vật trong quá
trình thủy phân, vì vậy thời gian chế biến ngắn hơn so với phƣơng pháp gài nén.
Tuy nhiên, quy trình chế biến nƣớc mắm của Cát Hải vẫn có tồn tại một số
nhƣợc điểm nhƣ sau:
* Về sự thất thoát đạm trong quá trình chế biến:
Quá trình chín của chƣợp là quá trình thủy phân protein nhờ tác dụng của
enzyme để tạo thành peptit đơn giản và axitamin, trong quá trình đó có kèm theo sự
phân hủy tạo thành NH3, Indol, Skatol, Trimethylamin…, đây là các đạm thối bay
hơi chủ yếu là do vi khuẩn gây thối tạo nên. Trong thời gian chế biến ban đầu có
một số đạm của amin bậc 1, 2 và 3 mất đi, sau đó tỷ lệ các đạm thối bay hơi NH3
và các amin) phụ thuộc vào quá trình chế biến. Số liệu phân tích cho thấy: Phƣơng
pháp đánh khuấy Cát Hải tổng lƣợng đạm thối tới 38% so với đạm toàn phần, cao
hơn rất nhiều so với phƣơng pháp gài nén của Phú Quốc (25%), đó là sự tổn thất lớn
trong quy trình chế biến nƣớc mắm cổ truyền. Nguyên nhân làm hao ph đạm của
phƣơng pháp đánh khuấy Cát Hải là do lần đầu cho ít muối, lại cho nhiều lần và cho
thêm nƣớc nên vi sinh vật phát triển tƣơng đối mạnh, đạm mất nhiều. Cần thiết phải
cải tiến quy trình công nghệ mới để hạn chế tổn thất, tăng hàm lƣợng đạm và chất
lƣợng, hƣơng vị của nƣớc mắm Cát Hải.
* Về thiết bị và nhân công:
Phƣơng pháp chế biến đánh khuấy nếu lại cho muối nhiều lần và cho thêm
nƣớc lã nữa thì quá trình chế biến yêu cầu rất cao về kỹ thuật. Công nhân phải có
tay nghề rất cao mới khống chế đƣợc quá trình chế biến tốt, chỉ cần sơ ý là quá trình
thối rữa sẽ xảy ra ngay.
Công nhân phải lao động vất vả nặng nhọc giữa trời nắng. Phƣơng pháp đánh
khuấy thƣờng dùng thiết bị chứa đựng nhỏ nhƣ ang, chum để công nhân thao tác
đƣợc nhẹ nên phải tốn nhiều diện tích mặt bằng sản xuất.
1.3.2 Quy tr nh sản xuất
- Cá + Muối: Cá d ng để làm mắm là các loài cá quẩn, cá nhâm, cá ruội, cá
tạp… Nguyên liệu đƣợc công ty thu mua bằng tàu cá tại các ngƣ trƣờng nên trong
quá trình bảo quản về xƣởng sản xuất có bổ sung thêm muối từ 3-5%.

28. 18
- Trộn muối: Trong quy trình sản xuất nƣớc mắm Cát Hải, tổng lƣợng muối
cho vào đƣợc chia làm 3 lần trong quá trình lên men. Việc cho muối thành nhiều lần
có ý nghĩa rất lớn, cho muối nhiều sẽ làm giảm sự ức chế muối đến quá trình thủy
phân protein cá. Lƣợng muối đƣợc chia cụ thể nhƣ sau.
Lần đầu: cho 10÷12% muối vào m a hè, và 6÷8% muối vào m a đông % so
với nguyên liệu ban đầu . Nếu cá bị ƣơn, ngƣời ta cho thêm 2÷5% để tránh cá bị
thối. Sau khi cho muối vào cá, trộn đều, phủ một lớp muối trên bề mặt cá, sau 24
giờ cho nƣớc vào.
Đối với cá đã đƣợc ƣớp muối sau khi đánh bắt ngoài biển về thì không cho
thêm muối nữa mà chỉ cần cho cá vào các dụng cụ lên men và cho nƣớc vào theo
một tỷ lệ đã quy định.
Sau một tuần lên men, khối cá sẽ chìm xuống. Nếu thấy hiện tƣợng cá nổi
lên trên bề mặt, đó là dấu hiệu thiếu muối, do đó cần bổ sung thêm muối.
Lần 2: Thời gian cho muối lần hai cách lần thứ nhất là 3÷5 ngày với m a hè,
và 5÷7 ngày với m a đông, cho 5÷10 % sau khi trộn đều, khi muối hòa tan xong
cho thêm lớp muối nữa để phủ lên trên. Sau 24 giờ lại trộn lại.
Lần 3: Thời gian cho muối lần thứ ba cách lần hai 2÷3 ngày với m a hè và
4÷7 ngày với m a đông. Số lƣợng muối cho vào lần thứ ba là 8÷10 %.
Lần cho cuối c ng đƣợc t nh sao lƣợng muối trong sản phẩm là 24÷250
Bome (10
Bome = 1% NaCl tinh khiết khuấy đều và phơi nắng liên tục.
Việc cho muối nhiều lần đòi hỏi kinh nghiệm của nhà chế biến phải cao, phải
nhận biết đƣợc thời điểm chƣợp đòi muối để bổ sung muối kịp thời, nếu không
nƣớc mắm d bị hƣ hỏng và tỷ lệ các loại đạm thối cao.
- Bổ sung nƣớc: Việc bổ sung thêm nƣớc vào khối chƣợp có ý nghĩa nhất
định trong sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men và rút ngắn hơn thời gian
chế biến. Tuy nhiên, theo phƣơng pháp này chƣợp phải đƣợc phơi nắng liên tục
trong thời gian chế biến. T y vào nguyên liệu mà việc bổ sung thêm nƣớc nhiều hay
t, nếu nguyên liệu to khó cho việc khuấy đảo thì mới cần bổ sung thêm nƣớc, nếu
nguyên liệu có nhiều nƣớc bổi và nhỏ d quấy đảo thì không cần bổ sung nƣớc.

29. 19
Hình 1.1 Quy trình sản xu t nước mắm Cát Hải – Hải Phòng
Trộn muối lần 1 (10%NaCl)
(Ủ kín từ 2-3 ngày)
Bể xi măng,
ang, chum
Bổ sung 20-30%
nƣớc, kết hợp với
đánh khuấy
Đánh khuấy kết hợp
phơi nắng
Trộn muối lần 2 (10%NaCl)
Trộn muối lần 3 (10%NaCl)
Chăm sóc chƣợp
Đánh khuấy kết hợp
phơi nắng
Chƣợp chín
Đánh khuấy, phơi
nắng
Thời gian 8-10 tháng
Cá + Muối
Kéo rút
Bã chƣợp
Nấu phá bã
éo rút qua bã chƣợp
tốt
Nƣớc muối
Nƣớc hâm đăng
Xác mắm
Thức ăn gia súc
Pha đấu
Nƣớc mắm
chắt
Nƣớc mắm thành phẩm

30. 20
- Chăm sóc chƣợp: Nƣớc mắm Cát Hải đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp
truyền thống quấy đảo là chủ yếu. Việc khuấy đảo sẽ có tác dụng nhiều mặt: Thịt cá
đƣợc đánh tơi, tăng nhanh bề mặt tiếp xúc của thịt cá với hệ enzyme nội tại và
enzyme do vi sinh vật hoạt động. Làm phân phối nhiệt trong khối chƣợp và muối sẽ
tan nhanh trong khối chƣợp.
- Chƣợp chín:
iểm tra bằng cảm quan: khi chƣợp ch n, bã chƣợp nát nhừ nhƣ bột, lắng
chìm, tỏa hƣơng thơm, không còn m i tanh, sắc nƣớc vàng óng.
iểm tra bằng phƣơng pháp hóa học: các tiêu chuẩn của chƣợp ch n:
Độ tan đo bằng pH từ 5,8 - 6,2 hay tính theo lƣợng H2SO4 là trên 3g/L.
- Lƣợng nitơ formol phải từ 50 – 70% so với lƣợng nitơ toàn phần.
- Lƣợng nitơ toàn phần càng cao càng tốt nhƣng phải trên 18g L .
- Lƣợng muối trên 250g L.
- Kéo rút: Chƣợp đƣợc đƣa qua nhà lọc để lấy nƣớc mắm chắt, bã đƣợc đƣa
qua khu nấu cô để nấu phá bã lấy nƣớc mắm thấp đạm.
- Pha đấu: Muốn thu đƣợc nƣớc mắm có hƣơng vị thơm ngon và có nồng độ
đạm nhƣ mong muốn thì phải pha đấu các loại nƣớc mắm có độ đạm khác nhau,
thƣờng pha nƣớc mắm có độ đạm cao với nƣớc mắm có độ đạm thấp thành loại
nƣớc mắm có độ đạm trung bình.
Tiêu chuẩn đánh giá chất lƣợng nƣớc mắm: TCVN 5107:2003.
* Yêu cầu về cảm quan
Bảng 1.7: Yêu c u cảm quan của nước mắm
Tên
chỉ tiêu
Yêu cầu
Đặc biệt Thƣợng hạng Hạng một Hạng hai
Màu sắc Từ nâu cánh gián đến nâu vàng
Độ trong Trong sánh, không vẩn đục
Mùi Thơm đặc trƣng của nƣớc mắm, không có mùi lạ
Vị Ngọt đậm của
đạm, có hậu vị rõ
Ngọt của đạm
có hậu vị
Ngọt của đạm,
ít có hậu vị
Ngọt của đạm,
không mặn chát

31. 21
* Các chỉ tiêu hóa học của nƣớc mắm
Bảng 1.8: Các chỉ tiêu hóa học của nước mắm
Tên chỉ tiêu Mức chất lƣợng
Đặc biệt Thƣợng
hạng
Hạng 1 Hạng 2
Hàm lƣợng nitơ toàn phần, tính bằng
g/l, không nhỏ hơn
30 25 15 10
Hàm lƣợng nitơ amin, t nh bằng phần
trăm so với nitơ toàn phần không nhỏ
hơn Naa Nts) %
55 50 40 35
Hàm lƣợng nitơ amoniac, t nh bằng
phần trăm so với nitơ toàn phần
không lớn hơn
20 25 30 35
Hàm lƣợng axit, tính bằng g/l theo
axit acetic, không nhỏ hơn
8 6,5 4 3
Hàm lƣợng natri clorua, tính bằng g/l 245 – 280 260-295
* Chỉ tiêu vi sinh của nƣớc mắm
Bảng 1.9: Chỉ tiêu vi sinh của nước mắm
Tên chỉ tiêu Mức tối đa cho phép
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 ml 105
2. Coliforms, số khuẩn lạc trong 1 ml 102
3. E. Coli, số khuẩn lạc trong 1 ml 0
4. Cl.perfringens, số khuẩn lạc trong 1 ml 10
5. S. aureus, số khuẩn lạc trong 1 ml 0
6. Tổng số bào tử nấm men và nấm mốc, số khuẩn lạc
trong 1 ml
10

32. 22
1.4. Môt số nghiên cứu về l nh vực sản xuất nƣớc mắm t cá
1.4.1 Nghiên cứu ổ sung protease trong sản xuất nƣớc mắm
Năm 2001, Lopetcharat cho rằng hệ vi khuẩn trong nƣớc mắm đƣợc phân
thành 2 nhóm chính: (1) Vi khuẩn sản xuất các enzyme thủy phân protein nhƣ
Bacillus.sp, Pseudomonassp., Micrococcussp., Staphylococcussp., Halococcussp.,
Halobacterium salinarium; (2)Vi khuẩn có liên quan đến sự hình thành hƣơng vị
đặc trƣng của nƣớc mắm nhƣ Staphylococcussp., Pediococcus halophilus.
Theo Tanasupawat (2006), Namwong (2007) thì nƣớc mắm có chứa nồng độ
muối từ 15-22%, do đó, hệ vi khuẩn đƣợc phân lập từ nƣớc mắm chủ yếu là các loài
ƣa mặn nhƣ halotolerant hoặc halophilic: Tetragenococcusmuriaticus,
Halobacillussp, Lentibacillus halophilus, Lentibacillus salicampi, Lentibacillus
Juripiscarius, Halobacterium halobium, Halococcus thailandensis và Bacillus
vietnamensis.
Ở Đài Loan, Ing-Lung Shih đã nghiên cứu bổ sung enzym proteaza dƣới dạng
koji đậu tƣơng và ang-khak vào phế liệu chế biến cá ngừ (bao gồm: ruột và phủ tạng
cá để sản xuất nƣớc mắm nhằm nâng cao giá trị của cá ngừ và giảm ô nhi m môi
trƣờng (Ing-Lung Shih, 2003).
Ở Nhật Bản, Taniguchi đã bổ sung các enzym thủy phân protein là: proteaza
A, aroase, và papain W40 vào thịt cá và các nội tạng cá để sản xuất nƣớc mắm chất
lƣợng cao. Những thay đổi về thành phần trong quá trình chín của nƣớc mắm đƣợc
kiểm tra. Kết quả cho thấy các mẫu nƣớc mắm bổ sung proteaza A và papain,
những thay đổi về pH và hàm lƣợng axit là tƣơng tự nhau. Sau 120 ngày, giá trị pH
giảm xấp xỉ pH 5,6. Sự khác nhau về tốc độ thủy phân protein cá và sản phẩm thủy
phân phụ thuộc vào loại enzym proteaza bổ sung vào cá. Có thể kết luận rằng, hàm
lƣợng nitơ tổng, hàm lƣợng nitơ amin và tốc độ amin hóa ở mẫu nƣớc mắm bổ sung
enzym là cao hơn mẫu không bổ sung. Đặc biệt, mẫu nƣớc mắm bổ sung enzym
proteaza A, một enzym chịu mặn, tốc độ amin hóa cao nhất và sấp xỉ 62%
(Taniguchi, 2003).
Ở Malaysia, Sim heng Yuen đã nghiên cứu sự thay đổi của vi sinh vật trong
quá trình lên men nƣớc mắm (Budu). Nồng độ vi sinh vật giảm từ 5,13±0,01 xuống

33. 23
3,2 ± 0,02 logCFU/g sau 12 tháng lên men. Các chủng vi khuẩn gram dƣơng
(Micrococcus sp) phát triển mạnh và chiếm ƣu thế trong thời gian đầu của quá trình
lên men, sau đó đƣợc thay thế dần bằng chủng Staphylococcus sp cho đến cuối của
quá trình lên men. Các vi khuẩn ƣa mặn đặc biệt là Micrococcus luteusvà
Staphylococcus arlettae có khả năng phân giải protein và lipid tốt hơn các chủng vi
khuẩn khác (Sim Kheng Yuen (2009).
Ở Việt nam, đã có nhiều nghiên cứu về sử dụng protease trong sản xuất nƣớc
mắm và ứng dụng để sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày. Năm 1964, Nguy n Lân Dũng
và cs đã sử dụng protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae để rút ngắn thời gian sản
xuất nƣớc mắm, nhƣng lại có nhƣợc điểm là không có hƣơng nƣớc mắm Nguy n
Lân Dũng và cs, 1964 ;
Năm 1975, Nguy n Văn Lệ và cs đã nghiên cứu bổ sung protease ngoại bào
của Bacillus pumillus với tỉ lệ 1% so với cá trong quá trình sản xuất nƣớc mắm
làm tăng nhanh quá trình thủy phân, dịch thủy phân thu đƣợc có màu cánh gián, vị
ngọt, m i thơm nƣớc mắm, không có m i lạ, và hàm lƣợng đạm cao hơn mẫu đối
chứng Nguy n Văn Lệ, 1975 .
Sử dụng 0,3% protease từ Bacillus subtilis bổ sung vào chƣợp mắm ở nhiệt
độ 50°C, thời gian chế biến nƣớc mắm rút ngắn còn 10 ngày và 30_35 ngày trong
điều kiện tự nhiên mùa hè (Ngô Thị Mại, Nguy n Thị Dự và cộng sự , 1991. Đặng
Văn Hợp 1996, đã sử dụng 3% protease của nấm mốc Aspergillus oryzae so với
khối lƣợng cá ở nhiệt độ tối ƣu 49 C, đã đó rút ngắn đƣợc thời gian chế biến nƣớc
mắm.
Năm 1993, Nguy n Trọng Cẩn và cs đã nghiên cứu ứng dụng bổ sung canh
trƣờng nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae 29A vào chƣợp để rút ngắn thời gian
chế biến nƣớc mắm. ết quả cho thấy d ng 2,5%-3% canh trƣờng nuôi cấy nấm
mốc Aspergillus oryzae 29A bổ sung vào chƣợp, ở điều kiện pH=6,5-6,8, nhiệt độ
35o
C- 40o
C, tỉ lệ muối ban đầu là 6%, và cứ 3 ngày cho muối 1 lần với lƣợng 3%
cho đến khi đủ muối, kết hợp với đánh khuấy thì sau 15-20 ngày chƣợp đã ổn định,
có thể đem lọc và rút nƣớc mắm. Tuy nhiên nƣớc mắm chƣa có m i vị đặc trƣng,

34. 24
khâu lọc rút nƣớc mắm còn gặp nhiều khó khăn vì chƣợp tạo thành hỗn hợp đặc
nhuy n có độ nhớt cao Nguy n Trọng Cẩn và cs, 1993 .
Năm 1995, Nguy n Thị Dự đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất nƣớc
mắm ngắn ngày bằng enzym proteaza từ Bacillus subtilis. Kết quả là rút ngắn quy
trình sản xuất nƣớc mắm từ 6-8 tháng xuống còn 2 tháng, độ đạm của nƣớc mắm tăng
từ 8,3% lên 20,8%, hiệu suất thu hồi đạm tăng gấp 2 lần, tiêu hao nguyên liệu giảm
13%. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của công nghệ này là giá trị cảm quan thấp, hƣơng
thơm của nƣớc mắm không đạt yêu cầu. Dự án đƣợc triển khai thử nghiệm tại Công
ty Cổ phần Thủy sản Nghệ An (Nguy n Thị Dự, 1995).
Năm 2000, Đặng Văn Hợp đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ chiết xuất
proteaza từ Aspergillus oryzae và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm. Kết quả nghiên
cứu đã tuyển chọn đƣợc chủng nấm mốc sinh tổng hợp proteaza mạnh nhất, xác
định đƣợc điều kiện thu nhận chế phẩm proteaza từ môi trƣờng nuôi cấy và ứng
dụng chế phẩm này vào sản xuất và gây hƣơng đặc trƣng cho nƣớc mắm ngắn ngày
Đặng Văn Hợp, 2000).
Vũ Ngọc Bội 2004 đã nghiên cứu sử dụng protease Bacillus subtilis S5 để
rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá trong chế biến nƣớc mắm từ cá cơm, nƣớc mắm
cao đạm sản xuất bằng protease Bacillus subtilis có hàm lƣợng và thành phần axit
amin cao hơn nƣớc mắm cốt sản xuất theo phƣơng pháp truyền thống.
Lê Văn Việt Mẫn và cs đã nghiên cứu đặc tính của enzym protease từ
Aspergillus oryzae và ứng dụng vào quá trình lên men nƣớc mắm đã kết luận: hàm
lƣợng enzym protease càng nhiều thì tốc độ thủy phân càng nhanh và hàm lƣợng
acid amin đƣợc tạo ra càng cao Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết, 2006).
1.4.2 Nghiên cứu tạo hƣơng nhờ vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm
Nhiều nghiên cứu vai trò vi sinh vật trong quá trình tạo hƣơng nƣớc mắm
bằng cách phân tích các hợp chất bay hơi từ nƣớc mắm (Saisithi và cộng sự;
Melver và cộng sự . Các kết quả nghiên cứu cho thấy hƣơng nƣớc mắm là do ảnh
hƣởng phối hợp của axit bay hơi và các axit không bay hơi tạo ra trong quá trình lên
men, nhờ các chủng vi sinh vật khác nhau

35. 25
Boez và Gullerm 1930 phân lập đƣợc từ nƣớc mắm một loại vi khuẩn kỵ khí
sinh bào tử thuộc nhóm Clostridium, có vai trò tạo hƣơng vị của nƣớc mắm. Fukami
đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Staphylococcus nepalensis để cải thiện hƣơng vị
của nƣớc mắm trong quá trình lên men, đây cũng là chủng tạo hƣơng cho sản phẩm
nƣớc chấm từ mạch nha của Nhật Bản (Fukami, 2004).
Năm 1982, Nguy n Trọng Cẩn và cộng sự đã xác định đƣợc các chủng vi sinh
vật từ các mẫu chƣợp mắm của Việt Nam. Kết quả thu đƣợc 30 chủng vi sinh vật
hiếu khí và 52 chủng kỵ kh . Đặc biệt khi nghiên cứu về m i hƣơng nƣớc mắm thì
nhóm Clostridium kỵ kh có khả năng sinh hƣơng tốt. Trong nhiều nghiên cứu ở
Việt Nam, cho thấy nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí có khả năng tạo hƣơng trong quá
trình lên men nƣớc mắm. Trong đó, có 8 chủng thuộc chi Clostridium có khả năng
tạo hƣơng mạnh. (Nguy n Trọng Cẩn, 1984). Phạm Thu Thủy, Trần Thị Hƣơng
(2005) nghiên cứu bổ sung 3 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium cho thấy
hƣơng nƣớc mắm đƣợc cải thiện rõ rệt.
Năm 2010-2011, Natteewan Udomsil đã nghiên cứu khả năng tạo hƣơng của
vi khuẩn Halophilic, đây là chủng vi khuẩn ƣa mặn và sinh axit lactic đƣợc phân lập
từ chƣợp mắm có thời gian lên men từ 01 đến 12 tháng.
Năm 2013, Nawaporn Lapsongphon đã nghiên cứu ảnh hƣởng của chủng
Virgibacillussp. SK37 ở nồng độ muối khác nhau đến chất lƣợng nƣớc mắm, đặc
biệt là các axit amin tự do và các hợp chất mùi. Kết quả cho thấy mẫu bổ sung
chủng Virgibacillussp. SK37 với 15 và 20% muối thời gian ủ kéo dài đƣợc 3 tháng,
đã làm tăng hàm lƣợng các hợp chất mùi 2-methylpropanal, 2-methylbutanal, 3-
methylbutanal, axit axetic,và axit2-methylpropanoic, đồng thời còn làm cho nƣớc
mắm có màu sắc đặc trƣng Nawaporn Lapsongphon, 2013).
Ở Việt Nam cũng đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về quá trình tạo
hƣơng nhờ vi sinh vật trong quá trình lên men nƣớc mắm.
1.5. Vai trò của vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm
Cá sống và cá chết đều là môi trƣờng rất thuận lợi cho sự phát triển của VSV,
đặc biệt là sau khi chết. Khi cá còn sống cá đã tiếp nhận một lƣợng VSV đáng kể
theo các đƣờng hô hấp, tiêu hóa,.... Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định thành

36. 26
phần hệ vi sinh vật của cá không khác biệt với hệ vi sinh vật của môi trƣờng nƣớc
chung quanh cá sống. Trong các mô và cơ quan của cá tƣơi thƣờng gặp Sarcina
lutea, Sarcina flava, Sarcina alba, Micrococcus flavus, Micrococcus cereus,
proteus vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens
liquefacien, Bacterium pudium, Bacillus megatherium, B. mycoides, B. subtilis, B.
mesentericus, Clostridium putrificus, Aspergiluss niger, Mucor.
Trong quá trình chế biến nƣớc mắm, nhờ khả năng sinh protease của hệ vi sinh
vật trong nội tạng của cá, giúp quá trình thủy phân cá đƣợc nhanh chóng. Có 5
nhóm vi khuẩn tồn tại trong quá trình lên men sản xuất nƣớc mắm: Bacillus,
Coryneform, Streptococcus, Micrococcus và Staphylococcus . Các chủng vi khuẩn
thuộc nhóm Bacillus và Streptococcus tạo nên các loại axit bay hơi cao, góp phần
quan trọng tạo hƣơng vị của nƣớc mắm.
Một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra nhiều axit amin và
ngƣợc lại một axit amin: alanin, methionin, histidin,.. Khả năng sinh tổng hợp axit
amin của VSV rất lớn, vì vậy ta cần sử dụng khả năng này vào trong chế biến nƣớc
mắm để gia tăng giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm.
Nhiều chủng Bacillus có khả năng sinh proteaza đã đƣợc ứng dụng trong sản
xuất thực phẩm. Chi Bacillus là một chi gồm các vi khuẩn hình que, nói chung
Gram dƣơng, hầu hết có khả năng chuyển động, sinh trƣởng hiếu khí hoặc hiếu khí
tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dƣơng t nh, tất cả đều hình thành nội bào tử.
Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ƣa ấm với nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 300
–
450
C. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 650
C. Một số loại ƣa lạnh có thể
sinh trƣởng và hình thành nội bào tử ở 00
C, pH sinh trƣờng rất khác nhau từ 2 - 11.
Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong bảo quản và chế biến đa dạng các
loại thực phẩm lên men. Lên men lactic giúp thực phẩm ngăn chăn sự phát triển của
vi sinh vật gây độc hại cho thực phẩm. Aicd do quá trình lên men tạo ra cũng làm
thay đổi hƣơng của các nguyên liệu ban đầu và cải thiện giá trị dinh dƣỡng.
Bên cạnh vai trò thủy phân nhanh các vi sinh vật trong các có thể gây thối
trong quá trình sản xuất nƣớc mắm. Nếu quá trình chế biến nƣớc mắm có nồng độ
muối thấp, quá trình phân hủy sẽ xảy ra nhanh chóng và tạo các sản phẩm cấp thấp

37. 27
nhƣ: NHR3R, HR2RS, Indol, Scatol, Cadaverin,.. gây thối và làm cho sản phẩm d
bị hƣ hỏng.
Tóm lại, nhiều công trình nghiên cứu về nƣớc mắm trong và ngoài nƣớc đã
đem lại một số kết quả nhằm mục đ ch rút ngắn thời gian chế biến, tăng hàm lƣợng
đạm, tăng hƣơng thơm đặc trƣng của nƣớc mắm. Các công trình nghiên cứu đều
khẳng định vai trò to lớn của các chủng vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm. Vi
sinh vật vừa có vai trò giúp rút ngắn thời gian sản xuất nƣớc mắm, tăng hàm lƣợng
đạm, tạo hƣơng thơm đặc trƣng cho nƣớc mắm.
1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng nƣớc mắm
Chất lƣợng của nƣớc mắm phụ thuộc vào chất lƣợng cá nguyên liệu, tỉ lệ muối
sử dụng, pH môi trƣờng, nhiệt độ môi trƣờng, phƣơng pháp chế biến,... Để tạo đƣợc
nƣớc mắm có chất lƣợng cao, cần lƣu ý các yếu tố ảnh hƣởng trong quá trình chế
biến nƣớc mắm.
1.6.1 Ảnh hƣởng của độ muối
Nồng độ muối d ng để ƣớp cá trong quá trình chế biến ảnh hƣởng lớn đến
chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc.
+ Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh
hơn, chƣợp mau chín, tạo thành acid amin nhiều hơn.
+ Nồng độ muối cao có tác dụng ức chế, làm giảm hoạt tính của enzyme, quá
trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài.
Vì vậy, để chế biến chƣợp nhanh cần xác định lƣợng muối cho vào trong
chƣợp là bao nhiêu và lƣợng muối này vừa đủ ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây
thối, vừa tránh kìm hãm hoạt động của enzyme. Thông thƣờng lƣợng muối cho vào
quá trình lên men khoảng 20 - 25% so với lƣợng nƣớc. Nên thực hiện phƣơng pháp
cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối vào và khoảng cách giữa
các lần cho muối để không ảnh hƣởng đến quá trình lên men. Tỷ lệ muối theo
phƣơng pháp truyền thống là 3 cá : 1 muối.
Nồng độ muối ảnh hƣởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao sẽ ức
chế vi sinh vật phát triển. Còn nồng độ muối thấp thì d dàng phát triển vi khuẩn
gây thối và làm hỏng sản phẩm.

38. 28
Cá càng tƣơi thì độ thấm muối càng nhanh và nhiều hơn so với cá bị ƣơn.
1.6.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ
Bản chất của enzyme là protein nên kém bền với nhiệt, khi tăng hay giảm nhiệt
độ thƣờng ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme. Enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất
ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Với đa số enzyme, vùng nhiệt độ nằm trong khoảng
40 ÷ 50o
C, khi nhiệt độ lớn hơn 70o
C đa số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy 70o
C gọi
là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của
enzyme, nếu nhiệt độ tăng 10o
C thì tốc độ thủy phân của enzyme tăng từ 1,5 - 2 lần.
Với các enzyme bền nhiệt bromelin, papain… nhiệt độ tới hạn có thể cao hơn.
Nhiệt độ thích hợp đối với một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ
chất…
1.6.3 Ảnh hƣởng của pH
pH có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính enzyme vì pH ảnh hƣởng đến mức
độ ion hoá cơ chất, ion hoá enzyme và đến độ bền của protein - enzyme. Mỗi
enzyme chỉ hoạt động ở một vùng pH nhất định gọi là pH tối thích, pH tối thích của
đa số enzyme nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ rất ít enzyme
hoạt động mạnh trong vùng acid hoặc kiềm. Thịt cá có thể bị thủy phân bởi enzyme
protease có sẵn trong thịt cá vì thế chúng ta phải chọn enzyme nào đóng vai trò là
enzyme chính xúc tác cho quá trình thủy phân để tạo môi trƣờng có pH thích hợp
cho nó hoạt động và hạn chế ảnh hƣởng của các enzyme khác. Với từng enzyme,
giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất… thay đổi.
1.6.4 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Khi enzyme protease kết hợp với cơ chất là thịt cá sẽ tạo thành phức trung
gian enzyme - cơ chất. Phức chất này sẽ kéo căng liên kết peptid, chuyển hoá thành
dịch đạm và giải phóng enzyme. Quá trình này cứ tiếp tục xảy ra đến khi cơ chất
hết, nếu nồng độ cơ chất thích hợp với lƣợng enzyme sẽ làm cho quá trình thuỷ
phân di n ra đều đặn, nhanh chóng.
1.6.5 Ảnh hƣởng của diện tích tiếp xúc
Khi thuỷ phân diện tích tiếp xúc giữa enzyme và thịt cá có ảnh hƣởng lớn
đến tốc độ thuỷ phân. Để tạo điều kiện cho enzyme hoạt động tốt ngƣời ta thƣờng

39. 29
xay nhỏ, nghiền nhỏ thịt cá. Khi diện tích tiếp xúc giữa enzyme protease với protein
trong thịt cá càng lớn thì quá trình thuỷ phân càng d dàng và ngƣợc lại.
1.6.6 Ảnh hƣởng của chất hoạt hoá
Chất hoạt hoá là những chất khi có mặt trong phản ứng có tác dụng làm tăng
hoạt tính enzyme. Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim
loại, anion hoặc các chất hữu cơ. Tuy nhiên, các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng trong
một giới hạn nồng độ xác định. Khi dùng quá nồng độ cho phép, hoạt độ của
enzyme sẽ giảm

40. 30
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu chính phục vụ cho quá trình nghiên cứu là các mẫu chƣợp ở các
giai đoạn khác nhau từ Công ty Cổ phần Chế biến dịch vụ Thủy sản Cát Hải, Hải
Phòng
9 mẫu nghiên cứu đƣợc nhận là các mẫu chƣợp lên men nƣớc mắm Cát Hải ở
các tháng thứ 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 12. Tƣơng ứng với các tháng k hiệu là: CHP
01, CHP 02, CHP 03, CHP 04, CHP 05, CHP 07, CHP 10, CHP 11 và CHP 012.
Tại cơ sở sản xuất, mẫu đƣợc lấy bằng dụng cụ vô tr ng và đƣợc đƣa vào các
lọ đựng mẫu vô tr ng. Sau đó, mẫu đƣợc vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm để
đƣợc phân tích thành phần vi sinh.
2.2. Hóa chất và thiết ị
2.2.1 Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất tinh khiết cho
phân tích, cho nghiên cứu về sinh học phân tử hoặc dùng cho thực phẩm có xuất xứ
từ Đức, Nhật, Mỹ, Pháp, Trung Quốc.
2.2.2 Thiết ị dùng trong nghiên cứu
Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm tại Phòng Thí nghiệm Khoa học Biển của
Viện Nghiên cứu Hải sản và Phòng thí nghiệm của Viện Vi sinh vật và Công nghệ
Sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Dụng cụ: Hộp petri, pipet tự động các loại, ống nghiệm, ống eppendorf, cốc
đong, đèn cồn, que cấy, bình tam giác
Thiết bị cơ bản phục vụ thí nghiệm:
Tên thiết bị Hãng sản xuất
- Kính hiển vi Niko, Nhật Bản
- Máy đo pH Thuỵ sỹ
- Tủ ấm, tủ sấy Liên Xô
- Máy đo OD Anh
- Nồi hấp Nhật Bản

41. 31
- Máy li tâm Hettich Zentrifugen - Đức
- Cân điện phân tích Sartorius- Đức
- Lò vi sóng Nhật
- Buồng cấy vô trùng Pháp
- Tủ lạnh Sanyo- Nhật Bản
- Bể ổn nhiệt BW 400 Yamato Scientific- Nhật
- Máy Voltex Nhật
2.3. Môi trƣờng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật
- Môi trƣờng MRS (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L): Proteose
peptone No.3, Cao bò, Cao men, Dextrose, Polysorbate 80, Amonium citrate,
Sodium acetate, Magnesium sulfate, Dipotassium phosphate, nƣớc cất.
- Môi trƣờng MRS có bổ sung 25% muối NaCl: là môi trƣờng MRS đƣợc
pha tƣơng tự nhƣ trên nhƣng có bổ sung thêm 250 gram muối NaCl/lít
- Môi trƣờng NA (Becton, Dickinson and Company, Pháp; g/L): Cao bò,
Peptone, nƣớc cất.
- Môi trƣờng NA có bổ sung 25% muối NaCl: là môi trƣờng NA đƣợc pha
tƣơng tự nhƣ trên nhƣng có bổ sung thêm 250 gram muối NaCl/lít
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1 Định lƣợng và phân lập vi khuẩn hiếu khí tổng số
Cân 10 gram mẫu vào bình tam giác 250 ml chứa 90 ml nƣớc muối sinh lý
NaCl 0,85% . Các thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô tr ng để đảm bảo không
có sự nhi m chéo giữa các mẫu nghiên cứu. Sau đó, bình tam giác đƣợc lắc trên
máy lắc ở tốc độ 220 vòng/phút trong 30 phút để hòa đều mẫu vào trong nƣớc và
giải phóng các tế bào vi khuẩn vào trong nƣớc muối sinh lý. Đặt yên tĩnh bình tam
giác trong 10 phút để lắng xác cá xuống dƣới. Sau đó, nhẹ nhàng hút 1 ml phần dịch
nổi vào ống chứa 9 ml dung dịch nƣớc muối sinh lý và thực hiện các thao tác pha
loãng 10 lần.
Tại các nồng độ pha loãng, cấy 100 µl các dịch pha loãng lên 2 đĩa petri môi
trƣờng NA nguyên bản hoặc môi trƣờng NA có bổ sung 25% muối NaCl. Nuôi cấy
đƣợc tiến hành ở 30o
C trong 3 ngày. Số lƣợng khuẩn lạc mọc trên đĩa sau 3 ngày

42. 32
nuôi cấy đƣợc đếm tại nồng độ pha loãng thích hợp (~ 100 khuẩn lạc đĩa petri . Số
lƣợng vi khuẩn hiếu khí trong 1 gram mẫu nghiên cứu đƣợc tính theo công thức sau:
CFU/ gram mẫu = Số lƣợng vi khuẩn mọc trên đĩa thạch x 10 x hệ số pha
loãng
Trên từng mẫu đất phân lập, chúng tôi tiến hành cấy ria các chủng có các đặc
điểm khác biệt về màu sắc, k ch thƣớc, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuẩn lạc
sang các đĩa môi trƣờng NA khác. Sau 2 ngày nuôi cấy ở 30o
C, khuẩn lạc thuần
mọc trên đĩa thạch đƣợc lƣu giữ và bảo quản ở -70o
C trong môi trƣờng LB dịch thể
(g/l: 10 g tryptone, 5 g cao nấm men, 10 g muối) chứa 20% glycerol.
2.4.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính protease định tính
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng phút với các điều kiện nhiệt
độ, môi trƣờng + 25% NaCl và pH th ch hợp. Sau các khoảng thời gian cần thiết,
lấy dịch li tâm với tốc độ 8.000 vòng phút trong 10 phút. Thu dịch enzyme nhỏ vào
bản thạch chứa cơ chất casein đã khoan lỗ. Đặt trong tủ lạnh 40
C trong 2 h cho
enzym khuếch tán vào thạch, sau đó đặt vào tủ ấm 370
C để enzym hoạt động phân
giải cơ chất. Sau 24 giờ, d ng dung dịch axit acetic 5% nhuộm bản thạch trong 10
phút, và đọc kết qủa. Hoạt t nh protease đƣợc xác định bằng k ch thƣớc vòng phân
giải D-d, mm , trong đó, D là k ch thƣớc vòng phân giải, d là k ch thƣớc lỗ đục.
2.4.3 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng định tính
Lấy 400g cá xay nhỏ, thêm muối 10% cho vào bình tam giác 500ml, nút k n,
gói giấy k n để ở nhiệt độ thƣờng 4 ngày, đƣa vào điều kiện tối ƣu 500
C trong 2
ngày, bổ sung vi sinh vật đã tuyển chọn 105
CFU/g. Sau mỗi 3 ngày bổ sung muối
một lần (mỗi lần 5%) cho đến tổng khối lƣợng muối đủ 25%.
Tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu: H0 (mẫu đối chứng) không bổ sung vi
khuẩn; Mẫu H5 - bổ sung vi khuẩn H5; Mẫu H10 - bổ sung vi khuẩn H5 và Mẫu
H12 - bổ sung vi khuẩn H12. Sau 90 ngày Chƣợp chín, tiến hành đánh giá cảm quan
m i nƣớc mắm theo 5 cấp bậc.
Điểm Yêu cầu
4 Sản phẩm có mùi thơm đặc trƣng của nƣớc mắm

43. 33
3 Sản phẩm có m i thơm nhẹ của nƣớc mắm
2 Sản phẩm có m i thơm nhẹ của nƣớc mắm, có m i lạ
1 Sản phẩm không có m i thơm nƣớc mắm, không có mùi lạ
0 Sản phẩm có mùi hôi thối, m i lạ, hƣ hỏng
2.4.4 Giải tr nh tự đoạn ARNr 16S
Tách ADN vi khuẩn
ADN của các chủng vi khuẩn đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Gabor
và cộng sự (2003) với một số bƣớc cải biến để phù hợp với điều kiện phòng thí
nghiệm. Đầu tiên, các chủng vi khuẩn giữ trong ống lạnh sâu đƣợc cấy ria trên môi
trƣờng NA. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 300
C, dùng que cấy lấy một vài khuẩn lạc thuần
khiết mọc trên thạch vào các ống 1,5 ml chứa 200 µl đệm phá tế bào (100 mM Tris
HCl, 100 mM Na2EDTA, 1,5 mM NaCl, pH 8.0), 10 µl lysozyme (50 mg/ml) và 10
µl proteinase K (10 mg/ml). Hỗn hợp đệm này đƣợc ủ ở 370
C trong 30 phút. Sau
khi bổ sung thêm 50 µl SDS 10%, hỗn hợp này đƣợc ủ thêm ở 560
C trong 2 tiếng
nhằm phá vỡ hoàn toàn tế bào và giải phóng ADN vào đệm chiết. Bổ sung một
lƣợng tƣơng đƣơng ~ 250 µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (49: 1) vào hỗn
hợp đệm chứa các tế bào đã bị phá vỡ, lắc nhẹ nhàng trong một phút sau đó ly tâm
15000 vòng/phút trong 7 phút. Hút khoảng 200 µl phần dịch trong phía trên có chứa
ADN sang ống 1,5 ml mới. Thêm 0,6 lƣợng thể tích isopropanol lạnh vào ống này
và ủ ở -200
C trong 1 tiếng để ADN d dàng kết tủa. Tiến hành ly tâm ở 15000
vòng phút để thu hồi ADN kết tủa. Rửa tủa bằng cồn lạnh 700
C và hòa tan ADN
vào 200 µl đệm TE (10 mM Tris HCl, 0,1 mM Na2EDTA). Cất giữ ADN ở -200
C
cho đến khi sử dụng.
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADNr 6S
Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADNr 16S đƣợc tiến hành trong thể tích 25 µl
chứa các chất phản ứng sau: 1X đệm PCR, 1 U TaKaRa Ex Taq polymerase
(Katara), 125 µM mỗi loại dNTP, 400 nM mồi 27F (5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 400 nM mồi 1525R (5'-
AAAGGAGGTGATCCA GCC-3' và 1µl ADN đã tách chiết nhƣ đã miêu tả ở trên.

44. 34
Sau khi biến tính ADN ở 95o
C trong 5 phút, phản ứng khuếch đại gen đƣợc thực
hiện trong 35 chu trình, với mỗi chu trình nhiệt đƣợc cài đặt nhƣ sau: 95o
C trong 30
giây để biến tính tách mạch ADN, 55o
C trong 30 giây để gắn mồi, 72o
C trong 1
phút 45 giây để khuếch đại gen. Sản phẩm PCR với k ch thƣớc 1499 bp đƣợc điện
di và kiểm tra trên gel agarose 1% có bổ sung với chất phát huỳnh quang Redsafe
(Intron Biotechnology).
Giải trình tự đoạn ADNr 6S
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng kit Qiaquick của hãng Qiagen. Nồng
độ ADN tinh sạch đƣợc đo trên máy quang phổ tại bƣớc sóng 260 nm. Với mỗi
phản ứng giải trình tự, 20 sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc đƣa vào các phản ứng
khuếch đại sử dụng kit Bigdye® terminator v3.1 theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất
(Applied Biosystem). Với mỗi sản phẩm PCR, trình tự đoạn ADNr 16S đƣợc phân
tích với 2 mồi riêng biệt: mồi 518F 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’ và
mồi 800R 5’-TACCAGGGTATCTAATCC-3’ . Trình tự ADN đƣợc đọc trên máy
giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP-6 polymer. Sắc đồ trình tự
đƣợc kiểm tra và chỉnh sửa trên phần mềm Chromas lite 2.1. Trình tự của 2 mồi
518F và 800R đƣợc kết nối trên phần mềm Clone Manager. Mức độ tƣơng đồng về
trình tự gen mã hóa riboxôm 16S của chủng nghiên cứu so với các chủng đã công
bố trên ngân hàng gen đƣợc so sánh sử dụng công cụ tra cứu BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mức độ tƣơng đồng cao nhất về trình tự
đoạn ADNr 16S của chủng nghiên cứu so với các chủng chuẩn đã công bố đƣợc tra
cứu sử dụng công cụ Eztaxon phiên bản 2.1.

45. 35
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sự iến động mật độ vi khuẩn ở chƣợp mắm trong các giai đoạn lên men
khác nhau
Từ 9 mẫu nghiên cứu đƣợc nhận là các mẫu chƣợp lên men nƣớc mắm Cát
Hải ở các tháng thứ 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 12. ết quả định lƣợng vi sinh vật trên 2
loại môi trƣờng nuôi cấy NA và NA 25% NaCl (Hình 3.1); môi trƣờng MRS và
MRS 25% NaCl Hình 3.2). Với 2 loại môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung thêm 25%
muối NaCl kết quả nghiên cứu cho thấy, trong chƣợp mắm mật độ vi khuẩn cao
nhất ở tháng thứ 1 đạt 4,3 x 105
; chƣợp mắm ở tháng thứ 11 và 12 có mật độ vi
khuẩn thấp nhất khoảng 2,5 x 104
. Ở các tháng 2, 3, 4, 5, 7, 10 không có sự khác
biệt về số lƣợng khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng nguyên bản cũng nhƣ môi trƣờng
có bổ sung với 25% NaCl. Điều đó chứng tỏ, các chủng vi khuẩn lên men trong các
mẫu chƣợp là những chủng có khả năng chịu nồng độ muối cao. Các chủng không
có khả năng chịu muối có thể đã bị đào thải trong quá trình lên men chƣợp.
Số lƣợng vi khuẩn hiếu kh đƣợc ghi nhận và phân t ch trên môi trƣờng nuôi
cấy NA nguyên bản và môi trƣờng NA có bổ sung với 25% muối NaCl. Số lƣợng tế
bào vi khuẩn cao nhất là ở tháng thứ 1 đạt tới 105
CFU gram chƣợp , sau đó số
lƣợng tế bào duy trì đều ở các tháng lên men tiếp theo và chỉ đạt nồng độ ở khoảng
104
CFU/ gram chƣợp (Hình 3.1).

46. 36
Hình 3.1. Sự iến động mật độ vi khuẩn hiếu khí trong mẫu chượp ở các
giai đoạn lên men khác nhau trên môi trường NA v môi trường NA +25% NaCl.
Sự thay đổi số lƣợng vi khuẩn này cũng tƣơng tự nhƣ sự thay đổi số lƣợng vi
khuẩn trong quá trình lên men nƣớc mắm cá ở một số nƣớc trong khu vực (Zaman
và cs., 2011). Tuy nhiên, so với nhiều sản phẩm lên men truyền thống khác thì số
lƣợng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu chƣợp lên men thƣờng t hơn rất nhiều.
Số lƣợng vi khuẩn phát triển trong điều kiện yếm kh cao nhất ở chƣợp mắm
lên men tại tháng thứ nhất, sau đó giữ số lƣợng ổn định từ tháng 2 cho đến 10, và có
chiều hƣớng giảm dần ở những tháng sau. So với nhiều sản phẩm lên men truyền
thống khác thì số lƣợng vi khuẩn lactic trong mẫu chƣợp lên men cũng rất ít, chỉ
dao động xung quanh khoảng 104
CFU gram chƣợp trong các tháng lên men và có
xu hƣớng giảm đến 103
CFU gram chƣợp ở các tháng cuối (Hình 3.2).
NA + 25%

47. 37
Hình 3.2 Sự iến động mật độ vi khuẩn hiếu khí trong mẫu chượp ở các
giai đoạn lên men khác nhau trên môi trường MRS v môi trường MRS + 25%
NaCl.
Do không có sự khác biệt nhiều về số lƣợng vi khuẩn giữa môi trƣờng
nguyên bản và môi trƣờng bổ sung 25% NaCl, chúng tôi đã lựa chọn môi trƣờng có
bổ sung muối cho các nghiên cứu tiếp theo.
Dựa vào màu sắc, k ch thƣớc, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuẩn lạc,
chúng tôi tiến hành đếm các loại khuẩn lạc khác nhau mọc trên môi trƣờng nuôi cấy
(Bảng 3.1). Trên cả 2 loại môi trƣờng NA và MRS có bổ sung 25% NaCl, số lƣợng
các loại khuẩn lạc ở những tháng đầu lên men chƣợp là nhiều hơn so với những
tháng tiếp theo sau đó.
Ở mẫu chƣợp lên men 1 tháng có 13 loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí và sau
đó giảm dần xuống còn 4 đến 5 loại khuẩn lạc ở mẫu chƣợp lên men 11 hoặc 12
tháng.
MRS + 25%

48. 38
Hình 3.3 Hình ảnh số lượng và các loại khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí mọc
trên môi trường NA + 25% NaCl. Hình ảnh chụp từ cùng nồng độ pha loãng
mẫu ở chượp lên men ở tháng A v chượp lên men tháng 12 (B).
Tƣơng tự, tháng đầu chƣợp lên men có 5 loại vi khuẩn mọc trên môi trƣờng
MRS có bổ sung 25% NaCl, sau đó số lƣợng này chỉ giảm xuống còn là 2 ở các
tháng cuối của quá trình lên men chƣợp. Điều đó cũng nói lên rằng, loài vi khuẩn
nào có khả năng sinh trƣởng trong điều kiện muối cao, thích ứng với nguồn dinh
dƣỡng sẵn có trong chƣợp thì sẽ là loài chiếm ƣu thế. Loài chiếm ƣu thế này sẽ là
loài quyết định hình thành chất lƣợng hƣơng vị của sản phẩm nƣớc mắm.
ết quả nghiên cứu ở các giai đoạn lên men khác nhau, chúng tôi đã thu
nhận đƣợc 87 chủng vi khuẩn, trong đó có 60 chủng vi khuẩn hiếu kh sinh trƣởng
trên môi trƣờng NA 25% NaCl và 27 chủng vi khuẩn sinh trƣởng kỵ khí trên môi
trƣờng MRS có bổ sung 25% muối NaCl.
A) B)

49. 39
Bảng 3.1. Số lượng các loại khuẩn lạc quan sát trên các môi trường NA
NaCl v MRS NaCl
Mẫu
Số lƣợng chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau
Môi trƣờng NA + 25% NaCl Môi trƣờng MRS + 25% NaCl
CHP 01 13 5
CHP 02 10 4
CHP 03 8 3
CHP 04 8 4
CHP 05 7 2
CHP 07 5 3
CHP 10 4 2
CHP 11 4 2
CHP 12 5 2
Tổng số 60 27
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính cao
3.2.1 Sàng lọc các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính protease trong các
chƣợp lên men nƣớc mắm
Từ 87 chủng vi khuẩn phân lập từ các tháng khác nhau ở các chƣợp mắm
khác nhau, chúng tôi xác định khả năng sinh enzyme protease định tính bằng
phƣơng pháp đục lỗ.
Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy, có 7/87 chủng có khả năng sinh
protease cao (D-d> 25 mm) chiếm 8%; 30/87 chủng có khả năng sinh protease ở
mức trung bình (10<D-d<25 mm) chiếm 34%; 44/87 chủng sinh protease yếu (D-
d<10 mm) chiếm 50%; còn lại 6/87 chủng không có thể hiện hoạt tính protease
chiếm 8%.

50. 40
Trong số 7 chủng có hoạt tính protease cao, chúng tôi lựa chọn ra 2 chủng vi
khuẩn có hoạt tính protease mạnh nhất và có khả năng sinh trƣởng mạnh trên môi
trƣờng có nồng độ muối cao, k hiệu M1 và M2 cho nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.4. Khả năng sinh protease của 87 chủng vi khuẩn phân lập từ chượp
mắm
Hình 3.5. Khả năng sinh protease của một số chủng vi khuẩn hoạt t nh cao

51. 41
Bảng 3.2. Một số chủng vi khuẩn c hoạt t nh protease cao nh t
TT Kí hiệu chủng Hoạt tính protease
(D-d) mm
1 M1 29,3±0,7
2 M2 28,0±0,6
3 M3 27,6 ±0,7
4 M4 26,5±0,5
5 M5 26,0±0,7
6 M6 25,4±0,6
7 M7 25,0±0,5
3.2.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn yếm khí chịu mặm có khả năng sinh hƣơng
trong các chƣợp lên men nƣớc mắm
Từ các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về khả năng tạo hƣơng nƣớc
mắm do các chủng vi khuẩn yếm kh thuộc nhóm Clostridium, Bacillus hoặc các vi
khuẩn Lactic (Boez và Gullerm (1930), Natteewan Udomsil (2011) Nguy n Trọng
Cẩn và cộng sự 1984 Vũ Ngọc Bội (2004), Phạm Thu Thủy, Trần Thị Hƣơng
2005 ,... Chúng tôi thử nghiệm sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo hƣơng
đặc trƣng từ các chủng vi khuẩn yếm kh đã phân lập đƣợc.
Từ các chủng vi khuẩn yếm kh phân lập đƣợc với môi trƣờng MRS = 25% +
NaCl từ các tháng khác nhau ở các chƣợp mắm khác nhau, chúng tôi xác định định
t nh khả năng sinh hƣơng bằng phƣơng pháp cảm quan.
Trong 27 chủng vi khuẩn yếm kh phân lập đƣợc lựa chọn 3 chủng tiêu biểu:
là các chủng phát triển và có mặt trong các mẫu chợp mắm ở các tháng 5, 7, 10, 11
và tháng 12. Các chủng nghiên cứu đƣợc lựa chọn có đặc điểm hình thái khuẩn lạc
khác nhau, k hiệu là H5, H10 và H12
Tiến hành th nghiệm với 4 mẫu: H0 mẫu đối chứng không bổ sung vi
khuẩn; Mẫu H5 - bổ sung vi khuẩn H5; Mẫu H10 - bổ sung vi khuẩn H5 và Mẫu
H12 - bổ sung vi khuẩn H12. Sau 90 ngày, tiến hành đánh giá sơ bộ cảm quan mùi

52. 42
nƣớc mắm theo 5 cấp để lựa chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng số phiếu
đánh giá 10 .
ết quả nghiên cứu sàng lọc chủng vi khuẩn có khả năng sinh hƣơng trong
quá trình lên men chƣợp mắm đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
ảng 3. Đánh giá cảm quan các mẫu nghiên cứu
Mẫu M i
sản phẩm
Điểm đánh giá Trung
bình
No1 No2 No3 No4 No5 No6 No7
Đối
chứng
(H0)
Sản phẩm có
m i hôi thối
0 0 0 0 0 0 0 0
H5 M i thơm nhẹ
của nƣớc
mắm, có m i
lạ
2 2 2 3 2 2 2 2,14
H10 M i thơm nhẹ
của nƣớc mắm
3 3 3 3 3 3 3 3,0
H12 M i thơm nhẹ
của nƣớc mắm
3 4 3 3 3 3 4 3,4
Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc, chúng tôi lựa chọn 2 chủng vi khuẩn có
khả năng tạo hƣơng cho nƣớc mắm là chủng H10 và chủng H12 cho các nghiên cứu
tiếp theo.
3.2.3. Định tên đến loài các chủng vi khuẩn chịu mặn có hoạt tính cao phân
lập đƣợc t các chƣợp lên men nƣớc mắm ng k thuật phân t
Định tên đến loài các chủng vi sinh vật để lựa chọn đƣợc các chủng vi khuẩn
có hoạt tính cao, an toàn với ngƣời và động vật. Từ đó, lựa chọn các chủng vi khuẩn
chịu mặn có hoạt t nh enzyme protease cao, khả năng tạo hƣơng tốt, góp phần rút
ngắn thời gian sản xuất nƣớc mắm, nâng cao m i hƣơng đặc trƣng và chất lƣợng
của nƣớc mắm.

53. 43
Căn cứ vào kết quả định tên đến loài để loại bỏ đƣợc các chủng vi khuẩn có
hoạt tính enzyme cao thuộc nhóm vi sinh vật có hại, không đƣợc phép sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản.
Trên cở sở phân loại sơ bộ bằng hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh hóa với
bộ kít API 20E, API 50CHB. Các chủng vi khuẩn probiotic đã lựa chọn đƣợc tiếp tục
định tên đến loài bằng kỹ thuật phân tử. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu,
đã nhân đƣợc đoạn 16S rARN của các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn. Phân tích trình
tự gen 16S rARN của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, so với trình tự đoạn 16S rARN
trên GenBank, bằng chƣơng trình BLAST NCBI cho thấy các chủng vi khuẩn nghiên
cứu có độ tƣơng đồng cao về đoạn 16S rARN của nhiều loài vi khuẩn thuộc chi
Bacillus và chi Lactobacillus.
Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa 16S rARN từ ADN
tổng số.
Trình tự đoạn gen 6S rARN của chủng M
- Chủng M1 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens
subsp. amyloliquefaciens MN 01
- Chủng M2 tƣơng đồng 99% với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis strain
DSM 10 (NR 027552.1)
- Chủng H10 tƣơng đồng 98% với Lysinibacillus paraplantarum
- Chủng H12 tƣơng đồng 99% với Lysinibacillus pakistanensis MN 21

54. 44
a) Chủng vi khuẩn M1
Hình thái
+ Khuẩn lạc: Sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng NA 0,5% NaCl, khuẩn lạc
có hình dạng không xác định, dẹt, màu trắng đục, bề mặt không nhẵn và không
bóng, mép khuẩn lạc dạng tua, k ch thƣớc 1,5 – 4 mm.
+ Tế bào: Sau 1 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng NA 0,5% NaCl, tế bào có
dạng hình que, tồn tại đơn lẻ, k ch thƣớc (0,5-0,6) x (2-2,5) µm.
Đặc điểm sinh hóa: Chủng M1 có khả năng đồng hóa tốt 17 loại đƣờng là glycerol,
D - glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, N -
acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D - cellobiose, D - maltose,
sucrose, D - trehalose, amidon (tinh bột), glycogen và gentiobiose; L - arabinose, D
- ribose, D – xylose và D - lactose; lên men 21 loại đƣờng trên tổng số 49 loại
đƣờng thử nghiệm để tạo thành axit là glycerol, L - arabinose, D - ribose, D -
xylose, D - glucose, D - fructose, inositol, D - mannitol, D - sorbitol, N -
acetylglucosamine, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, D - cellobiose, D - maltose,
D - lactose, sucrose, D - trehalose, D -raffinose, amidon (tinh bột), glycogen và
gentiobiose.
Chủng M1 sinh trƣởng tốt trong giải nhiệt độ 25o
C - 50o
C với khoảng nhiệt
độ tối ƣu là 35o
C - 45o
C; pH 5,0 - 9,0 với pH tối ƣu là 7,0; và nồng độ NaCl 1,0 -
12,0%. Trên thanh thử API ZYM, chủng M1 có khả năng sinh esterase C 4 ,
esterase lipase C 8 , lipase C 14 , acid phosphatase và α - glucosidase.
Hình 3.7. Khuẩn lạc và tế bào chủng M1. Khuẩn lạc chụp sau 48 giờ nuôi c y, tế
bào chụp sau 24 giờ nuôi c y