Документ представляет собой анализ биоинформатических аспектов полноэкзомного секвенирования, включая важность контроля качества, методы обработки и аннотацию значимости генетических вариаций. Рассматриваются различные технологии и их эффективность в оценке экзомов, а также сравнительные характеристики методов обогащения. Заключение подчеркивает необходимость сотрудничества с биоинформатиками и постоянного обмена информацией для достижения лучших результатов.

1. Биоинформатический анализ данных
полноэкзомного секвенирования:
анализ качества экспериментов, корректное определение,
и аннотация значимости вариантов
23 апреля 2016
Александр Предеус
Институт Биоинформатики, Санкт-Петербург

2. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

3. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

4. Ресеквенирование ДНК
● Таргетная панель (1-500 генов)
● Клинический экзом (5000 важных генов) - CES
● Полный экзом (20000 генов) - WES
● Полный геном - WGS

5. Ресеквенирование ДНК
● Таргетная панель (1-500 генов)
● Клинический экзом (5000 важных генов) - CES
● Полный экзом (20000 генов) - WES
● Полный геном - WGS

6. Зачем делать (полно)экзомное секвенирование?
● Дешевле, чем WGS (x2-x3)
● Количество экспериментов в запуске (x10+)
● Трудозатраты на обработку и хранение
● Трудозатраты на интерпретацию

7. WES vs WGS в клинике - опыт Broad Institute
● WES является оптимальной стратегией при подозрении на моногенно
наследуемые заболевания неясной презентации
● Если диагноза не находится - WGS часто находит структурные варианты
● В онкологических заболеваниях - сразу WGS + RNA-seq

8. Приготовление библиотек и обогащение
● Пробоподготовка - много разных методов и
производителей (Nextera, TrueSeq, NEB, etc etc)
● Обогащение - Agilent, Roche, Illumina
● Фрагментация ДНК - очень важна

9. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

10. Основные пайплайны
● GATK - Broad institute
● Samtools
● Freebayes
● другие
● Выравнивание
● Маркировка дупликатов
● Перевыравнивание инделов
● BQSR
● Гаплотипирование
● Генотипирование
● Фильтрация
● Аннотация
● Оценка значимости
● Интерпретация

11. Выравнивание и подготовка
● Правильная программа для выравнивания - bwa mem
● Маркировка дубликатов
● Перевыравнивание инделов
● Рекалибрация качеств определения оснований (BQSR)

12. Определение вариантов
● Важно: коллинг в когорте (30+ экспериментов на максимально этнически
близких донорах)
● Важно: аллельная частота - не табличная, а по вашей когорте!
● Фильтрация ложноположительных результатов (“около 20к вариантов на
экзом белого европейца”)

13. Аннотация и интерпретация
● Самая трудная и неоднозначная часть
● Все аннотации из баз (OMIM, ClinVar, другие)
● Все предикторы (Polyphen, SIFT, MutPred)
● Внимание на
○ Фазирование/генотип родителей
○ Фенотип (гены-кандидаты)
○ Анализ частоты
○ Покрытие
○ Многое другое

14. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

15. Наши данные
● Сейчас - более 60 экзомов (здесь представлены около 20)
● Обогащение - Roche MedExome, Illumina RapidCapture
● Приготовление - Nextera, TrueSeq
● Ряд библиотек сделан по смешанным протоколам (2 пары идентичных
образцов)

16. Глубина
библиотек
● 1-2 lanes of HiSeq
● 50-150М
● 100-125bp PE

17. Процент прочтений попавших на экзом
● Слабо зависит от
платформы
● Сильно зависит от
глубины
библиотеки

18. Охват экзомных интервалов
● Заявленные интервалы -
около 45 Мб
● Эмпирические интервалы -
около 65 Мб
● Все статистики расчитаны
от заявленных интервалов

19. Распределение регионов по покрытию
● Считая 20х
минимальным
необходимым
покрытием - 72-90%
● Учитывая падение
селекции - можно
найти оптимальную
глубину

20. “Плохие” варианты
● Количество намного
ниже в образцах
приготовленных по
технологии Roche
● Впрочем, низкая
глубина библиотеки
намного критичнее

21. Illumina vs. Roche
● Illumina дает
более высокое
пиковое
покрытие
● Roche дает
более
равномерное
покрытие

22. Пример критичного отличия
● Варианты на
краях экзонов
оказываются
хуже покрыты
в Illumina
● При падении
покрытия
эффект
драматизуется

23. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

24. Фрагментация
● FastQC - по прежнему
важнейшая программа
● Соникация лучше
транспозазы

25. QC3
● Специальная утилита
для DNA-seq QC
● Полезные
корреляционные оценки
● Нашли идентичные
образцы
● ..и родственников :)

26. Метод оценки загрязнения
человеческих образцов

27. Результат - все хорошо!

28. Содержание
● Особенности экзомных экспериментов
● Обработка экзомов: что важно, а что нет?
● Сравнение различных методов обогащения
● Контроль качества экзомных экспериментов
● Выводы (на сегодняшний день)

29. Работайте с связке с биоинформатиками!
● Постоянная коммуникация
● Интерес к рабочему процессу друг друга
● Новые методы - потому устоявшихся решений не существует

30. Благодарности
● Юрий Барбитов
● Андрей Глотов
● Олег Глотов
● Елена Жукова
● РЦ "Центр Биобанк" НП СПбГУ
● Институт Биоинформатики

31. Спасибо за внимание!