Download as PDF, PPTX
Uploaded byBioinformaticsInstitute
Nanopores sequencing
Документ охватывает методы секвенирования с использованием нанопор, включая их преимущества и недостатки по сравнению с традиционными методами, такими как Sanger и NGS. Также рассматривается секвенирование белков и сложности, связанные с анализом белковых последовательностей. Включены данные о стоимости оборудования и точности секвенирования, а также различные подходы к обработке полученных сигналов.
Nanopores sequencing
- 1. Секвенирование нанопорами Михаил Колмогоров University ofCalifornia San Diego Институт биоинформатики, Санкт-Петербург, 2016
- 2. Методы секвенирования ● Sanger ○Риды длиной < 1000 ○ Малый выход эксперимента => дорого ● NGS ○ Illumina, 454, Ion torrent ○ Большой выход, но риды короче (50-500) ● Pacific Biosciences ○ Риды средней длины 15,000 ○ 11-15% ошибок ○ Дорогой секвенатор/химия
- 3. Методы секвенирования ● Текущиетехнологии: ○ Клонирование ○ Амплификация ○ Дорогостоящие энзимы ● Основаны на физических и химических особенностях цепочек ДНК
- 4. Методы секвенирования ● Текущиетехнологии: ○ Клонирование ○ Амплификация ○ Дорогостоящие энзимы ● Основаны на физических и химических особенностях цепочек ДНК ● Физические различия между отдельными нуклеотидами?
- 5. Секвенирование наносенсорами: идея ●Макромолекула проходит через пору ● Транслокация модулирует сигнал, который можно детектировать
- 6. Различные типы наносенсоров ●Биологические ○ -hemolysin (1.4 nm) ● Искуственные (solid-state) ○ До 0.5 nm в диаметре
- 7. Методы детектирования сигнала ●Молекула блокирует ионный ток через пору ● Помещается несколько нуклеотидов Branton et al., 2008
- 8. Методы детектирования сигнала ●Нуклеотиды отрезаются экзонуклеазой Branton et al., 2008
- 9. Методы детектирования сигнала ●Поперечный туннелирующий ток Branton et al., 2008
- 10. Дополнительные сложности ● Денатурация/ расплетение ДНК ● “Протягивание” через пору ● Контроль скорости транслокации
- 11. Oxford Nanopores: MinION ●Первый коммерческий секвенатор на основе нанопор ● Стоимость ○ 1000$ - секвенатор ○ Дополнительные наборы пор - 500$ - 900$ ○ 90$ - реагенты на ран ● Выход: 500Mb - 1Gb на пору Image by Oxford Nanopores
- 12. MinION ● Пора наоснове CsgG из E. Coli ● “Heaviliy engineered motor enzyme” ○ Замедление с 106 до 200 баз в секунду Image by Oxford Nanopores
- 13. MinION II Image byOxford Nanopores
- 14. 2D чтение Image byOxford Nanopores
- 15. От сигнала кДНК ● Как декодировать сингал с поры? University of Washington
- 16. От сигнала кДНК ● Как декодировать сингал с поры? ○ Фрагментация на отдельные события University of Washington
- 17. От сигнала кДНК ● Как декодировать сингал с поры? ○ Фрагментация на отдельные события ○ Каждому событию соответсвует k-мер University of Washington Timp et al., 2012
- 18. Алгоритм Витерби ● Состояния- все возможные 3-меры ● Наблюдения - фрагментированный сигнал ● Разреженная матрица переходов: только перекрывающиеся 3-меры Timp et al., 2012
- 19. De Novo сборка:Nanocorrect + Celera ● Две итерации коррекции ошибок ● Celera ● Nanopolish Loman et al., 2015
- 20. De Novo сборка:ABruijn ● Сборка сырых ридов, без коррекции ошибок ● Риды перекрываются с помощью A-Bruijn графа ● Коррекция ошибок уже собранного генома Lin et al., 2016
- 21. Стоимость секвенирования ● MinION- 500$ за 1 Gb?
- 22. Oxford Nanopores: MinION ●Ошибки: 13-19% (до 5% 2D R9) ● Проблемы с гомополимерами ● Сборка E. Coli в одну хромосому, точность 99.5% ● Поиск структурных вариаций / SNP
- 23.
- 24. Два нобелевских призаФредерика Сэнгера 1977: ДНК секвенирование
- 25. Два нобелевских призаФредерика Сэнгера 1958: Секвенирование белков 1958: Секвенирование белков - сложно, ДНК - невозможно Today: Секвенирование белков - сложно, ДНК- тривиально 1977: ДНК секвенирование
- 26. Зачем секвенировать белки? ●Белки, не закодированные явно в геноме (антитела) ● Короткие гены которые сложно предсказать ● Пост-трансляционные модификации и мутации ● ... Image from http://www.novimmune.com/science/antibodies.html
- 27. История секвенирования белков Edman degradation Firstprotein sequencing technique 1950s 1980s 2000s now Nobel prize 1958
- 28. История секвенирования белков Bottom-upmass spectrometry Proteins digested into peptides ~15 aa Edman degradation First protein sequencing technique 1950s 1980s 2000s now Nobel prize 2002 Nobel prize 1958
- 29. Top-down mass spectrometry Intact proteinsof length ~100aa Bottom-up mass spectrometry Proteins digested into peptides ~15 aa Edman degradation First protein sequencing technique 1950s 1980s 2000s now Nobel prize 2002 Nobel prize 1958 История секвенирования белков
- 30. История секвенирования белков Top-downmass spectrometry Intact proteins of length ~100aa Bottom-up mass spectrometry Proteins digested into peptides ~15 aa Edman degradation First protein sequencing technique Nanopore sequencing? 1950s 1980s 2000s now Nobel prize 2002 Nobel prize 1958
- 31. Сложности анализа белков ●Амионкислоты меньше нуклеотидов ● Проведение через пору ○ Энзимы для ДНК не работают ○ Неравномерный зарад вдоль белка Sigalov, Nano Lett., 2008 Li et al., Protein Pept. Lett., 2014
- 32. Суб-нанопора ● Пора размеромменьше нанометра в тонкой неорганической кремниевой мембране ○ Объем до 0.3 nm3 Kennedy et al., 2016
- 33. Сигнал с нанопоры ●Флуктуации измеренные на 250 KHz ● Транслокации белков уменьшают ионный ток Nanospectrum -> Time (seconds)
- 34. Сигнал с нанопоры ●Флуктуации измеренные на 250 KHz ● Транслокации белков уменьшают ионный ток Сигнал ￫ Time (seconds) Time (miliseconds)
- 35. От сигнала кбелку de novo секвенирование? Сигнал
- 36. От сигнала ибазы данных к белку + идентификацияСигнал База данных
- 37. Идентификация vs секвенирование ●Какие известные белки представлены в образце? ● В масс-спектрометрии, идентификация белков против базы данных гораздно более надежна чем de novo секвенирование ● Надо уметь генерировать теоретический сигнал белка
- 38. Идентификация vs секвенирование ●Какие известные белки представлены в образце? ● В масс-спектрометрии, идентификация белков против базы данных гораздно более надежна чем de novo секвенирование ● Надо уметь генерировать теоретический сигнал белка ? Сигнал
- 39. Mean Volume модель ●Сигнал пропорционален занятому объему поры ● Пора вмещает насколько аминокислот (k) Kennedy et. al., 2016
- 40. Mean Volume модель ●Сигнал пропорционален занятому объему поры ● Пора вмещает насколько аминокислот (k) ● Сигнал пропорционален их среднему объему Kennedy et. al., 2016 ● Согласно экспериментам k=4
- 41. Mean Volume: пример ●Маленький коэффициент корреляции (0.25 - 0.45) ● Регионы с сильными отклонениями от модели содержат маленькие амонокислоты
- 42. Ошибка в зависимостиот объема ● Ошибка со знаком: теоретический - эмпирический сигнал
- 43. SVR модель ● Ужедоступно много сигналов с известных белков ● Можно построить регрессионную модель ● Для квадромера qi соответствующего сигналу ei ○ Преобразовать qi в вектор фич fi ○ Разделить все сигналы на пары (fi , ei ) ○ Тренируется SVR регрессор ● Как определить вектор фич fi ?
- 44. Сокращенный алфавит ● Проблема:много аминокислот с похожими объемами ● Тяжело различить по сигнал ● Разобьем на категории: Micro, Smal, Intermediate, Large
- 45. SVR модель: пример ●SVR меодаль дает в 1.5 - 2x лучшую точность (коэффициент корреляции 0.38-0.68) MV-model SVR-model
- 46. Ошибка в зависимостиот гидрофильности ● Ошибка со знаком: теоретический - эмпирический сигнал
- 47. Регрессия с помощьюRandom Forest ● Необходимо включить гидрофильность аминокислот в модель ● Random Forest ○ Нет оверфиттинга ○ Более робастный к шуму ● Фича - вектор из объемов и гидрофильностей ● Проблема: малое покрытие треировочных датасетов
- 48. Регрессия с помощьюRandom Forest ● Необходимо включить гидрофильность аминокислот в модель ● Random Forest ○ Нет оверфиттинга ○ Более робастный к шуму ● Фича - вектор из объемов и гидрофильностей ● Проблема: малое покрытие треировочных датасетов ○ Расширим датасеты, перемешивая аминокислоты в 4-мерах
- 49. Кластеризация сигналов ● Многопобочных факторов, влияющих на ток через пору: ○ Зависимый от времени шум в ионном токе ○ Инструментальный шум ○ Ренавномерное прохождение белка ● Шумный сигнал ● Консенсус из нескольких сигналов существенно уменьшает уровень шума
- 50. Идентификация белков ● Длясингала S выбирается белок P из DB с лучшим R2 для данной модели ○ Protein-Nanospectrum Match (PrNM) ● P-value для PrNM(P, S): вероятность того, что случайный белок такой же длины будет иметь R2 выше чем P Сигнал Кластер сигналов S Кластери зация Сравнение База данных DB MASKAVA... PACKAFV... MPCGADC... MCHDYFI...Наиболее похожий белок P
- 51.
- 52. Результаты: точность идентификации ●Точность, в зависимости от размера консенсуса
- 53. Результаты: точность идентификацииII ● Точность, в зависимости от размера консенсуса
- 54. Результаты: реальные данные ●Все белки человеческого протеома длиной 100-160
- 55. Анализ смесей белков ●В реальных данных будет представлена смесь из белков ○ Сложно кластеризовать ● Можно ли разделить смесь на кластеры, соответствующие разным белкам?
- 56. Анализ смесей белков ●В реальных данных будет представлена смесь из белков ○ Сложно кластеризовать ● Можно ли разделить смесь на кластеры, соответствующие разным белкам?
- 57. Благодарности ● Gregory Timp’slab at University of Notre Dame ● Pavel Pevzner’s lab at UC San Diego Eamonn Kennedy Zhuxin Dong Gregory Timp Pavel Pevzner
- 58. Спасибо за внимание! ●Нанопоры для ДНК ○ Zlowak, Di Ventra, “Colloquium: Physical approaches to DNA sequencing and detection”, Reviews of modern physics, 2008 ○ Branton et al., “The potential and challenges of nanopore sequencing”, Nature Biotechnology, 2008 ○ Oxford Nanopres presentation video “No thanks, I’ve already got one” ● Нанопоры для белков ○ Kennedy et al., “Reading the primary structure of a protein with 0.07 nm3 resolution using a subnanometre-diameter pore”, Nature Nanotechnology 2016 ○ Kolmogorov et al., “Single-Molecule Protein Identification b Sub-Nanopore Sensors”, submitted