1. 1
KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PROTEIN
PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN
1. Khái Niệm
1.1 Protein
1.1.1 Protein là gì?
Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho sự
sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự
sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “thứ nhất”. Về
định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều
thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ
thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ
thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể
của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương
.
1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein
Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại học
Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin. Hiên nay
đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các
axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo ra hàng trăm, hàng nghìn
các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể
chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin
xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5
loại cấu trúc không gian, ứng với 5 chức năng của Protein như sau:
1

2. 2
• Kháng thể (antibody)
Đây là các protein có khả
năng bám vào các phân tử
ngoại lai như vi khuẩn, vi
rút, sau đó vô hiệu hóa
chúng để bảo vệ cơ thể.
Trong hình bên là cấu trúc
không gian của protein
kháng thể:
Immunoglobulin G (lg G).
• Enzyme
Enzyme xúc tác cho
hầu hết các phản ứng
hóa học xảy ra trong tế
bào. Chúng cũng giúp
đỡ hình thành những
phân tử mới bằng cách
đọc thông tin di truyền
lưu trữ trong DNA.
Vídụ hình bên:
Phenylalanine
hydroxylase.
2

3. 3
• Thông tin - Messenger
protein thông tin, như một
số loại hormone, truyền tải
tín hiệu để phối hợp các
quá trình sinh học giữa các
tế bào, mô, cơ quan khác
nhau. Ví dụ: hormone tăng
trưởng (Growth hormone)
• Thành phần cấu
trúc
Những protein này
cung cấp cấu trúc và
3

4. 4
nuôi dưỡng tế bào. Trong một phạm vi lớn hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển. Ví
dụ: Actin
• Vận chuyển-dự trữ
các protein này bám vào
những nguyên tử và
phân tử nhỏ bên trong tế
bào và lưu thông trong
cơ thể. Ví dụ: Ferritin
1.2 Vai trò Protein trong sinh học
Như đã nói ở trên, Protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh học nói
chung cũng như con người nói riêng.
1.2.1 Vai trò
Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là
axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là
chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo
thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.
4

5. 5
• Protein hình thành, duy trì và thay thế các tế bào trong cơ thể. Protein chiếm tới
trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào. Thiếu
protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưởng xấu
đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể.
• Protein là tham gia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men,
kháng thể, các tuyến bài tiết và nội tiết. Vì vậy, protein có liên quan đến mọi
chức năng sống của cơ thể (tuần hoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài tiết hoạt
động thần kinh và tinh thần...).
• Protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt
là các vitamin và chất khoáng. Khi thiếu protein, nhiều vitamin không phát huy
đầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số lượng.
• Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể, thường cung cấp 10%-15% năng
lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4 Kcal (trong khi đó
Gluxit là 4 Kcal, Lipit là 9kcal và rượu là 7kcal)
• Protein kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các chế độ
ăn khác nhau. Thiếu protein gây ra các rối loạn quan trọng trong cơ thể như
ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội
tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn
dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm
khuẩn.
1.2.2 Bổ sung protein cho cơ thể
Sau khi được nạp vào cơ thể, trong quá trình tiêu hoá thức ăn, protein được phân huỷ
tại dạ dày bởi các enzyme. Nó chuyển thành các polypeptides, cung cấp các axit amin
cần thiết cho sự sống. Thành phần axit amin của cơ thể người không thay đổi và cơ thể
chỉ tiếp thu một lượng các axit amin hằng định vào mục đích xây dựng và tái tạo tổ
5

6. 6
chức. Có 8 axit amin cơ thể không thể tổng hợp được hoặc chỉ tổng hợp một lượng rất
ít. Đó là Lyzin, tryptophan, phenynalaninin, lơ - xin, izolơxin, valin, treonin, metionin.
Người ta gọi chúng là các axit amin cần thiết.
Các axit amin cần thiết này được lấy thông qua protein của thức ăn từ bên ngoài. Tuy
nhiên, trong tự nhiên không có loại protein thức ăn nào có thành phần hoàn toàn giống
với thành phần axit amin của cơ thể. Do đó để đáp ứng nhu cầu cơ thể cần phối hợp
các loại protein thức ăn để có thành phần axit amin cân đối nhất.
Giá trị dinh dưỡng một loại protein cao khi thành phần axit amin cần thiết trong đó
cân đối và ngược lại. Hầu hết thức ăn có nguồn gốc động vật và thực vất chứa đầy đủ
và cân đối các thành phần của các axit amin cần thiết . Tuy nhiên, không có một loại
thức ăn nào có đủ tất cả mà cần phải sử dụng một chế độ hỗn hợp nhiều loại thức ăn.
Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số
lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao. Hàm lượng
các axit amin cần thiết trong thực phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô,
các loại đậu khác...) không cao (trừ đậu nành); nhưng cơ thể vẫn phải bổ sung cân đối
đấy đủ các loại này. Vì vậy, biết phối hợp các nguồn protein thức ăn hợp lý sẽ tạo nên
giá trị dinh dưỡng cao của khẩu phần. Ví dụ gạo, ngô, mì nghèo lizin còn đậu tương,
lạc, vừng hàm lượng lyzin cao, khi phối hợp gạo hoặc mì hoặc ngô với đậu tương,
vừng , lạc sẽ tạo nên protein khẩu phần có giá trị dinh dưỡng cao hơn các protein đơn
lẻ
2. Phân tích cấu trúc Protein
2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì?
6

7. 7
Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành phần và
trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau. Chính vì vậy, việc
nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong sinh học. Từ các thông tin
đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có chức năng gì, để từ tìm cách tổng
hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần hoặc loại bỏ các protein có hại. Phân tích cấu
trúc Protein chính là nhằm mục đích này.
Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất được đẩy
mạnh. Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được công bố cho phép
con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử protein. Và chúng cũng
được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,…
2.2 Các phương pháp phân tích
Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường của
chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được. Chính vì vậy, để nghiên cứu những đối tượng
này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các phương tiện khoa
học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu trúc protein chỉ thực sự
khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật.
Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin giới
thiệu sơ lược 2 phương pháp hữu hiệu nhất
2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography)
William Henry Bragg (1862-1942) là người đi tiên phong trong việc phát triển phương
pháp X-ray. Bragg có vô số hứng thú nghiên cứu, nhưng công trình mang lại tên tuổi cho
ông là một nhà khoa học hàng đầu là tiến bộ mang tính lịch sử của ông trong tinh thể học
tia X. Làm việc với người con trai, William Lawrence Bragg, ông đã phát triển một phương
pháp bắn phá các tinh thể với tia X năng lượng cao phát ra bởi những ống chân không được
cấu trúc đặc biệt. Khi tia X đi qua đơn tinh thể, chúng bị nhiễu xạ theo một điều kiện do
7

8. 8
cha con Bragg khám phá ra và do đó suy luận định lượng ra đường đi của chúng. Hình ảnh
tia X nhiễu xạ có thể được chụp trên kính ảnh, vì tia X làm phơi sáng các hạt bạc bromide
khi chúng va vào. Bằng cách khảo sát hình ảnh tia X nhiễu xạ bởi những tinh thể khác
nhau, Bragg và con trai của ông đã có thể thiết lập một số mối liên hệ toán học cơ bản giữa
một cấu trúc tinh thể nguyên tử và hình ảnh nhiễu xạ của nó. Với thành tựu này, , William
Henry Bragg và William Lawrence Bragg được tặng Giải Nobel Vật lí năm 1915.
2.2.1.1 Sơ lược phương pháp
Cách thông thường để xác định hình dáng một vật là nhìn trực tiếp vào nó. Với các vật rất
nhỏ, như các phân tử, để xác định cấu trúc liên kết giữa các nguyên tử tạo nên phân tử đó,
ta cần dùng kính hiển vi để phóng đại chúng lên hàng ngàn tỉ lần. Với khả năng hiện có,
kính hiển vị điện tử (electron microscopes) cũng chỉ có thể phóng đại lên cỡ vài tỉ lần. Lí
do là do giới hạn nhiễu xạ (diffraction limit): để có thể nhìn thấy một vật hoặc phân biệt
được 2 vật điểm thì kích thước tối thiểu của vật hoặc khoảng cách tối thiểu giữa hai vật
điểm lớn hơn 1/2 lần bước sóng đang sử dụng.
Bước sóng của ánh sáng nhìn được vào khoảng vài trăm nanometers còn các nguyên tử thì
có khoảng cách chỉ ở đơn vị hay bước sóng cần thiết để nhìn thấy các nguyên tử là bước
sóng của tia X. Nhưng ta không thể tạo ra kính hiển vi tia X. Vì thế đòi hỏi ta phải dùng các
kĩ thuật mang tính gián tiếp khác. Tia X khi chiếu vào tinh thể sẽ tương tác với các electron
hóa tri (valence electron) của các nguyên tử thành phần được phân bố trong không gian.
Các electron này sẽ tán xạ (scatter) tia X ra các hướng, tùy vào sự sắp xếp trong không gian
của nguyên tử. [Cái này cũng giống như dùng một đèn pin lớn chiếu vào một cây đèn chùm
(chandelier) mà ta không được phép nhìn thấy. Dù không biết cây đèn chùm hình dáng thể
nào, nhưng dựa vào bóng phản chiếu (các pattern) ta cũng có thể dự đoán sự sắp xếp của
các mảnh thủy tinh trên cây đèn chùm] Một màn hình sẽ ở phía sau để lưu lại ví trí tán xạ và
cường độ của tia X bị tán xạ. Sau khi có các dữ liệu này rồi, người ta sẽ dùng các công thức
tính toán phức tạp để xác định vị trí các electron bao quanh các nguyên tử và từ đó suy ra vị
trí các nguyên tử. Các mẫu nhiễu xạ thu được sẽ có mối quan hệ với vật phát tán các sóng
8

9. 9
chiếu tới nó thông qua một phép toán biển đổi gọi là biến đổi Fourier (Fourier transform).
Nếu mật độ các electron (electron density) bao quanh mỗi nguyên tử là một hàm toán học,
thì mẫu nhiễu xạ tia X thu được tương ứng là biến đối Fourier của hàm đó. Với tính chất có
thể biến đổi ngược của phép biến đổi Fourier, ta có thể dùng máy tính để xây dựng lại hình
ảnh mật độ electron dựa vào ảnh mẫu nhiễu xạ. PDB (Protein Data Bank) lưu trữ cấu trúc
protein và các phân tử sinh học khác miễn phí sử dụng. Để hiển thị cấu trúc 3D của chúng,
ta dùng phần mềm RasMol hay Pymol.
Tuy nhiên, một khó khăn gặp phải là nhiễu xạ tia X từ một phân tử thì sẽ cho cường độ thu
được trên ảnh rất yếu và khó phân biệt với nhiễu. Do đó, người ta sử dụng tinh thể. Tinh thể
sắp xếp một lượng lớn các phân tử theo một trật tự và hướng giống nhau, nhờ thế các sóng
nhiễu xạ sẽ cộng hưởng pha (ở một số hướng) làm tăng cường độ hiển thị lên máy đo. Hiển
nhiên, ở một số hướng khác, các nhiễu xạ này cũng triệt từ nhau. Đó là lí do mà mẫu nhiễu
xạ chỉ là mảng các điểm. Vì thế, việc tạo ra một tinh thể tốt đóng vai trò cực kì quan trọng
để thu được hình ảnh có giá trị. Đó là khởi nguồn của kĩ thuật tinh thể học tia X.
2.2.1.2 Ưu – nhược điểm phương pháp
Trước khi có phương pháp tinh thể học tia X: Việc tìm hiểu tinh thể là dựa vào đặc tính
hình học của tinh thể. Để biết được cấu trúc 3D, người ta đo các góc của bề mặt tinh thể so
với các trục tham chiếu tưởng tượng (crystallographic axes) và từ đó cho ra hình ảnh hình
học có tính đối xứng của tinh thể. Hình ảnh 3D này được chiếu lên mặt phẳng dùng phép
chiếu lập thể (stereographic projection) để chiếu mặt cầu lên mặt phẳng. Phép chiếu này bảo
toàn góc nhưng không bảo toàn diện tích.
Phương pháp tinh thể học tia X thì dựa vào máy đo góc (goniometer): Việc xác định trật tự
của các nguyên tử dựa vào sự phân tích các mẫu nhiễu xạ (diffraction patterns) thu được sau
khi chiếu tia X vào tinh thể các chất/phân tử cần phân tích ở dạng rắn tinh thể. Ngoài tia X,
người ta còn dùng electron (electron diffraction) hoặc neutron (neutron diffraction) cho một
số mục đích đặc biệt.
9

10. 10
Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) được ứng dụng nhiều trong sinh học để xác định
cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA hay RNA. Và các phân tử này phải được
chuyển về dạng tinh thể. Lí do sử dụng tia X là vì ta không thể nhìn thấy chi tiết một vật
nhỏ hơn nửa bước sóng đang sử dụng. Mà kích thước nguyên tử quá nhỏ, nên phải dùng tia
X vì có bước sóng đủ ngắn để thấy được chi tiết nguyên tử. Tuy nhiên, năng lượng sóng thì
tỉ lệ nghịch với bước sóng, nghĩa là bước sóng càng ngắn thì năng lượng càng cao, càng dễ
phá hỏng mẫu phân tử sinh học. Đó là lí do mà phải chuyển về dạng tinh thể để giảm sự phá
hoại của tia X. Tuy nhiên việc phá hoại của tia X là vẫn không thể tránh khỏi, kết quả thu
được cần được xem xét kỹ.
2.2.2 Cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR )
Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được tìm ra và phát triển qua nhiều giai đoạn,
đặc biệt nhờ các đóng góp của Richard R. Ernst. Năm 1966, khi làm việc chung với một
đồng nghiệp người Mỹ, Ernst đã phát hiện ra rằng độ nhạy của kỹ thuật cộng hưởng từ hạt
nhân (cho đến nay chỉ giới hạn trong việc phân tích số ít hạt nhân) có thể được tăng lên
đáng kể bằng cách thay thế các sóng vô tuyến quét chậm thường được dùng trong quang
phổ cộng hưởng từ hạt nhân thời đó bằng các xung ngắn cường độ cao. Khám phá của ông
đã cho phép phân tích nhiều loại hạt nhân hơn và các số vật liệu nhỏ hơn.
Đóng góp quan trọng thứ nhì của ông vào lãnh vực "phổ học cộng hưởng từ hạt nhân" là
một kỹ thuật cho phép một độ phân giải cao, nghiên cứu "hai chiều" các phân tử lớn hơn so
với trước đây mà quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã đạt được. Với các cải tiến của
Ernst, các nhà khoa học đã có thể xác định cấu trúc 3 chiều của các hợp chất hữu cơ và vô
cơ và các đại phân tử sinh học như các protein; để nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử
sinh học và các chất khác như các ion kim loại, nước, và thuốc; để xác định các loại hóa
chất, và để nghiên cứu tỷ lệ của các phản ứng hóa học. Ông được trao Giải Nobel Hóa học
cho công trình đóng góp của ông vào việc phát triển phổ học cộng hưởng từ hạt nhân biến
đổi Fourier và sau đó việc phát triển kỹ thuật “cộng hưởng từ hạt nhân” đa chiều. Các ứng
10

11. 11
dụng nền tảng của cộng hưởng từ hạt nhân cả trong hóa học (phổ học cộng hưởng từ hạt
nhân) và y học.(chụp cộng hưởng từ).
2.2.2.1 Phương pháp thực hiện
Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân sẽ được trình bày chi tiết ở phần 2.
2.2.2.2 Ưu nhược điểm phương pháp
Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon
trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác người ta có thể xây dựng được
cấu trúc phân tử của hợp chất. Trong khá nhiều trường hợp, chỉ bằng NMR người ta cũng
có thể xác định được cấu trúc và cấu hình lập thể của chất cần phân tích. Do có rất nhiều
thông tin đặc trưng về cấu trúc phân tử, việc sô sánh phổ proton hay carbon một chiều của
một chất với một chất đã biết cho phép xác định một chất một cách tin cậy. Ngày nay, chỉ
cần lượng mẫu ở mức /mg /hay thấp hơn đã có thể xác định cấu trúc của một chất. Khả năng
này giúp ích rất nhiều trong nghiên cức các tự nhiên, khi mà cá chất rất khó phân lập và
thường chỉ thu được với một lượng nhỏ. Ngoài việc xác định cấu trúc, phổ cộng hưởng từ
hạt nhân còn được dùng trong định lượng các chất trong phân tích định lượng như các
phương pháp phổ khác. Tuy nhiên, do thiết bị đắt tiền nên cách thức này ít được sử dụng.
Việc kết nối cộng hưởng từ hạt hân với các thiết bị sắc ký lỏng có nhiều khó khăn. Tuy vậy,
hiện đã có những hệ thống ghép nối HPLC-NMR để phân tích và xác định các chất chiết từ
dược liệu. Ngoài các phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân dùng trong phân tích cấu trúc, kỹ thuật
xác định hình ảnh cộng hưởng từ hạt nhân cũng được sử dụng trong chẩn đoán y khoa.
Công nghệ mới này không những cung cấp thông tin về cấu trúc không gian ba chiều của
các phân tử sinh học mà còn cho biết đặc điểm nhiệt động học và từ tính của nó. Điều nay
cho thấy đây là một công cụ quan trọng cho phép đi sâu tìm hiểu chức năng của các phân tử
sinh học ở mức độ phân giải cỡ các nguyên tử trong tương lai.
11

12. 12
PHẦN 2. Xác định cấu trúc protein bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân ( RMN-
RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE )
I. Tổng quan về phương pháp RMN :
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu cấu trúc Protein :
Các nghiên cứu về cấu trúc Protein bắt đầu vào năm 1936 khi Mirsky và Pauling đề xuất rằng
các chức năng của một protein có liên quan đến cấu tạo của nó (sự sắp xếp của các nguyên tử
trong không gian ba chiều) (Anfinsen , 1973). Những lời này đã có một ảnh hưởng lớn đến sự
hiểu biết về sinh học cũng như việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc mới (Russell và
Eggleston, 2000). Kể từ đó, việc nghiên cứu cấu trúc ba chiều của tất cả các protein trong một
hệ protein cho phép ta có một cách suy nghĩ mới trong lĩnh vực Sinh học cấu trúc (Hol,
2000). Nghiên cứu thực nghiệm về cấu trúc của các protein là một quá trình lâu dài và tốn
kém, đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng và trình độ chuyên môn cao. Hai phương pháp chính
được sử dụng là phương pháp tinh thể và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và
được trình bày trong phần sau.
2.1.2 Lịch sử phương pháp NMR :
Cho đến năm 1985, phương pháp duy nhất để xác định cấu trúc ba chiều của một đại phân tử
là tinh thể học tia X nhiễu xạ. Kỹ thuật này đòi hỏi phải có các tinh thể protein ngăn nắp.Mặc
dù có những bước tiến lớn trong nghiên cứu nhưng phương pháp vẫn gặp phải rất nhiều khó
khăn và đôi khi kết quả lại là những tinh thể protein không đạt yêu cầu. Trong những năm gần
đây, nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), mà chúng ta
đã có thể xác định được cấu trúc ba chiều của các protein nhỏ, đặc biệt là protein ít hơn 200
axit amin (Cavanagh et al. , 1996). Điều này có được là nhờ việc chúng ta đã sản xuất được
các quang phổ kế trường cao, sự phát triển của kỹ thuật NMR đa chiều và những tiến bộ trong
công nghệ máy tính. NMR cho phép chúng ta ước tính khoảng cách giữa các proton và một số
góc nhị diện. Từ kiến thức của một số lượng lớn các dữ liệu NMR, có thể xác định cấu trúc
của một protein với độ phân giải của trật tự thu được bởi tia X.
Việc một số dự án giải mã gen được hoàn thành gần đây đã cung cấp cho các nhà khoa học các
thông tin về trình tự của một số bộ gen. Vì mỗi protein trong một sinh vật có một tầm quan
12

13. 13
trọng sinh hóa nhất định nên xác định cấu trúc ba chiều của tất cả các protein của một hệ
protein sẽ cho phép chúng ta hiểu sâu hơn về cấu trúc cũng như chức năng của các protein
trong cơ thể sống. Vì vậy gần đây, một số dự án phân tích cấu trúc protein đã được bắt đầu ở
một vài nơi trên thế giớ như Nhật Bản, châu Âu và Bắc Mỹ (Heinemann, 2000; Terwilliger,
2000; Yokoyama và cộng sự, 2000).
Xác định cấu trúc ba chiều của protein mất một thời gian. Nó có thể mất vài tháng tùy thuộc
vào độ dài của protein. Để tăng tốc độ của sự khám phá của các cấu trúc, các nhà nghiên cứu
phối hợp với các phòng thí nghiệm khác để áp dụng phương pháp NMR để phân tích mẫu
protein. Kết quả cho thấy, 16 cấu trúc đã được giải quyết trong sáu phòng thí nghiệm tinh thể
khác nhau và 17 cấu trúc đã được giải quyết trong bảy phòng thí nghiệm NMR khác nhau (Yee
et al, 2003). Số lượng các cấu trúc gần như giống hệt nhau được xác định với tinh thể và NMR
cho thấy NMR quang phổ có thể đóng góp đáng kể cho lĩnh vực nghiên cứu cấu trúc protein
(Yee et al, 2003).
Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) là một kỹ thuật quang phổ được sử dụng rộng rãi. Sự đa dạng
tuyệt vời của quang phổ cho phép xác định cấu trúc ba chiều của các protein. Phần dưới sẽ
cung cấp một cái nhìn tổng quan về các khái niệm lý thuyết trong phương pháp NMR cũng
như giới thiệu các bước xác định cấu trúc của một protein bằng phương pháp này.
II. Các khái niệm lý thuyết cơ bản trong phương pháp NMR :
2.2.1 Những nguyên tắc cơ bản của NMR
NMR phân tích dựa trên các tính chất từ của hạt nhân nguyên tử. Các hạt nhân của các nguyên
tử tạo ra sự tồn tại của một momen quay riêng cụ thể được gọi là spin I . Spin có giá trị là 0,
1/2, 1, 3/2, và như vậy ( I = 0 có nghĩa là không có quay). Trong thực tế, có một hạt có
moment quay khác không sẽ cung cấp cho hạt nhân nguyên tử các thuộc tính của một lưỡng
cực từ. Một hạt có spin 1/2 sẽ chịu ảnh hưởng của một từ trường có hai moment từ theo hai
hướng khác nhau, trong cùng một phương.Ví dụ như proton 1 H, hạt nhân 13 C, 19 F hoặc 31 P có
spin là 1/2 và hai trạng thái spin: 1/2 -1/2. Cho một spin bằng một, chẳng hạn như
13

14. 14
deuterium2 H hoặc lithium 6 Li, có ba sự định hướng sẽ xảy ra: -1, 0 và +1 (Evans, 1995). Nói
chung, có (2I+1) hướng cho một spin I.
Khi mẫu đặt trong một từ trường, mỗi sự định hướng sẽ tương ứng với một mức năng
lượng. Đối với các proton có spin là 1/2, có hai mức năng lượng nhất (phân phối Boltzmann)
( Hình 2-3 ). Đây là quá trình chuyển đổi giữa các mức và sẽ hình thức hóa hiện tượng cộng
hưởng từ hạt nhân (Sanders và Hunter, 1987).
Hình 2-3: Mức năng lượng và trạng thái spin hạt nhân của proton khi không có từ trường. Sự
khác biệt hai mức năng lượng là yếu hơn nhiều so với những gì được hiển thị trong hình
này. (Hình từ www.rmn.uhp-nancy.fr/Mutzenhardt/RMNSV2CM1.pdf)
Để quan sát một tín hiệu, chúng ta phải phá vỡ sự cân bằng giữa hai mức năng lượng. Mẫu
phải chịu một từ trường thứ hai được sản xuất bởi một nguồn bức xạ điện từ có xung vuông
góc với trường đầu tiên và được tạo ra bởi nam châm. Do hiện tượng cảm ứng điện từ nên một
dòng điện cảm ứng sẽ xuất hiện trong máy thu cuộn dây (Cavanagh et al, 1996.) ( Hình 2-4 ) .
14

15. 15
Hình 2-4: Ảnh hưởng của từ trường bên ngoài của một mẫu NMR chuyển từ hóa dọc theo x và
trục y và sự quay do cảm ứng điẹn từ xung quanh trục z. (Sanders, 1987).
Như thể hiện trong Hình 2-5 , M dần dần sẽ trở về vị trí ban đầu của nó và song song với
B o . ( Cavanagh et al, 1996).
Hình 2-5: Sự cân bằng trở lại moment từ hóa theo định hướng song song với
B 0 (www.med.univ-rennes1.fr/cerf/edicerf/BASES/BA004_cv_rb_9.html).
Trong thời gian quay trở lại trạng thái cân bằng, các dữ liệu sẽ được ghi lại bằng máy quang
phổ NMR. Hạt nhân của protein sẽ cộng hưởng ở tần số khác nhau tùy thuộc vào môi trường
khác. Các tín hiệu được ghi nhận là một FID (cảm ứng phân rã tự do). Hình 2-6 là một ví dụ
về một FID.
15

16. 16
Hình 2-6: Tín hiệu NMR ở dạng tín hiệu tắt dần theo thời gian có tên là FID (cảm ứng phân rã
tự do).
Những tín hiệu này có chứa tất cả các thông tin cần thiết nhưng rất khó để giải mã chúng. Biến
đổi Fourier giúp chúng ta có thể nhìn thấy tín hiệu này có đồ thị dạng hình sin và là một hàm
theo thời gian (y = f (t)) bằng cách thay đổi nó thành một quang phổ NMR mang chức năng
của tần số (y = f (?)) ( Hình 2-7 ). Các tần số cộng hưởng sau đó sẽ được phục hồi
lại(Cavanagh et al, 1996).
Hình 2-7: Tín hiệu FID qua phép biến đổi Fourier. (Hình từ www.rmn.uhp-
nancy.fr/Mutzenhardt/RMNSV2CM1.pdf)
16

17. 17
2.2.2 Các bước xác định cấu trúc của protein bằng NMR:
Trong phần này, chúng ta sẽ thảo luận về các bước cần thiết để xác định cấu trúc của một
protein. Các bước này được trình bày ở phần ngay sau đây.
2.2.2.1 Biểu diễn, đánh dấu các đồng vị và tinh chế protein:
NMR phân tích yêu cầu số lượng lớn các protein tinh khiết. Bằng cách sử dụng các kỹ thuật
tiêu chuẩn , gen quan tâm được nhân bản vô tính trong một plasmid DNA và được đưa vào các
vi khuẩn với số lượng rất lớn.
Một số hạt nhân không quan sát được bằng NMR do thiếu spin hạt nhân (I = 0). Nhưng trong
nghiên cứu các thành phần cơ bản cốt lõi của hóa học hữu cơ, chẳng hạn như 12 C và 16 O,
chúng ta có thể quan sát được hiện tượng NMR. Đó là do các nguyên tử này luôn xuất hiện các
đồng vị với spin hạt nhân khác không. 13 C quay 1/2 được tìm thấy ở mức 1,11% trong tự
nhiên. Ngoài ra, đồng vị này có một tỷ lệ gyromagnetic thấp hơn bốn lần của proton. Vì vậy,
hai yếu tố này gây ra độ nhạy rất thấp cho 13 C khi phân tích NMR quang phổ. 17 O có spin 5/2
tồn tại ít hơn nhiều so với13 C trong tự nhiên, dẫn đến sự quan sát của các vạch phổ rất rộng và
gần như không thể sử dụng phương pháp phân tích NMR.
Hạt nhân 14 N có spin 1, có thể phân tích bằng NMR Đánh dấu làm giảm số lượng các mức
năng lượng. 15 N quay 1/2 là có ít hơn 13 C trong tự nhiên, được tìm thấy ở 0,37% (Cavanagh et
al, 1996; VOET và VOET, 1995). Nó cung cấp tín hiệu NMR tốt. Tỷ lệ “gyromagnetic” của
nó nhỏ hơn 10 lần so với proton.
Để khắc phục những khó khăn, có thể thống nhất đánh dấu các nguyên tử cacbon và nitơ
là 13 C và 15 N. Đánh dấu amoni clorua ( 15 NH 4 Cl) và glucose ( 13 C-glucose) cách biểu diễn
duy nhất của nitơ và carbon trong môi trường nuôi cấy. Đánh dấu đồng vị của các protein này
là điều cần thiết để phân tích vô số các thí nghiệm NMR đa chiều.
Đôi khi người ta thay thế các proton bởi các deuterium để giảm bớt quang phổ của protein
lớn. Để sản xuất một protein deuterated, sự tăng trưởng của vi khuẩn được thực hiện trong
D 2 O thay vì H 2 O.
Các protein tái tổ hợp sau đó được tinh chế và cấu trúc của chúng sẽ được đặc trưng bởi NMR.
17

18. 18
2.2.2.2. Chuẩn bị mẫu
Các protein có cấu trúc ba chiều được phân tích bởi NMR phải có nồng độ và môi trường thích
hợp. Nồng độ của protein tinh khiết trong một mẫu cần phải khác nhau từ 0,5 đến 2.0 mM.
Các mẫu có thể chứa tạp chất, nhưng không được chứa các proton tạp chất vì sẽ gây ảnh
hưởng tới các proton của protein. Muối và ion có thể được tìm thấy trong dung dịch. Một nồng
độ tối thiểu của các muối sẽ cung cấp cho protein một môi trường tương tự như môi trường tự
nhiên của nó, nhưng nồng độ quá cao sẽ làm tổn thương nó, vì muối là những yếu tố dẫn điện
và có thể làm nóng mẫu.
Protein có thể ở dạng monomer hoặc polymer và phải được ổn định để có thể duy trì hoạt động
và giữ vững cấu trúc của nó cho một vài tuần trong điều kiện nhiệt độ cao. Độ pH của mẫu là
rất quan trọng để quan sát tất cả các proton của protein. pH thường dao động từ 5 đến 7. pH
cao giúp tăng tốc độ trao đổi proton với dung môi.
Dung môi được sử dụng thường là nước. 10% D 2 O được thêm vào mẫu để giữ cho phổ kế chỉ
một giá trị tần số duy nhất (Cavanagh et al 1996). Thật vậy, mặc cho từ trường thay đổi liên
tục từ một giá trị nhỏ, xung được đưa ra liên tục trên D 2 O để điều chỉnh tần số tham chiếu của
các hạt nhân của protein. Tần số cộng hưởng được tham chiếu bởi một lượng nhỏ (0,5 mM)
DSS (natri 2,2-dimetyl 2 silapentane-5-sulfonate) được thêm vào mẫu.
2.2.2.3. Lấy NMR
Việc có được một số quang phổ NMR tạo điều kiện cho việc xác định tần số cộng hưởng của
tất cả các hạt nhân của một hợp chất. Tuy nhiên, tần số cộng hưởng của một hạt nhân lại tỉ lệ
thuận với từ trường. Việc xác định tần số chuyển hóa chất không phải dễ dàng và các thiết bị
cũng biện pháp được sử dụng phải có độ chính xác đến ppm (phần triệu) (Cavanagh et al,
1996). Như một ví dụ đơn giản, một proton trong một từ trường 14 Tesla (T) ở 600MHz trong
khi trong một từ trường mười lần nhỏ hơn (1,4092 T), ở 60 MHz. Tính toán có thể được thực
hiện từ các phương trình 1 .
18

19. 19
Phương trình 1: Phương trình của NMR cơ bản. ᵞ đại diện cho Lamor tuế sai tần số (MHz),
B z là từ trường.
Các hạt nhân của hợp chất không cộng hưởng ở cùng một tần số. Proton cộng hưởng thông
thường từ 1 đến 12 ppm ( Hình 2-9 ), các nguyên tử cacbon béo thường cộng hưởng giữa 17
và 75 ppm và nitơ amit thường giữa 100 và 132 ppm. Tính chất hóa học bị ảnh hưởng bởi môi
trường xung quang, chính xác hơn nữa là bởi các hạt nhân và các electron ở gần đó.
Hình 2-9: Sự thay đổi hóa tính đối với các loại proton khác nhau. Phổ 1D đã được ghi lại trong
nước. FID được biến đổi bởi biến đổi Fourier (Cavanagh et al, 1996).
19

20. 20
Trong quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhiều hơn một chiều, các cực đại được hình thành
trong sự chuyển đổi hóa học của sự tương quan giữa hai hạt nhân. Mối tương quan được ghi
nhận giữa các hạt nhân của protein có thể chỉ là sự khác nhau của một quang phổ. Họ có thể
tạo liên kết giữa một amino acid riêng lẻ hoặc thông qua không gian. Một số NMR giúp phân
tích cấu trúc mạch, tức là xác định những thay đổi hóa học của các hạt nhân trên chuỗi chính,
và các loại quang phổ khác ước tính sẽ cần nhiều hơn để xác định sự thay đổi hóa tính của các
chuỗi bên.
Thí nghiệm NMR Homonuclear được dựa trên một loại hạt duy nhất của nguyên tử:
proton. Hai loại thí nghiệm được sử dụng đó là COSY và TOCSY (Braunschweiler và Ernst
1983) (Cavanagh et al, 1996).
Một số axit amin có một spin của riêng mình. Lấy ví dụ cặn alanine. Dư lượng này được đặc
trưng bởi nhóm methyl nằm ở Hβ. Trong thực tế, cao điểm này có cường độ lớn hơn gấp ba
lần so với Hα. Do đó, có thể kết hợp một vài nhóm dịch chuyển hóa học cho một loại axit
amin, sau đó nó sẽ liên kết các axit amin với nhau. Phổ NOESY cũng là một thử nghiệm NMR
homonuclear. Công cụ để chỉ định một chuỗi là các NOEs và sẽ được trình bày chi tiết hơn ở
phần sau nữa.
Trong quá trình phân tích các protein lớn hơn, nơi nó là cần thiết để đánh dấu dư lượng, một số
thí nghiệm NMR heteronuclear có quang phổ có thể lên đến bốn lần kích thước mà ta có thể
lúc trước.
Như đã đề cập ở trên, để xác định cấu trúc của một protein thì ta phải giải mã được tất cả các
hệ thống spin của các axit amin. Tương tác Noe là những tương tác lưỡng cực giữa các proton
gần đó trong không gian (Cavanagh et al, 1996). Khoảng cách giữa hai nguyên tử hơn kém
nhau về cường độ trong tương tác NOE là thấp và thường không vượt quá 5A. Mối quan hệ
này là tỷ lệ nghịch và đề cập đến mối quan hệ sau đây.
Phương trình 2: Mối quan hệ giữa tương tác Noe và khoảng cách giữa hai proton
2.2.2.4. Chuyển đổi quang phổ để phân tích
Tín hiệu MNR phát ra phải trải qua một số biến đổi trước khi được phân tích.
20

21. 21
Việc trích xuất dung môi là cách để loại bỏ các tín hiệu từ các dung môi. Nhân tín hiệu fid
bằng một phép toán rất nhiều lợi ích phổ. Dự đoán tuyến tính làm tăng thêm các điểm được dự
đoán từ các điểm thí nghiệm. Ngoài các phương pháp đã nêu, bạn có thể thêm số không vào
cuối của tín hiệu để cải thiện độ phân giải của quang phổ.
Biến đổi Fourier chuyển đổi các tín hiệu fid trong phổ tần số ( Hình 2-7 ). Chức năng này được
thực hiện trên toàn kích thước của một quang phổ. Ưu điểm của phương pháp này là các tín
hiệu được thêm vào không gây nhiễu loạn.
Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác được sử dụng để nâng cao phổ NMR.
2.2.2.5. Kết cấu giới hạn :
Các giới hạn khác nhau về cấu trúc như NOE và góc nhị diện rất cần để xác định cấu trúc của
protein bằng NMR. Các giới hạn của liên kết hydro và các giới hạn khác không được trình bày
trong bài viết này cũng có thể được sử dụng để xác định cấu trúc của protein.
a. Giới hạn khoảng cách
NOE hạn chế cung cấp thông tin về khoảng cách giữa các nguyên tử lân cận. Các khoảng cách
này ít hơn 5A có thể là dư lượng trong nội bộ hoặc liên dư lượng (tuần tự, tầm trung, tầm
xa). Thí nghiệm cho 15 N-HSQC-NOESY đã tạo điều kiện để tìm hiểu tương tác giữa proton và
amit gần đó trong không gian. Thí nghiệm 13 C-NOESY-HSQC lại làm rõ những tương tác
giữa tất cả các proton thuộc carbon. Mỗi proton liên kết với carbon của mỗi lượng dư đều có
tương tác với tất cả các proton gắn liền với các nguyên tử carbon gần đó trong không
gian. Quang phổ này thường không được quy hoàn toàn bởi vì vài đỉnh thường chồng chéo lên
nhau.
Sự tương tác giữa hai nguyên tử, đo được cường độ tương tác giúp ta có thể đánh giá được
khoảng cách của các liên kết trước đó đã đề cập từ phần trước( phương trình 2 ). Việc hiệu
chuẩn NOE là cần thiết cho việc tính toán kết cấu.
b. Giới hạn của góc nhị diện
21

22. 22
Trong một protein, các liên kết tiếp giáp với các peptit CN có khả năng xoay xung quanh trục
của chúng. Như vậy, quỹ đạo của một protein trong không gian được xác định bởi một tập hợp
mặt phẳng khớp nối với nhau tại cacbon α( Hình 2-16 ).
Hình 2-16: Đại diện của một chuỗi polypeptide. Các góc quay về N-Cα là góc Φ và liên kết
xung quanh 'Ca-C là Ψ
Định hướng của hai mặt phẳng này được xác định bởi Φ và các góc Ψ. Cũng như khoảng cách
Noe, những góc độ này có thể được sử dụng như các giới hạn cấu trúc.Hai phương pháp
thường được sử dụng trong NMR để xác định các góc nhị diện. Sử dụng mối quan hệ giữa sự
thay đổi hóa học và các cấu trúc thứ cấp (ví dụ như cách tiếp cận Talos) được hiển thị
trong hình 2-17 và cùng với những hằng số khớp nối.
22

23. 23
Hình 2-17: Mối quan hệ giữa sự thay đổi hóa học Cα Cβ và cấu trúc thứ cấp. Con số này được
lấy từ http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/
Talos (Torsion Angle Likelihood Obtained from Shift and sequence similarity)
Talos là một hệ thống cung cấp các cơ sở dữ liệu để đánh giá các góc Ψ, Φ từ sự chuyển đổi
hóa học của năm nguyên tử: Hα, Cα, Cβ, CO, N (Cornilescu et al, 1999.). Talos sử dụng một
chuỗi ba axit amin trong một protein và so sánh các biến thể của sự dịch chuyển hóa học (tuần
tự gấp mẫu) của năm nguyên tử cuối cùng với các biến thể của các tripeptit tương tự như một
cơ sở dữ liệu. Cơ sở dữ liệu này hiện chứa thông tin khoảng 20 protein của các cấu trúc nổi
tiếng đại diện cho khoảng 3000 bộ ba.
Talos là một phương pháp thực nghiệm, các giá trị góc là giá trị không chính xác và không
chắc chắn đối với các đại lượng quan trọng. Talos cho kết quả tốt hơn khi được sử dụng kết
hợp với các giá trị hằng số khớp nối.
c. Khớp nối các hằng số
23

24. 24
Hằng số khớp nối là sự tách các đỉnh proton kép ra bằng hertz . Để phân tích protein theo ba
chiều không gian, việc khớp nối các hằng số được sử dụng thường xuyên nhất là trong liên kết
giữa HN và Hα. Thí nghiệm NMR HNHA (Geerten W. Vuister, 1993) được sử dụng để xác
định các hằng số khớp nối ( 3 J HNHa ). HNHA quang phổ gồm có ba chiều (F 1 ( 15 N), F 2 ( 1 H),
F 3 ( 1 HN) (Cavanagh et al, 1996). Trên quang phổ này, tỷ lệ các tương tác giữa các đỉnh
đường hoành và các đỉnh đường chéo cho một lượng dư nhất định và tỷ lệ thuận với 3 J HNHa .
Ta xác định giá trị của 3 J HNHa bằng phương trình dưới đây :
Phương trình 3: Phương trình cho ta biết được khớp nối liên tục 3 J HNHa
Một khi các hằng số khớp nối thu được cho tất cả các axit amin của protein mà ta đang nghiên
cứu, thì nhờ có mối quan hệ Karplus (Harbison, 1993) thể hiện trong Hình 2-18 , chúng ta có
thể chuyển các hằng số khớp nối vào trong các giới hạn của góc nhị diện Φ.
Hình 2-18: Biểu đồ Karplus mô tả sự biến đổi của các khớp nối liên tục 3 J HNHa F với góc nhị
diện của chuỗi mạnh.
Khi các khớp nối liên nhỏ hơn 6 Hz, góc Φ được tìm thấy là khoảng 60 độ trong một chuỗi
xoắn cấu trúc thứ cấp. Khi lớn hơn 8 Hz, góc Φ là khoảng 120 độ (ß-sheet). Khi nó là hằng số
24

25. 25
từ 6 đến 8 Hz thì khớp nối không được sử dụng như là một ràng buộc cấu trúc bởi (Cavanagh
et al, 1996).
Những ràng buộc nhị diện Φ giúp ích cho việc tính toán các cấu trúc protein. Tùy thuộc vào
góc, một khu vực sẽ tạo thành một cấu trúc thứ cấp trong tấm β hoặc xoắn α. Sơ đồ
Ramachandran cho thấy các khu vực và Φ mà tại đó thuận lợi cho việc tạo thành xoắn và các
tấm β
Hình 2-19: Biểu đồ Ramachandran biểu diễn những vùng giá trị góc nhị diện Φ và Ψ.
(Branden và Tooze, 1991).
d. Giới hạn liên kết hydro :
Liên kết hydro là tương tác tĩnh điện giữa một nguyên tử hydro gắn liền với một nguyên tử có
độ âm điện cao và một cặp electron tự do nằm trên một nguyên tử (O, S hoặc N) của một
25

26. 26
nhóm khác. Khoảng cách của các liên kết hydro thay đổi từ 2,7 đến 3,1 Å (Văn Holde và
Mathews, 1990). Khó khăn của các liên kết hydro có thể được biết đến trong việc đo vận tốc
trao đổi của amit khi protein được hòa tan trong deuterium. Deuterium không hiển thị trong
NMR quang phổ 1 H do đó cần nhiều thời gian hơn trước khi sự biến mất của đỉnh, proton trao
đổi dễ dàng hơn với các dung môi nên liên kết hydro cũng dễ hình thành hơn.
Có nhiều loại ràng buộc cấu trúc khác có thể được sử dụng để xác định cấu trúc ba chiều của
protein, nhưng chúng không được sử dụng trong nghiên cứu này.
2.2.2.6. Protein động lực
Trạng thái nghỉ là quá trình mà các spin của các hạt nhân trong mẫu trở lại trạng thái cân bằng
sau khi được kích thích. Trạng thái cân bằng là trạng thái mà mức năng lượng tương ứng với
một phân bố Boltzmann. Tỷ lệ nghỉ chịu ảnh hưởng bởi tính chất vật lý và tính năng động của
phân tử đó. Do đó, một nghiên cứu của quá trình nghỉ sẽ cho ta biết các thuộc tính năng động
của các phân tử. Để mô tả các đặc tính này, ta cần đo một số thông số
Thứ nhất, thời gian nghỉ T1 (đôi khi được gọi là theo chiều dọc hoặc spin mạng) đặc trưng cho
sự cân bằng năng lượng hạt nhân sau khi kích thích. Trạng thái nghỉ này là do tương tác với
môi trường. Thời gian nghỉ ngang T 2 (còn gọi là spin-spin) cũng cho phép quay trở lại trạng
thái cân bằng, nhưng dọc theo trục x và y (Levitt, năm 2001). Thông
thường, 15 NT 1 và 15 NT 2 được phân tích cho sự năng động của mạch.
2.2.2.7. Tính toán của các cấu trúc ba chiều
Sự mô phỏng cấu trúc ba chiều được thực hiện bằng cách sử dụng tất cả các thông tin được
biết cho đến nay trên protein. Trình tự protein và các ràng buộc cấu trúc đề cập ở trên là những
thành phần thiết yếu được sử dụng trong các phần mềm tính toán. Mục đích là để tạo ra một
tập hợp của các cấu trúc phù hợp với các giới hạn thử nghiệm, trong khi vẫn giữ được cấu trúc
hình học của các axit amin và các peptit.
ARIA là một chương trình được phát triển trong những năm gần đây như chương trình tự động
phân tích các dữ liệu NMR. Nó làm tăng tốc viêc phân tích các dữ liệu thực nghiệm khác bằng
cách quy về NOESY quang phổ. ARIA cũng là một hệ thống hiệu chuẩn của Noe (Linge et al,
2001).
26

27. 27
Sự mô phỏng các cấu trúc ở nhiệt độ cao cho phép nghiên cứu các cấu trúc đó mà không cần
đưa cả hệ đến nhiệt độ yêu cầu. Phương pháp này cho phép tạo ra cấu trúc để ổn định trước
mọi sự thay đổi nhiệt độ. Các cấu trúc ứng với năng lượng thấp nhất được lưu giữ cho phiên
bản kế tiếp.
Hình 2-20: Sơ đồ đại diện cho tính toán động học phân tử của các cấu trúc mô phỏng luyện
kim (MDSA) Hình từ www.bip.bham.ac.uk/osmart/bcm311_pef/slide27.html.
Trong một tính toán của cấu trúc ba chiều NMR, các cấu trúc được tạo ra được chồng lên để
xác định chất lượng và độ chính xác. Cấu trúc khác cũng tương tự, cộng với giá trị của
RMSD. RMSD có thể được tính trên mạch, các nguyên tử nặng (C, O, N, S) hoặc các phần
khác nhau của chuỗi protein. RMSD được tính toán bằng cách sử dụng phương trình sau đây.
27

28. 28
Phương trình 4: Phương trình của RMSD .N là số lượng mẫu. r i và r i ‘ đại diện cho cấu trúc.
Các vùng N-cuối và C-cuối của protein thường có cấu cho RMSD cao hơn. Loops (vùng giữa
hai cấu trúc thứ cấp) thường có một khu vực cao hơn RMSD và có cấu trúc như xoắn α và các
tấm beta.
Tài liệu tham khảo :
28

29. 29
http://archimede.bibl.ulaval.ca/archimede/fichiers/21738/
http://fr.wikipedia.org/wiki/R%C3%A9sonance_magn%C3%A9tique_nucl%C3%A9aire
http://glycobase.univ-lille1.fr/documents/livreRMN.PDF
http://www.cours-medecine.info/biochimie/structure-proteines.html
Công cụ hỗ trợ:
https://www.google.com.vn/
http://translate.google.com.vn/
29