Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research volume 2, issue 1, 2014

Volume 2, Issue 1 (Jan-Feb), 2014
ISSN 0719-4250
Content: Pages
IFC (Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research) ii
Revisión│Reviewer
Graciela Granados-Guzmán, Noemí Waksman de Torres, Rocío Castro-Ríos, Ricardo Salazar-
Aranda (2014) Ensayos de alto rendimiento utilizados en farmacognosia: Selección, optimización y
validación de métodos de inhibición enzimática por espectrofotometría UV-visible [High-
throughput screening assay used in pharmacognosy: Selection, optimization and validation of
methods of enzymatic inhibition by UV-visible spectrophotometry].
1-13
Original article│Artículo original
Iasmim C. Lima, Rosane Nora, Mário G. de Carvalho, Douglas S.A. Chaves (2014) Distribution and
chemotaxonomic significance of phenolic compounds in Spermacoce verticillata (L.) G. Mey
[Distribución e importancia quimiotaxonómica de los compuestos fenólicos en Spermacoce
verticillata (L.) G. Mey].
14-18
J Pharm Pharmacog Res
JPPRes

http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2014) 2(1):ii
Volume 2, Issue 1 (Jan-Feb), 2014
Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research
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Review | Revisión
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Ensayos de alto rendimiento utilizados en farmacognosia: Selección,
optimización y validación de métodos de inhibición enzimática por
espectrofotometría UV-visible
[High-throughput screening assay used in pharmacognosy: Selection, optimization and validation of
methods of enzymatic inhibition by UV-visible spectrophotometry]
Graciela Granados-Guzmán, Noemí Waksman de Torres, Rocío Castro-Ríos, Ricardo Salazar-Aranda*
Departamento de Química Analítica, Facultad de Química Analítica. Universidad Autónoma de Nuevo León. Madero y Aguirre Pequeño s/n,
Colonia Mitras Centro. Monterrey, N. L., México.
* E-mail: ricardo.salazarar@uanl.edu.mx
Abstract Resumen
In research laboratories of both organic synthesis and extraction of
natural products, every day a lot of products that can potentially
introduce some biological activity are obtained. Therefore it is necessary
to have in vitro assays, which provide reliable information for further
evaluation in in vivo systems. From this point of view, in recent years has
intensified the use of high-throughput screening assays. Such trials
should be optimized and validated for accurate and precise results, i.e.
reliable. The present review addresses the steps needed to develop and
validate bioanalytical methods, emphasizing UV-Visible spectro-
photometry as detection system. Particularly focuses on the selection of
the method, the optimization to determine the best experimental
conditions, validation, implementation of optimized and validated
method to real samples, and finally maintenance and possible transfer it
to a new laboratory.
En los laboratorios de investigación, tanto de síntesis orgánica como de
extracción de productos naturales, diariamente se obtienen una gran
cantidad de productos que potencialmente pueden presentar alguna
actividad biológica. Por esta razón es necesario contar con ensayos in vitro
que proporcionen información confiable para continuar la evaluación en
sistemas in vivo. Desde este punto de vista, durante los últimos años se ha
intensificado el uso de ensayos de alto rendimiento. Dichos ensayos
deben ser optimizados y validados para obtener resultados exactos y
precisos, es decir confiables. En la presente revisión se abordan las etapas
necesarias para desarrollar y validar métodos bioanalíticos, haciendo
énfasis en la espectrofotometría Ultravioleta-Visible como sistema de
detección. Particularmente se enfoca en la selección del método, la
optimización para determinar las mejores condiciones experimentales, la
validación, la aplicación del método optimizado y validado a muestras
reales y, por último, el mantenimiento y posible transferencia de éste a un
nuevo laboratorio.
Keywords: High-throughput screening assays; validation studies; in vitro. Palabras Clave: Ensayos de rastreo de alto rendimiento; estudios de
validación; in vitro.
ARTICLE INFO
Received | Recibido: January 9, 2014.
Received in revised form | Recibido en forma corregida: February 7, 2014
Accepted | Aceptado: February 10, 2014.
Available Online | Publicado en Línea: February 21, 2014.
Declaration of Interests | Declaración de Intereses: Los autores declaran no tener conflicto de interés.
Funding | Financiación: no declarada.

Granados-Guzman et al. Validación de ensayos de alto rendimiento
http://jppres.com/jppres J Pharm Pharmacogn Res (2014) 2(1): 2
INTRODUCCIÓN
Los ensayos de alto rendimiento surgieron
hace dos décadas y se han convertido en una
herramienta ampliamente utilizada en la
búsqueda de nuevos fármacos. Debido a que se
trata de métodos in vitro, han sido fuertemente
promovidos por todos los sectores industriales
con el propósito de poder generar datos
confiables que sean más relevantes para
humanos, además de disminuir el uso de
animales de estudio (Szymański et al., 2012).
Los ensayos de alto rendimiento son bási-
camente procesos de rastreo y ensayo que se
enfocan en un solo mecanismo. Son utilizados
tanto por científicos industriales como por inves-
tigadores académicos. Su propósito principal es
acelerar el descubrimiento de nuevos fármacos,
mediante el rastreo de una gran cantidad de
compuestos a una velocidad que puede exceder
los varios cientos de compuestos por día o por
semana, lo cual es de vital importancia ya que en
síntesis química se genera un gran número de
nuevos compuestos. Esta alta demanda de resul-
tados hace necesario que los ensayos se lleven a
cabo en placas de 96 o más pozos, siendo el
sistema de detección UV-Vis el más ampliamente
utilizado, aunque existen otros como, por
ejemplo, la fluorescencia. Los ensayos de alto
rendimiento son también utilizados para la
caracterización metabólica y farmacocinética, así
como para obtener datos toxicológicos sobre
nuevos fármacos (Szymański et al., 2012; Martis et al.,
2011; Schroeder et al., 2011). Uno de los puntos más
interesantes de la tecnología de estos ensayos, es
que puede reducir costos, lo cual ha hecho que se
consideren como métodos alternativos a aquellos
que utilizan equipos especializados como HPLC y
su utilidad no se restringe sólo al desarrollo de
nuevos fármacos, sino que se utilizan en el moni-
toreo de contaminantes en agua y suelos, en el
estudio del metabolismo de plantas, evaluación
de la actividad de extractos de plantas, estudios
en la calidad de carnes y otros alimentos, estudio
de la toxicidad de diversas sustancias, etcétera.
Sin embargo, para considerar a los bioensayos
como una alternativa real a procesos cuanti-
tativos más costosos, en necesario llevar a cabo
una validación analítica de éstos.
El objetivo general de llevar a cabo la
validación analítica de cualquier procedimiento,
es demostrar que el método es aceptable para los
propósitos previstos, los cuales en el caso que nos
ocupa pueden ser determinar la actividad bio-
lógica o farmacológica de una nueva entidad
química. En general, la calidad de un ensayo está
definida por la robustez y reproducibilidad de
una señal detectable que permite que un proceso
biológico sea cuantificado, ya sea en ausencia de
cualquier compuesto de prueba o en la presencia
de compuestos (Elli-Lilly, 2007). Sin embargo, como
lo expresa Stevenson (2011) “uno de los retos es
obtener medidas absolutas de exactitud, lo cual es
de suma importancia, ya que la falta de exactitud
dificulta comparar los resultados de dos ensayos,
así como su capacidad para ser reproducidos”. Si
bien se pueden realizar comparaciones de
precisión, basadas en replicados, esto no es
directamente transferible a la exactitud. Aun
utilizando la mejor tecnología disponible, dos
ensayos pueden mostrar diferencias en las medias
y la precisión, incluso asumiendo que uno de los
ensayos precede al segundo, por lo que no se
puede elegir con confianza entre alguno de los
dos resultados. Todo esto se vuelve sumamente
relevante cuando se quiere transferir un método
de un laboratorio a otro.
Esta problemática se ejemplifica con el méto-
do cromogénico de inhibición de α-glucosidasa.
Una síntesis de los resultados obtenidos de una
búsqueda bibliográfica acerca de la aplicación de
dicho método se puede ver en la Tabla 1. La
evaluación de la inhibición enzimática (Fig. 1) se
realiza midiendo la producción del p-nitrofenol
liberado a partir del p-nitrofenil-α-D-glucopira-
nosido a 405 nm. En presencia de un inhibidor se
aprecia una disminución en la absorbancia.
Diversos trabajos de investigación incluyen el
compuesto acarbosa como control positivo o
compuesto de referencia.
A partir de los datos de la Tabla 1 se puede obser-
var que los resultados de inhibición enzimática
reportados por el control positivo, acarbosa son
muy diferentes con un rango de valores de CI50
desde 0,00037 hasta 17 mg/mL. Incluso, los
resultados son diferentes cuando se utilizó el
mismo método con “pequeñas variaciones”, como

Tabla 1. Revisión del procedimiento de inhibición de α-glucosidasa, de levadura.
CI50
acarbosa
(mg/mL)
Autor Enzima
(U/mL)
PNPG
(mM)
PNPG
(mg)
Buffer
fosfatos
(M)
pH Temp.
(°C)
Incu-
bación
(min)
λ
(nm)
Vol.
Total
(mL)
Otros componentes DMSO Método utilizado
< 0,010 Ren et al., 2011 0,040 0.5 0,003 N.I. 6,8 37 5/30 405 0,2 0,1 M Na2CO3 no Kim et al., 2004
0,00037 Apostolidis & Lee,
2010
1,000 5 0,075 0,1 6,9 25 10/5 405 0,2 N.I. no N.I.
0,029 Lee et al., 2008 3,000 20 0,063 N.I. 6,5 37 10/35 405 0,1 N.I. no Pistia-Brueggeman &
Hollingsworth, 2001
0,15 Wang et al., 2012 1,000 5 0,075 0,1 6,9 25 10/5 405 0,2 N.I. meOH Apostolidis & Lee, 2010
0,27 Wu et al., 2011 0,500 N.I. N.I. 0,1 6,9 37 10/60 400 2 N.I. meOH Chapdelaine et al., 1978;
Matsui et al., 1996
0,437 Chan et al., 2010 0,032 2 0,090 0,1 7 37 20 400 320 N.I. si Matsui et al., 1996
0,504 Choudhary et al.,
2010
0,250 0,7 N.I. 0,05 6,9 37 N.I. 400 N.I. N.I. no Matsui et al., 1996
0,678 Heo et al., 2009 0,700 5 0,075 0,1 7 T. amb 5/5 405 0,11 2 g/L AB+0,2 g/L NaN3 si Watanabe et al., 1997
0,678 Lee et al., 2010 0,700 5 0,075 0,1 7 T. amb 5/5 405 0,11 2 g/L AB+0,2 g/L NaN3 si Watanabe et al., 1997
0,894 Kang et al., 2011 0,200 2,5 0,015 N.I. 6,8 37 15/15 405 0,24 0,2 M Na2CO3 si Kang et al., 2009
1,081 Kang et al., 2012 0,200 2,5 0,015 N.I. 6,8 37 15/15 405 0,24 0,2 M Na2CO3 si Kang et al., 2011
6,2 Subramanian et al,,
2008
0,100 N.I. N.I. 0,1 7 T. amb 5/5 405 N.I. 2 g/L AB+0,2 g/L NaN3 si Kim et al., 2000
10 Linwei et al., 2012 0,075 3 1,247 0,67 6,8 37 30 400 3,48 0,1 M Na2CO3 no Kim et al., 2004
17 Shai et al., 2010 0,600 2,9 N.I. N.I. 6,9 25 5 405 N.I. hervir 2 min si Matsui et al., 1996
N.I. Hou et al., 2009 0,010 10 N.I. N.I. n. i. 37 30 400 0,5 0,1 M Na2CO3 no Matsui et al., 1996
AB: Albúmina bovina; CI50: Concentración inhibitoria 50; DMSO: Dimetilsulfóxido; meOH: Metanol; N.I.: Dato no indicado; PNPG: p-Nitrofenil-α-D-glucopiranosido; T.
amb.: Temperatura ambiente.

Figura 1. Reacción del sustrato p-nitrofenil-α-D-gluco-
piranosido con α-glucosidasa.
en el caso de Chan et al. (2010), Choudhary et al. (2010),
Shai et al. (2010) y Hou et al. (2009) quienes utilizaron
como método base el propuesto por Matsui et al.
(1996).
Los valores de CI50 que se presentan en la
Tabla 1, se obtuvieron utilizando acarbosa, en una
solución de reacción totalmente transparente. Sin
embargo, en todos los trabajos que se listan en la
Tabla 1, se evaluó la actividad de extractos
naturales: de plantas, de hongos o de algas. En
ninguno de esos trabajos se menciona si los
extractos presentaban alguna coloración; sin
embargo, se sabe que las plantas contienen una
gran cantidad de compuestos polifenólicos como
los flavonoides, que por sí mismos tienen color.
Los compuestos polifenólicos (puros o en
extractos) reaccionan con Na2CO3 produciendo el
ion fenóxido, que presenta una coloración
amarilla. Si la medición se realiza a una longitud
de onda entre 400-405 nm, la presencia del ion
fenóxido constituye una interferencia importante,
por lo que pudieran descartarse compuestos
útiles por fallas en el manejo de la técnica
instrumental. Esta interferencia de color, debe ser
tomada en cuenta pues afecta la exactitud de la
determinación. Una opción para lograrlo, es
tomar la absorbancia de la muestra como blanco
para eliminar la interferencia de la matriz.
Si bien no existe un consenso general acerca
de cómo se debería llevar a cabo un proceso de
validación para bioensayos, en la literatura se
ofrecen diferentes guías prácticas. Por ejemplo,
Ederveen (2010) en su reporte “A practical approach
to biological assay validation” propone cuatro
etapas a seguir para desarrollar y validar un
ensayo biológico. Estas se presentan en la Fig. 2.
La presente revisión se enfoca en ensayos que
utilizan la técnica espectrofotométrica UV-Vis,
que además se caracteriza por ser sencilla,
económica y versátil.
Figura 2. Etapas del proceso para el desarrollo y validación
de un ensayo bioanalítico.
Selección del método
Es importante recordar que los ensayos in vitro
se desarrollan en ambientes artificiales en los que
los sistemas biológicos estudiados pueden ser
inestables o bien exhibir actividad por debajo de
su potencial. Además, existe un gran número de
bioensayos en los cuales los métodos base se
llevan a cabo en volúmenes superiores a 1 mL; sin
embargo, para que puedan considerarse de alto
rendimiento, tienen que llevarse a cabo la
miniaturización en placas de 96 o más pozos,
para poder cumplir así con el principal requisito
de este tipo de ensayos, que es el poder analizar
un gran número de muestras en corto tiempo.
En este tipo de ensayos, se utilizan soluciones
diluidas almacenadas por largos períodos de
tiempo y es necesario mantener una baja varia-
bilidad y respuestas suficientemente altas.
Como una primera fase es recomendable
seleccionar un método base. Dicha selección está
relacionada con el propósito y resultados que se
requieren del experimento, así como de otros
factores logísticos y limitaciones en la operación
como pueden ser costos, equipo y reactivos
disponibles, tiempo y bioseguridad (Ederveen, 2010).
En lo relativo al equipo con el que se lleva a
cabo el análisis, es necesario tomar en cuenta las
condiciones en que se utiliza, sus características
técnicas y limitaciones. En el caso de la espectro-
fotometría UV, se debe considerar la longitud de

onda de trabajo, además si el instrumento cuenta
con un monocromador o filtros, el material de las
celdas de lectura, la precisión y sensibilidad
propia del instrumento, así como las limitaciones
de la ley de Beer.
De acuerdo con Macarrón y Hertzberg (2011), la
estabilidad de los reactivos debe ser evaluada
utilizando las mismas condiciones previstas para
el experimento, así mismo debe monitorearse si
la señal va disminuyendo con el tiempo, ya que
en los ensayos de alto rendimiento los requeri-
mientos de estabilidad son mayores que en otras
áreas de investigación. La guía para el desarrollo
de ensayos y ensayos de alto rendimiento (Elli-
Lilly, 2007) recomienda determinar la estabilidad
de los reactivos tanto en condiciones de almace-
namiento como de ensayo tomando en cuenta:
las especificaciones del fabricante, las condicio-
nes de almacenamiento y los resultados de un
monitoreo de la señal del reactivo a través del
tiempo.
La calidad de un ensayo está determinada por
su capacidad para distinguir con exactitud una
diana de otra que no lo es. Para este propósito es
indispensable el uso de controles positivos y
negativos o blancos. Un análisis cuidadoso de los
controles permitirá identificar errores en la
manipulación de reactivos o el procesamiento de
muestras. Los problemas obvios deben resolverse
antes de validar el ensayo. Aún después de
solucionar estas fallas, se pueden esperar errores
aleatorios debidos a fallas en el equipo o fallas
usuales en el laboratorio. Estos errores deben ser
tomados en cuenta cuando se realice la vali-
dación del ensayo (Macarrón & Hertzberg, 2011).
Optimización del método
Un ensayo de alto rendimiento debe realizare
bajo las condiciones óptimas. Establecer dichas
condiciones se facilita con el uso de un diseño de
experimentos. Es importante señalar que cuando
se realiza una búsqueda bibliográfica de un ensa-
yo particular, generalmente se encuentra que se
hicieron “pequeñas modificaciones” a los méto-
dos base, sin embargo no se menciona si se rea-
lizó una optimización o incluso si se evaluó algún
parámetro de validación.
Un gran número de factores pueden ser
evaluados en un proceso de optimización; sin
embargo, el conocimiento previo de las variables
involucradas es de mucha ayuda en la selección
de los más apropiados. Los factores más comu-
nes en los ensayos in vitro son los siguientes:
 Concentración de reactivos (sustrato, fuen-
te de radicales libres, buffers, etc.).
 Tiempo y temperatura de incubación.
 Solvente utilizado.
 Longitud de onda de lectura.
 Sensibilidad a la luz.
 Forma en que se detiene la reacción.
 Origen de los reactivos (p. ej. fuente de
enzimas, marca, grado de pureza).
Además, es necesario considerar las limita-
ciones propias de la técnica, como por ejemplo el
cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer o el
efecto del ruido instrumental. La ley de Lambert-
Beer enuncia que para una radiación monocro-
mática, la absorbancia es directamente propor-
cional al camino óptico a través del medio y la
concentración de la especie absorbente (Skoog et
al., 2008). Si esta ley no se cumple, se pierde la
proporcionalidad y, por lo tanto, no se tiene la
relación entre la absorbancia que se obtiene expe-
rimentalmente y la concentración del analito en
cuestión.
Diseño de experimentos
Si bien la optimización clásica de los factores
experimentales se lleva cabo variando un factor
mientras el resto se mantienen constantes, en el
proceso de optimización de ensayos bioanalítcos
el número de variables a estudiar puede ser muy
grande. Abordarlas de manera individual resulta
poco conveniente, ya que puede ser un proceso
largo por el gran número de pruebas necesarias.
Además, las conclusiones obtenidas en el estudio
de cada factor tendrán validez restringida, porque
no es posible estudiar la interacción entre los
mismos. Adicionalmente, en la mayoría de los
casos es inviable debido al alto costo y el tiempo
invertidos.
Los diseños de experimentos se definen como
una secuencia completa de pasos que aseguran
que se obtendrán los datos apropiados, de modo
que permitan un análisis objetivo que conduzca a

deducciones válidas con respecto al problema
establecido (Mercado Hernández y Santoyo Stephano,
2005).
El objetivo de un diseño de experimentos es
estudiar si el cambio en un factor produce una
mejora en el proceso, para lo cual es necesario
realizar pruebas que lo demuestren. La meto-
dología de los diseños de experimentos estudia
como variar las condiciones (factores) habituales
de realización de un proceso, para aumentar la
probabilidad de detectar cambios significativos
en la respuesta, de esta forma se obtiene un
mayor conocimiento del comportamiento del
proceso de interés.
En el diseño de experimentos clásico se elige
cierto número de factores que se considera tienen
efecto sobre la respuesta. Dependiendo del
número de factores y de sus posibles rangos, se
puede elegir entre diferentes diseños. Todos los
factores se varían de manera simultánea y
sistemática, lo cual permite que puedan ser medi-
das la significancia de un factor específico o bien
la interacción entre ellos. Por lo general, los
factores que se utilizan son los extremos de los
rangos de operación y se puede utilizar una fun-
ción lineal o polinominal para interpolar la región
entre esos extremos (Lutz et al., 1996).
Entre los diseños de experimentos disponibles,
la elección está determinada por el objetivo del
experimento y el conocimiento que se tenga de
las condiciones experimentales del ensayo. Entre
estos diseños se pueden mencionar los de rastreo,
los factoriales, ya sea fraccionados o completos,
los de superficie de respuesta y los generados por
computadora (Altekar et al., 2006).
Los diseños de rastreo son conocidos también
como de Resolución III y se utilizan para explorar
condiciones experimentales cuando se conoce
poco del ensayo. Con este tipo de diseños es
posible encontrar el efecto de cada factor, pero
no se pueden interpretar las interacciones.
El diseño factorial completo es conceptual-
mente el más sencillo de establecer y de inter-
pretar. Los datos que se obtienen para todas las
combinaciones de factores, permiten el estudio
de cada factor y de la interacción entre ellos. Por
su parte, en el diseño factorial fraccionado se
realiza una menor cantidad de experimentos y,
por lo tanto, no se obtiene información de todas
las interacciones, mientras que en el factorial
completo al haber una mayor cantidad de
pruebas si puede conseguirse esta información.
El modelo de superficie de respuesta se utiliza
para obtener información precisa sobre los
efectos de un factor incluyendo su magnitud y
dirección. Este tipo de diseño proporciona una
predicción precisa de las respuestas dentro de la
región experimental y es muy útil para identificar
las condiciones óptimas. El diseño Box-Behnken,
una variante del modelo de superficie de res-
puesta, permite la estimación de los efectos
principales, interacción de dos factores y efectos
cuadráticos. Es útil cuando un conjunto de
factores puede ser considerado como las condi-
ciones estándar después de algunos diseños de
rastreo factorial.
El diseño D-óptimo es un diseño generado por
computadora en el que el usuario elige un nú-
mero aceptable de corridas, identifica los efectos
principales y las interacciones de interés y permi-
te a la computadora generar un diseño.
Actualmente se cuenta con una gran variedad
de programas para realizar el diseño de
experimentos, entre los cuales se encuentran:
STATGRAPHICS, MODDE, STATA, etc. en sus
diferentes versiones.
Optimización del parámetro con mayor influencia
Una vez realizada la valoración de los
parámetros más influyentes se procede a
encontrar las condiciones óptimas para cada
factor. El camino a seguir depende de los resul-
tados del diseño de experimentos. Si más de un
factor o la interacción de éstos tienen efecto
significativo sobre el ensayo, se puede realizar un
método simplex o un diseño de superficie de
respuesta para encontrar las condiciones óptimas.
Pero si sólo un factor tiene efecto relevante sobre
el ensayo, se deben realizar pruebas variando la
concentración de éste, hasta encontrar las
mejores condiciones experimentales.
Validación de ensayos de alto rendimiento
Los ensayos de alto rendimiento requieren de
experimentos basados en principios científicos
aceptados, en los que se utilicen controles apro-

piados que puedan demostrar que el trabajo
experimental se lleva a cabo de manera adecuada;
por lo que, además de optimizar las condiciones
experimentales para lograr el mejor desempeño,
es muy importante asegurar que los resultados de
los experimentos sean exactos, confiables y repro-
ducibles. Con este propósito se utiliza la valida-
ción analítica de cualquier ensayo, la cual además
puede establecer las limitaciones de dicho
ensayo.
Los parámetros que deben evaluarse durante
una validación analítica de los ensayos de alto
rendimiento aparecen en diversos reportes y artí-
culos de revisión como los de Ederveen (2010),
Tuomela et al. (2005) y Rozet et al. (2011) en los cuales se
hace referencia a guías Internacionales como las
de la ICH, la IUPAC, la AOAC y la EURACHEM.
Además, recientemente han surgido guías espe-
cíficas para bioensayos o ensayos bioanalíticos
tales como: la guía para la industria relacionada
con validación de métodos bioanalíticos emitida
por el Departamento de Salud de Estados Unidos
y la FDA (US DHHS & FDA, 2001); la Guía de valida-
ción específica para ensayos de alto rendimiento
realizada por la compañía Eli Lilly (2007), el reporte
para ensayos biológicos realizado por Ederveen
(2010); y el capítulo 1033 de la USP dedicado a la
validación de ensayos biológicos (USP, 2010).
Uniformidad de placa y evaluación de la variabi-
lidad de la señal
Un ensayo de alto rendimiento debe realizarse
en placas de 96 o más pozos. La evaluación de la
uniformidad de placa es básicamente la evalua-
ción de la precisión dentro de una misma placa y
entre ellas.
Para realizar esta determinación se utilizan
tres niveles de señal, que se traducen en tres
niveles de concentración:
 Señal máxima: es la medida de la señal
máxima que puede presentarse.
 Señal mínima: mide el ruido de fondo de la
señal. En ensayos de inhibición se trata de
una reacción sin estímulo.
 Señal media: estima la variabilidad de la
señal en un punto entre la señal máxima y
mínima. Para ensayos de inhibición es la
CI50 del control positivo.
Las pruebas deben realizarse con reactivos
preparados de forma independiente y preferente-
mente debe repetirse la prueba en diferentes días.
Para cada señal debe calcularse el coeficiente de
variación en cada placa, el cual deberá ser menor
al 20% (Elli-Lilly, 2007).
Factor Z
Este parámetro, descrito por Zhang et al., (1999),
es un coeficiente adimensional que proporciona
una medida de separación entre los controles
positivos (máxima señal) y negativos (señal
mínima) en un ensayo, es decir, representa la
variabilidad y el rango dinámico entre este
conjunto de controles.
La Tabla 2 presenta el significado de los valores
para este factor. El factor Z es por tanto, un dato
que califica la calidad del ensayo y que toma en
cuenta, además, la variación asociada con la
medida de controles de referencia. Se calcula
utilizando la fórmula siguiente:
*
*33
1
controldelmediamuestralademedia
controldelDEmuestradeDE
Z



Donde:
DE: Desviación estándar
*Nota: si se trata de un ensayo de activación/agonista, se
tomarán los datos del control positivo (que proporciona la
señal máxima); si se trata de un ensayo de
inhibición/antagonista, se tomarán los datos del control
negativo (que proporciona la señal mínima).

Tabla 2. Valores y significado del factor Z (Zhang et al., 1999).
Valor del Factor Z Estructura del ensayo Ensayo
1 DE=0 no hay variación o el rango dinámico tiende al infinito. Ideal
1>Z> 0,5 Ventana de detección grande. Excelente
0.5>Z>0 Ventana de detección pequeña. Pobre
0 No hay ventana de detección, la variación de la señal de la muestra y la
variación de la señal del control son muy cercanas.
Poco confiable
<0 No hay ventana de detección, la variación de las señales de muestra y control se
superponen.
Imposible
Linealidad
Ya que en los artículos de revisión para validar
métodos bioanalíticos se hace referencia a la guía
de la ICH (2005), se toma en cuenta la siguiente
definición: la linealidad de un proceso analítico se
define como la capacidad (en un rango dado) de
obtener un resultado que sea directamente
proporcional a la concentración del analito en la
muestra. Si existe una relación lineal, la prueba
puede evaluarse utilizando un método estadístico
apropiado, como el cálculo de una regresión
lineal por el método de mínimos cuadrados. Para
establecer la linealidad se necesita un mínimo de
cinco concentraciones y se recomienda llevar a
cabo triplicados. Además, como se menciona en
la Guía para la Validación de Métodos Bio-
analíticos (US DHHS & FDA, 2001), para este tipo de
ensayos se debe generar una curva para cada
analito que se desee estudiar y ésta deberá ser
preparada en la misma matriz en la que se
supone estará el analito.
Para el caso de los ensayos de alto rendimiento
es sumamente importante establecer la lineali-
dad, ya que permite calcular de manera confiable
la concentración efectiva media (inhibitoria, letal,
tóxica, etc.) para las diferentes pruebas. Dicha
concentración media se utiliza para comparar la
efectividad de los compuestos evaluados, ya sean
nuevos o controles positivos.
Rango lineal
El rango de un procedimiento analítico se
define, según la ICH (2005) como el intervalo entre
la mayor y menor concentración del analito en la
muestra para la cual el procedimiento ha demos-
trado ser preciso, exacto y lineal. Normalmente,
el rango lineal deriva de estudios de linealidad y
depende de la aplicación que tendrá el proce-
dimiento.
En los ensayos de alto rendimiento es
importante que las concentraciones efectivas del
80, 50 y 20% se encuentren dentro del rango
lineal. Cuando se utiliza la técnica de espectrofo-
tometría UV es necesario que el rango lineal se
encuentre en el rango de mayor exactitud
espectrofotométrica. El rango de exactitud foto-
métrica ha sido calculado por diversos autores:
Ayres estableció que cuando se trabajaba con
valores de absorbancia entre 0,22 y 0,7 se logra la
mayor exactitud (Ayres, 1949); Rothman et al. (1975)
indicaron que el rango con mayor precisión
relativa es entre 0,2 y 0,8 (Skoog et al., 2008). Estos
valores dependen del error espectofotométrico
del instrumento.
Precisión
Las guías de la ICH (2005) y la OMS (1997), defi-
nen que la precisión de un procedimiento ana-
lítico expresa la concordancia (grado de disper-
sión) entre una serie de mediciones obtenidas de
un muestreo múltiple de la misma muestra
homogénea, bajo condiciones prescritas.
La precisión, por lo general, se expresa como
la varianza, desviación estándar o coeficiente de
variación (CV) de, al menos, nueve determina-
ciones que cubran un rango específico para el
procedimiento; por ejemplo, tres niveles de

Tabla 3. Formas de evaluar la precisión en ensayos bioanalíticos.
Precisión Fuente Referencia
Realizar un ANOVA para cada nivel de
concentración
Advances in validation, risk and uncertainty
assessment of bioanalytical methods
Rozet et al., 2011
El valor promedio no debe variar más de
15%, excepto cuando este cerca del LC
puede ser de 20%
Guidance for industry, bioanalytical method validation US DHHS & FDA,
2001
%DSR <10 Validation overview of bio-analytical methods Tuomela et al., 2005
El CV no debe variar más de 15%, excepto
cuando este cerca del LC puede ser de
20%
Guideline on bionalytical method validation EMEA/CHMP/EWP,
2011
LC: Límite de cuantificación; %DSR: Desviación estándar relativa; CV: Coeficiente de variación.
concentración (alto, medio y bajo) por triplicado.
En la Tabla 3, se listan los valores con los que se
puede considerar un método preciso. La precisión
se puede considerar a tres niveles: repetibilidad,
precisión intermedia y reproducibilidad:
 Repetibilidad: Expresa la precisión bajo
las mismas condiciones de operación en
un intervalo de tiempo corto. También se
conoce con el término de precisión intra-
ensayo.
 Precisión intermedia: Expresa la precisión
intra-laboratorios: diferentes días,
diferentes analistas, diferentes equipos,
etcétera.
 Reproducibilidad: Expresa la precisión
entre laboratorios (estudios colaborativos,
aplicados por lo general para estandarizar
una metodología).
Exactitud
La exactitud expresa la cercanía entre un valor
encontrado experimentalmente y un valor
convencional, aceptado como verdadero o un
estándar de referencia (US DHHS & FDA, 2001). La
exactitud se determina replicando el análisis de
muestras que contengan cantidades conocidas
del analito y deben realizarse al menos cinco
determinaciones por concentración. Se recomien-
da utilizar al menos tres concentraciones a
niveles alto, medio y bajo. En la Tabla 4, se
refieren los valores para considerar a un método
exacto.
Tabla 4. Evaluación de la exactitud para ensayos bioanalíticos.
Exactitud Fuente Referencia
El valor promedio no debe variar más de
15%, excepto cuando este cerca del LC
puede ser de 20%
Guidance for industry, bioanalytical method
validation
US DHHS & FDA,
2001
Cercana a 100%, además de consistente y
repetible.
Validation overview of bio-analytical methods Tuomela et al., 2005
El CV no debe variar más de 15%, excepto
cuando este cerca del LC puede ser de 20%
Guideline on bioanalytical method validation EMEA/CHMP/EWP,
2011
LC: Límite de cuantificación; CV: Coeficiente de variación.

En el caso de los ensayos de alto rendimiento,
la exactitud es el parámetro que causa la mayor
problemática. Como mencionan Tuomela et al.
(2005), “la determinación de la exactitud por lo
general requiere de un estándar de oro o bien, de
un método aceptado con el cual pueda ser
comparado el ensayo de interés”. La dificultad
reside en que no siempre se cuenta con un
estándar de referencia o de un método aceptado
para hacer una comparación. Cuando se presenta
este caso, una estrategia a seguir es adicionar
muestras reales con cantidades conocidas de un
analito (Ederveen, 2010; USP, 2010; Cendejas-Bueno et al.,
2012).
Por ejemplo, Cendejas-Bueno et al. (2012) validaron
un método por HPLC y un bioensayo para
cuantificar posaconazol en muestras de suero
humano. El bioensayo fue un método microbio-
lógico descrito anteriormente para monitorear el
posaconazol. La exactitud se determinó experi-
mentalmente utilizando muestras de suero
adicionadas con posaconazol a cinco niveles de
concentración (se estableció previamente una
curva de calibración) y se calculó la exactitud
como porcentaje de error relativo. También se
realizó una comparación entre los métodos
calculando el coeficiente de correlación intra
clase y por una regresión lineal por el método de
cuadrados perfectos y se consideró el método de
HPLC como el de referencia.
Por otro lado, Serra et al. (2005) realizaron la
validación de un ensayo colorimétrico para hacer
un rastreo in vitro de extractos de plantas con
potencial acción de inhibición sobre la enzima
convertidora de angiotensina (ECA). El método
se basó en la escisión del sustrato hipuril-glicil-
glicina por la enzima convertidora de angioten-
sina y su subsecuente reacción (de la glicil-
glicina) con el ácido trinitro-bencen-sulfónico
para formar la 2,4,6-trinitrofenil-glicil-glicina
cuya absorbancia se determina a 415 nm. En este
ensayo, no se utilizó un control positivo, sino que
se adicionó a diferentes muestras glicil-glicina a
tres niveles de concentración; es decir, se
adicionó directamente el compuesto que se
formaría, si la ECA reaccionara con el sustrato y
que forma el compuesto colorido con el ácido
trinitrobencensulfónico. La exactitud se calculó
como porcentaje de recuperación.
Límite de detección y cuantificación
El límite de detección (LD) se define como la
menor cantidad o concentración de un analito en
una muestra que puede distinguirse confiable-
mente de cero (IUPAC, 2002; AOAC, 2002). Existen
diversas formas de determinarlo y se utiliza la
que se ajuste a las necesidades del ensayo. La ICH
en su guía de validación para procedimientos
analíticos, menciona que se hace la evaluación
visual por medio del análisis de muestras con una
concentración conocida del analito (ICH, 2005). La
guía de la AOAC (2002) indica que el límite de
detección puede calcularse en base a la
variabilidad del blanco.
El límite de cuantificación (LC) es la menor
cantidad o concentración de analito en una
muestra que puede ser cuantificado con exactitud
y precisión aceptables (ICH, 2005). Básicamente, se
determina de la misma forma que el LD, de
hecho pueden calcularse de manera simultánea.
Especificidad o Interferencia de matriz
La validación, tal como lo establecen las guías
de Elli Lily (2007), USP (2010) e ICH (2005) se lleva a
cabo con controles positivos en solución; sin
embargo, las muestras reales, como los productos
naturales que son mezclas complejas de un gran
número de componentes, pueden causar inter-
ferencias durante la determinación, ya que
algunos pueden presentar color.
La especificidad de un método es la capacidad
de medir exacta y específicamente un analito en
presencia de componentes esperados en una
mezcla compleja. Puede ser expresada como el
error que se obtiene cuando el procedimiento
experimental se aplica al analito en presencia de
la matriz, comparado con el resultado que se
obtiene del analito sin ninguna sustancia añadida
(en solución); el error no tiene que ser del 0%,
pero deberá ser preciso y reproducible
(EMEA/CHMP/EWP, 2011). Otra forma de investigar
los efectos de matriz, es analizando por lo menos
seis replicados adicionados al máximo y mínimo

nivel de concentración (de acuerdo al rango
lineal). Se evalúa con el coeficiente de variación
para la concentración y este no debe exceder el
15% (EMEA/CHMP/EWP, 2011).
Robustez
La OMS define la robustez como el grado de
reproducibilidad de un ensayo utilizando las
mismas muestras (o controles), pero con peque-
ñas modificaciones a las condiciones estándares
(o condiciones validadas), como son: diferentes
temperaturas, tiempos de incubación, longitudes
de onda, etc. (Skoog et al., 2008). La robustez evalúa
las variables operacionales y ambientales del
método. Puede evaluarse ya sea mediante un
Análisis de Varianza (ANOVA) o bien, si las
variables que quieren estudiarse son muchas,
puede utilizarse un diseño de experimentos como
el factorial fraccionado.
Mantenimiento y mejora
Es altamente recomendable realizar el monito-
reo periódico del ensayo de alto rendimiento,
utilizando controles tanto positivos como
negativos. Cuando se obtengan resultados erró-
neos es importante comprobarlos y aplicar
acciones correctivas y preventivas, para garanti-
zar el buen desempeño del ensayo (Ederveen, 2010).
Para mantener en buen funcionamiento un
ensayo de alto rendimiento es recomendable:
 Utilizar el mismo equipo de la validación,
siempre que se mantenga calibrado y en
buenas condiciones.
 Especificar el material que se utiliza, para
mantener las mismas condiciones.
La fuente y/o características de los reactivos
deben mantenerse para utilizar reactivos de la
misma calidad.
Es importante llevar a cabo nuevamente las
pruebas de validación con controles en los casos
siguientes:
 Si se utiliza un nuevo estándar de
referencia, se debe probar junto con el
estándar anterior.
 Si se utiliza un nuevo equipo o software. Ya
que cada equipo cuenta con diferentes
características de precisión, exactitud y
sensibilidad propias.
 Si el ensayo lo llevará a cabo un nuevo
analista, en este caso se llevará a cabo un
panel con muestras problema para evaluar
si el entrenamiento fue exitoso.
 Si el ensayo se transferirá a un nuevo
laboratorio, se deben llevar a cabo las
pruebas de validación para asegurar que el
ensayo es reproducible con exactitud y
precisión, utilizando los controles
establecidos.
CONCLUSIONES
Si bien los ensayos de alto rendimiento se han
utilizado ampliamente durante un largo período
de tiempo y han demostrado ser de utilidad en
diferentes campos de la ciencia, sobre todo en el
descubrimiento de nuevos compuestos con acti-
vidad farmacológica, no se encuentran con
frecuencia trabajos donde se realicen la optimiza-
ción y la validación de los métodos biológicos.
Además, a pesar de que existen diversas guías que
hacen referencia a la validación de ensayos bio-
analíticos, parece no haber un consenso respecto
a los parámetros que deben ser validados. Por
este motivo se debieran atender las recomenda-
ciones de las diferentes guías y artículos de
revisión. Con el propósito de garantizar la
confiabilidad y calidad de los resultados obteni-
dos, particularmente la necesidad de utilizar
controles positivos y negativos reproducibles que
permitan comparar, de manera fidedigna, los
resultados inter-laboratorio.
CONFLICTO DE INTERÉS
Los autores declaran no poseer conflicto de interés.
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© 2014 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, 2 (1), 14-18
ISSN 0719-4250
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Distribution and chemotaxonomic significance of phenolic compounds
in Spermacoce verticillata (L.) G. Mey
[Distribución e importancia quimiotaxonómica de los compuestos fenólicos
en Spermacoce verticillata (L.) G. Mey]
Iasmim C. Lima, Rosane Nora, Mário G. de Carvalho, Douglas S.A. Chaves*
Department of Chemistry, Faculty of Pharmacy and Chemistry, Federal Rural University of Rio de Janeiro, CEP 23890-897, Seropédica,
Rio de Janeiro, Brazil.
* E-mail: gnosy.ufrrj@gmail.com
Abstract Resumen
Context: Spermacoce verticillata, known as “poaia and vassourinha de
botão”, is a species widely used in Brazilian traditional medicine as anti-
inflammatory, antipyretic and analgesic. It is a native species, small,
upright perennial, and broadly distributed throughout Brazil. Until now,
few chemical studies have focused on the phenolic composition of this
species.
Aims: Evaluate the phytochemical profile of phenolic compounds from
Spermacoce verticillata and search new compounds that have
chemotaxonomic significance.
Methods: Leaves of S. verticillata were extracted using distilled water.
The extract (SVL) was purified by several chromatography processes.
Extract and compounds were analyzed by HPLC-DAD and NMR.
Results: Phytochemical analysis led to identification, for the first time,
of three compounds (1-3) for the specie. Chlorogenic acid (1) was
identified by HPLC-DAD compared with reported in the literature.
Quercetin-3-O-rutinoside (rutin) (2) and kaempferol-3-O-rutinoside (3)
were isolated from butanolic fraction and identified by spectroscopic
analysis comparison with data reported in the literature. The flavonoid
rutin is the major compound in SVL followed by kaempferol-3-O-
rutinoside and chlorogenic acid.
Conclusions: This is the first report for these compounds (1-3) in S.
verticillata. The presence of these three new compounds indicates
chemical markers of the species for this genus and family. This
information is extremely important because increases the resources for
chemotaxonomic classification of these species.
Contexto: Spermacoce verticilada, conocida como "poaia y vassourinha
de botão", es una especie ampliamente utilizada como antiinflamatoria,
antipirética y analgésica en la medicina tradicional de Brasil. Es una
especie nativa, pequeña, perenne, erguida y ampliamente distribuida en
todo Brasil. Hasta el presente, pocos estudios químicos se han centrado en
la composición fenólica de esta especie.
Objetivos: Evaluar el perfil fitoquímico de compuestos fenólicos de
Spermacoce verticillata, en la búsqueda de nuevos compuestos que tienen
importancia taxonómica.
Métodos: Hojas de S. verticillata fueron extraídas con agua destilada. El
extracto (SVL) fue purificado por varios procedimientos cromatográficos
y, éste y los compuestos aislados, se analizaron por HPLC-DAD y RMN.
Resultados: El análisis fitoquímico condujo a la identificación, por
primera vez, de tres compuestos (1-3) para la especie. El ácido clorogénico
(1) fue identificado por HPLC-DAD en comparación con lo reportado en
la literatura. Quercetina-3-O-rutinósido (rutina) (2) y campferol-3-O-
rutinósido (3) fueron aislados de la fracción butanólica e identificados por
análisis espectroscópico en comparación con los datos reportados en la
literatura. El flavonoide rutina es el compuesto principal en SVL, seguido
de campferol -3-O-rutinósido y ácido clorogénico.
Conclusiones: Este es el primer informe para estos compuestos (1-3) en
S. verticillata. La presencia de estos tres compuestos nuevos, para esta
especie, están presentes como marcadores químicos de las especies de
este género y familia. Esta información es muy importante para aumentar
los recursos para la clasificación taxonómica de esta especie.
Keywords: Borreria verticillata; kaempferol-3-O-rutinoside; phenolic. Palabras Clave: Borreria verticillata; campferol-3-O-rutinósido; fenólico.
ARTICLE INFO
Received | Recibido: January 9, 2014.
Received in revised form | Recibido en forma corregida: February 3, 2014.
Accepted | Aceptado: February 5, 2014.
Available Online | Publicado en Línea: February 21, 2014.
Declaration of interests | Declaración de Intereses: The authors declare no conflict of interest.
Funding | Financiación: This work was financially supported by PROIC/UFRRJ and FAPERJ.

Lima et al. Phenolic compounds of Spermacoce verticillata
INTRODUCTION
The ethnopharmacological knowledge is useful
to identify potential therapeutic targets from
medicinal plants. Substances from vegetal king-
dom, which have already contributed with several
compounds in prophylaxis and treatment of a
large variety of pathologies, have been investigated
for their potential as anti-inflammatory and
antithrombotic agents (Chaves et al., 2011).
The Rubiaceae family comprises about 650
genera and 13 000 species (Bremer et al., 2009). The
genera Spermacoce (formerly called Borreria) is
composed of 280 species distributed throughout
the world (Dessein et al., 2006), including Brazil,
where several species are native as Spermacoce
verticillata (Chiqueiri et al., 2004).
Spermacoce verticillata (L.) G. Mey. (Rubia-
ceae), known as “vassourinha de botão”, is a
species that occurs over the entire Brazilian
territory and is commonly used in traditional folk
medicine to treat gastrointestinal disorders, ulcers
and as anti-inflammatory agent. The plant con-
tains indole alkaloids, which borrevine and borre-
verine are the major compounds, as well as flavo-
noids, terpenes, anthraquinone, phytosteroids and
iridoids (Conserva et al., 2012; Ferreira Junior et al., 2012).
Recently, a review was published showing the
main chemical components of genera Spermacoce
(Conserva et al., 2012). For Spermacoce verticillata
have been found mainly indole alkaloids
(borrerine, verticillatines A e B), borreverine, iso-
borreverine and spermacoceine, and (-)-emetine
(Moreira et al., 2010) have been found. Iridoids such as
asperuloside, asperulosidic acid, borreriagenin,
daphylloside deacetyl asperuloside, deacetyl-
asperulosidic acid (Moreira et al., 2010) and terpenoids
such as cariophyllene, guiaene, campesterol, β-
sitosterol, and stigmasterol (Moreira et al., 2010;
Ferreira Júnior et al., 2012) are present. Other
compounds as phytol, 1,8-cineol, α- pinene, and p-
cymene were also identified (Ogunwande et al., 2010).
Recently, some new terpenes (ursolic, oleanolic
and morolic acid), flavonoids (quercetin and quer-
cetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl), anthraquinone
(3,5-dioxo-friedelane), phytosteroids as 2-hydroxy-
3-methylanthraquinone and sitostenone in Sper-
macoce verticillata were isolated and identified
(Ushie et al., 2010; Ferreira-Júnior et al., 2012), pointing to
the wealth of secondary metabolites in this species
and the need for further studies to elucidate these
substances, which was the aim of this work.
MATERIAL AND METHODS
Chemical and instruments
Thin layer chromatography (TLC) was perfor-
med on silica gel 60 F254 (SilicCycle) eluted with n-
butanol/acetic acid/water (BAW) 8:1:1, visualized
under UV light (254 and 365 nm) and developed
with ceric sulphate solution and aluminium
chloride 2% ethanol solution. All 1D and 2D
experiments were performed on a Brucker 400
MHz spectrometer. The NMR spectra were
recorded in MeOD.
HPLC separation was performed using a
Shimadzu liquid chromatograph Prominence LC-
20AT coupled to a SPD-20A diode array detector
(DAD) (column oven CTO-20A, communications
bus module CBM-20A). The reversed-phase
column used was Betasil Thermo C18 (250 mm x
4.6 mm, 5 µm) with mobile phase consisted of
water containing acetic acid 1% (A) and methanol
(B) and the injection volume for all samples was 20
μL. The samples were run for 18 minutes at a flow
rate of 1 mL/min, with oven set at 30°C and
absorbance monitored between 200 – 450 nm. The
gradient used was 0 – 15 min (35 - 70% B), 15 – 17
min (70 - 80% B) and 17 – 18 min (80 - 35% B). The
compounds were quantiﬁed from a calibration
curve of rutin in triplicates of five concentrations
(0.02 – 0.1 mg/mL). The phenolic compounds were
analysed by matching the retention time and their
spectral characteristics against those of standards.
Standard of quercetin-3-O-rutinoside (rutin) was
purchased from Sigma Chemical. Kaempferol-3-O-
rutinoside isolated was used as standard in
analysis of HPLC after their structural elucidation.
Plant material and extraction
Leaves of Spermacoce verticillata (L.) G. Mey.
were collected at Volta Redonda - Rio de Janeiro,
Brazil, in January 2012. A voucher specimen (RBR
26925) of this plant was identified by Dr. Pedro
Germano Filho of the Institute of Botany, at
Federal Rural University of Rio de Janeiro, where it
was deposited.

Isolation and identification of flavonoids
The leaves (100 g) were triturated using a food
processor and extracted with distilled water (10%
w/v) by decoction (15 min). After the filtration, the
extract (SVL) was frozen at -20°C and lyophilized
(12.1 g). SVL was purified by ethanol precipitation
and partitioned successively with ethyl acetate (3 x
400 mL), affording 199.0 mg of acetate fraction,
and n-butanol (3 x 400 mL), affording 1.7 g of
butanolic fraction, which was purified on an RP-2
column (30 x 1.2 cm; H2O/MeOH), allowing for
eight fractions. The sixth fraction showed a
precipitate yellow crystalline (24.0 mg) that was
separated by centrifugation and identified as
quercetin-3-O-rutinoside known as rutin, by spec-
troscopic analysis comparison with data reported
in the literature (Zuhal et al., 2006). The eight fraction
(83.0 mg) was purified on an RP-2 column (15 x 0.7
cm; H2O/EtOH), giving five fractions. The third
fraction showed a yellow compound (16.0 mg)
identified as kaempferol-3-O-rutinoside by spec-
troscopic analysis comparison with data reported
in the literature (Song et al., 2007).
RESULTS
HPLC analysis
This study led to the identification of
chlorogenic acid, and flavonoids quercetin-3-O-
rutinoside (rutin) and kaempferol-3-O-rutinoside
in leaves of Spermacoce verticillata (SVL),
according to reported HPLC-DAD data (Figs. 1-2)
and NMR data (Zuhal et al., 2006; Song et al., 2007).
During the analysis of HPLC another com-
pound (retention time at 7.934 min) was identified
as a flavonoid derived, which has absorption in 254
and 365 nm. However, this compound wasn´t
isolated at this moment.
The HPLC conditions, described in the experi-
mental section, allowed good separation for the
phenolic acid and flavonoids (Fig. 1). The amount
of chlorogenic acid, quercetin-3-O-rutinoside
(rutin) and kaempferol-3-O-rutinoside, in leaves of
Spermacoce verticillata, were 0.022, 0.248 and
0.003%, respectively (Table 1).
Table 1. Data obtained from HPLC analysis of flavonoids
(quercetin-3-O-rutinoside and kaempferol-3-O-rhamnoside)
and phenolic acid standards and of aqueous extracts (SVL).
Compounds Retention
time (min)
UV λmax
(nm)
Total area SVL
(%)
Standard
chlorogenic acid
4.190 263; 353 100
Rutin 9.235 255; 353 100
Kaempferol-3-O-
rutinoside
11.066 265; 353 100
Compound 1 4.190 263; 327 0.022
Compound 2 9.236 255; 353 0.248
Compound 3 11.069 265; 347 0.030
Figure 1. HPLC analysis of major compounds of aqueous
extract of Spermacoce verticillata (SVL). Chlorogenic acid (Rt
= 4.190 min), rutin (Rt = 9.236 min) and kaempferol-3-O-
rutinoside (Rt = 11.069 min) were identified. The monitoring
wavelength was 340 nm.
NMR data of quercetin-3-O-rutinoside (rutin) (2)
Yellow amorphous powder, 1
H NMR (MeOD,
400 MHz): δH 6.20 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6), 6.39
(1H, d, J = 2.2 Hz, H-8), 7.66 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-
2’), 6.86 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’), 7.60 (1H, dd, J=
8.0/1.8 Hz, H-6’), 5.09 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1’’),
3.25-3.47 (4H, m, H-2’’, H-3’’, H-4’’, H-5’’), 3.38 (1H,
m, Ha-6’’), 3.80 (1H, d, J = 10.5 Hz, Hb-6’’), 4.51 (1H,
d, J = 1.8 Hz, H-1’’’), 3.63 (1H, dd, J = 3.5/1.5 Hz, H-
2’’’), 3.53 (1H, dd, J = 9.5/3.5 Hz, H-3’’’), 3.28 (1H, m,
H-4’’’), 3.44 (1H, m, H-5’’’), 1.11 (3H, d, J= 6.0 Hz,
CH3-6’’’); 13
C NMR (MeOD, 100 MHz): δC 158.0 (C-
2), 135.0 (C-3), 178.0 (C-4), 161.6 (C-5), 98.6 (C-6),

Figure 2. Structures of compounds 1-3 present in Spermacoce verticillata.
164.6 (C-7), 93.5 (C-8), 158.0 (C-9), 104.3 (C-10),
121.7 (C-1’), 116.3 (C-2’), 144.5 (C-3’), 148.5 (C-4’),
114.7 (C-5’), 122.2 (C-6’), 103.3 (C-1’’), 74.3 (C-2’’),
76.7 (C-3’’), 70.8 (C-4’’), 76.8 (C-5’’), 67.2 (C-6’’),
101.1 (C-1’’’), 70.9 (C-2’’’), 72.6 (C-3’’’), 73.9 (C-4’’’),
68.3 (C-5’’’), 16.5 (C-6’’’).
NMR data of kaempferol-3-O-rutinoside (3)
Yellow amorphous powder, 1
H NMR δ (400
MHz, MeOD) 7.98 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2’, 6’),
6.88 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-3’ 5’), 6.40 (1H, br.s, H-
8), 6.20 (1H, br.s, H-6), 5.30 (1H, d, J = 6.9 Hz, H-
‘’), 4.39 (1H, br.s, H-‘’’), 3.0-4.0 (16H, rut), 1.10 (3H,
d, J = 6.4 Hz, -CH3). 13
C NMR δ (100 MHz, MeOD)
157.0 (C-2), 134.1 (C-3), 177.9 (C-4), 161.4 (C-5),
98.6 (C-6), 164.5 (C-7), 93.6 (C-8), 158.1 (C-9),
104.2 (C-10), 121.3 (C-1’), 131.0 (C-2’, C-6’), 114.7 (C-
3’, C-5’), 160.6 (C-4’), 101.1 (C-1’’), 74.3 (C-2’’), 76.7
(C-3’’), 68.3 (C-4’’), 75.7 (C-5’’), 67.1 (C-6’’), 100.9
(C-1’’’), 70.0 (C-2’’’), 70.6 (C-3’’’), 72.5 (C-4’’’), 68.3
(C-5’’’), 16.6 (C-6’’’)
To the best of our knowledge, this is the first
report of the compounds (1-3) in S. verticillata.
Flavonoid quercetin-3-O-rutinoside (2) is the
major compound in SVL followed by kaempferol-
3-O-rutinoside (3) and chlorogenic acid (1),
identified by retention time and UV absorption in
comparison with the respective standards (Table
1). Through study were identified the presence of
one phenolic acid (chlorogenic acid) and flavo-
noids (quercetin-3-O-rutinoside, kaempferol-3-
O-rutinoside). Flavonoids are common in the
family Rubiaceae and the genus Spermacoce.
Currently there are ten molecules of this class
described in four of ten species of Spermacoce (S.
stricta, S. laevis, S. articularis and S. verticillata)
(Noiarsa et al., 2007). This work reports for the first
time the identification of chlorogenic acid, rutin
and kaempferol-3-O-rutinoside for Spermacoce
verticillata. The presence of these three new
compounds indicates chemical markers of the
species for this genus and family. This
information is extremely important because it
increases the resources for chemotaxonomic
classification of these species (Somporn et al., 2012;
Lallemand et al., 2012; Bolzani et al., 2001).
CONCLUSIONS
This is the first report for these compounds (1-
3) in S. verticillata. The presence of these three
new compounds indicates chemical markers of
the species for this genus and family. This infor-
mation is extremely important because increases
the resources for chemotaxonomic classification
of these species.
CONFLICT OF INTEREST
The authors declare no conflict of interest.
ACKNOWLEDGEMENT
This work was financially supported by
PROIC/UFRRJ and FAPERJ.
DISCUSSION

REFERENCES
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13. Figures
Manuscripts in general should be organized in the following order:
1- Covering Letter: In addition to the general details (name, address, contact details including
mobile number of the corresponding author), it should mention in brief what is already known about
this subject and what new is added by the submitted work.
2- Title page: It should be paginated as page 1 of the paper. It should include the title, authors’ names
and affiliations, running title, address for correspondence including e-mail address and also the total
number of pages, figures and tables.
Title: Must be informative, specific, short, clear, concise, and unambiguous reflect the paper’s
contents. It should not exceed 150 characters. It must be write in English and Spanish.

ISSN 0719-4250
Name(s) of author(s): The names of authors and their affiliations should be given. Family name,
First name, and initial(s) of the middle name(s) of each author should be written. It should be made
clear which address relates to which author. The corresponding author should be identified with an
asterisk (*). When there are two or more authors and they belong to more than one affiliation, the
connection between each author and his or her affiliation should be indicated by italicized
superscripts a, b, c… placed after each author’s name and before each affiliation.
Authorship credit should be based only on:
1. Substantial contributions to conception and design, or acquisition of data, or analysis and
interpretation of data;
2. drafting the article or revising it critically for important intellectual content; and
3. final approval of the version to be published.
Conditions 1, 2, and 3 must all be met. Acquisition of funding, the collection of data, or general
supervision of the research group, by themselves, do not justify authorship.
Running title: It is a short title printed in the journal at the right top corner of right hand page of the
article (except the lead page). It should be not more than 50 characters in length.
Address for correspondence: The corresponding author’s address should be given on the title page.
The e-mail ID of the corresponding author or the contact e-mail ID must also be provided.
Affiliations: include the name of department (if any), institution, city and state or country where the
work was done, indicating which authors are associated with which affiliation.
E-mail address of the corresponding author: as all correspondence, including proofs, should be sent
only to him.
Abbreviations: Abbreviations and their explanations should be collected in a list, arranged
alphabetically.
Abbreviations should generally be used sparingly. Non-standard abbreviations must be defined in the
text following their first use. Provide a list of all nonstandard abbreviations after the keywords.
Abbreviations and their explanations should be collected in a list, arranged alphabetically. However,
the following need not be defined: ADP (adenosine 5’-diphosphate), AIDS (acquired
immunodeficiency syndrome), AMP (adenosine 5’-monophosphate or adenylic acid), ATP (adenosine
5’-triphosphate), cAMP (adenosine 3_,5_-cyclic monophosphate), cDNA (complementary DNA), CoA
(coenzyme A), DNA (deoxyribonucleic acid), ED50 (50% effective dose), ESR (electron spin
resonance), FAB-MS (fast atom bombardment mass spectrometry), FAD (flavin adenine
dinucleotide), GC-MS (gas chromatography-mass spectrometry), GLC (gas-liquid chromatography),
GMP (guanosine 5_-monophosphate), HPLC (high-performance liquid chromatography, high-
pressure liquid chromatography), IC50 (inhibitory concentration, 50%), IR (infrared), LC (liquid
chromatography), LC/MS (liquid chromatography/mass spectrometry), LD50 (50% lethal dose),
mRNA (messenger RNA), MS (mass spectrum), NMR (nuclear magnetic resonance), P450 (as in
cytochrome P450), RNA (ribonucleic acid), TLC (thin-layer chromatography), tRNA (transfer RNA),
UV (ultraviolet).
Symbols and Units: International standardized abbreviations should be used, for example: length
(m, cm, mm, µm, nm, Å), mass (kg, g, mg, µg, ng, pg, mol, mmol, µmol), volume (L, mL, µL), time (s,
min, h, d), temperature (°C, K), radiation (Bq, dpm, Gy, Sv), and concentration (M, mM, mol/L,

ISSN 0719-4250
mmol/L, mg/mL, µg/mL, %, % (v/v), % (w/v), ppm, ppb), acceleration due to gravity (g) need not be
defined. Other abbreviations should be defined the first time that they are used in the text (i.e., the
specific term should be followed by its abbreviation in parentheses), and they should be used
consistently thereafter. Preferably, SI units should be used.
3-Abstract and key words
Abstract: The Abstract should be informative and completely self-explanatory, briefly present the
topic, state the scope of the experiments, indicate significant data, and point out major findings and
conclusions. The Abstract should not exceed 250 words in length (150 words for Case Report).
Complete sentences, active verbs, and the third person should be used, and the abstract should be
written in the past tense. For Original Articles, it must be in a structured form (Context, Objectives,
Methods, Results and Conclusions) and explain briefly what was intended, done, observed and
concluded. The conclusions and recommendations not found in the text of the manuscript should not
be given in the abstract. Standard nomenclature should be used and abbreviations should be avoided.
No literature should be cited. It must be write in English and Spanish.
Key Words: At least three and not more than six in alphabetical order will be listed in English and
Spanish, which will help readers or indexing agencies in cross-indexing the study. The words found in
title need not be given as key words. Use terms from the latest Medical Subject Headings (MeSH) list
of Index Medicus. A more general term may be used if a suitable MeSH term is not available.
4- Introduction: Briefly review important prior publications and state the reasons for the
investigation being reported. It should start on a new page. Essentially this section must introduce
the subject and briefly say how the idea for research originated. Give a concise background of the
study. Do not review literature extensively but provide the most recent work that has a direct bearing
on the subject. Justification for research aims and objectives must be clearly mentioned without any
ambiguity. The purpose of the study should be stated at the end.
5- Materials and methods: description of methods, equipment and techniques (including statistical
treatments used in the research).
This section should deal with the materials used and the methodology (how the work was carried
out). The procedure adopted should be described in sufficient details to allow the experiment to be
interpreted and repeated by the readers, if desired. The number of subjects, the number of groups,
the study design, sources of drugs with dosage regimen or instruments used, statistical methods and
ethical aspects must be mentioned under the section. The data collection procedure must be
described. If a procedure is a commonly used, giving a previously published reference would suffice. If
a method is not well known (though previously published) it is better to describe it briefly. Give
explicit descriptions of modifications or new methods so that the readers can judge their accuracy,
reproducibility and reliability.
The nomenclature, the source of material and equipment used, with details of the manufacturer in
parentheses, should be clearly mentioned. Drugs and chemicals should be precisely identified using
their non-proprietary names or generic names.
If necessary, the proprietary or commercial name may be inserted once in parentheses. The first letter
of the drug name should be small for generic name (e.g., dipyridamole, propranolol) but capitalized
for proprietary names (e.g., Persantin, Inderal). New or uncommon drug should be identified by the
chemical name and structural formula.

ISSN 0719-4250
The doses of drugs: should be given as unit weight per kilogram body weight e.g., mg/kg and the
concentrations should be given in terms of molarity e.g., nM or mM. The routes of administration
may be abbreviated, e.g., intra-arterial (i.a.), intracerebroventricular (i.c.v.), intra-gastric gavage (i.g.),
intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intravenous (i.v.), per os (p.o.), subcutaneous (s.c.),
transdermal (t.d.), etcetera.
Documentation of plants and other organisms or starting materials: Use the correct scientific
nomenclature. For plants, the Index Kewensis (electronic Plant Information Centre ePIC, Royal
Botanic Gardens, Kew, UK: http://www.kew.org/epic), and/or the International Code of Botanical
Nomenclature (www.bgbm.fu-berlin.de/iapt/nomenclature/code/tokyo-e/default.htm) should be
followed.
Give the scientific name (in italics), the author of this name and the family, i.e. Mangifera indica
Linneo (Anacardiaceae). Indicate who identified the material. The manuscript must include
references to voucher specimens of the plants (deposited in a major regional herbarium) or the
material examined including their registration number(s). It should be mentioned which plant parts
have been used.
Description of the preparation of extracts and isolation of compounds: Extraction and isolation
should be described in detail. The kind and amount of starting material, solvents and extraction
methods must be indicated. The description of chromatographic systems should contain the
quantitative information that allows the reader to repeat the work. Column dimensions, elution
volumes, fraction sizes, etc. should be reported.
Analytical studies: Key data on method validation must be provided and should typically include
information on specificity, linearity, limit of detection, limit of quantification, accuracy, precision,
intermediate precision, and some robustness studies. Information on the purity of reference
compounds and on the methods used for the determination of purity must be given. Recoveries of
extraction and sample pre-purification steps have to be indicated. Adequate statistical treatment of
data is required. For more information regarding validation issues, prospective authors should also
refer to ICH guidelines.
Pharmacological investigations: JPPRes will consider manuscripts in which conclusions are based on
adequate statistics that incorporate the appropriate tests of significance, account for the type of data
distribution and are based on the number of experimental observations required for the application
of the respective statistical method. In each case positive controls (reference compounds) should be
used and the dose/activity dependence should be shown. Manuscripts describing animal experiments
should be conducted in accordance with the experimental animal guidelines of the institution as well
as the appropriate government guidelines. Only manuscripts of experiments conducted in accordance
with the appropriate guidelines will be eligible for publication. When working with experimental
animals, reference must be made to principles of laboratory animal care or similar regulations and to
approval by the local ethical committee. The approval number and the corresponding date must be
provided. It must clearly indicate that appropriate measures were taken to minimize pain or
discomfort, and details of animal care should be provided.
Biological screening: Biological activities should be reported by listing IC50 values, or a dose-response
relationship should be shown by using at least two test concentrations. Positive controls (reference
compounds) should be included.
Clinical studies: Clinical studies must be designed, implemented and analyzed in a manner to meet
current standards of randomised controlled trials. For guidelines see the following reviews: Begg et al.

ISSN 0719-4250
(1996) JAMA 276: 637-639 and Moher et al. (2001) BMC Medical Research Methodology 1:2. Reference
must be made to approval of the study by the local ethical committee. The approval number and the
corresponding date must be provided. All methods and variables used in a trial should be described;
the data must be based on adequate statistics. For manuscripts dealing with scientific investigations
involving human subjects and/or human tissues, the experiments should be performed in accordance
with the ethical principles for medical research outlined in the Declaration of Helsinki 1964 as
modified by subsequent revisions (http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/).
If approval was obtained from an Ethics Committee the authors should indicate this, as well as any
approval/reference number. Written informed consent must be obtained from study participants and
the existence of this consent must be stated in the article.
Patients have a right to privacy: Any information that might result in identification of individuals
must be omitted, especially if it is not directly clinically relevant. Patient age, sex, admission dates
and co-morbidities should be removed as far as possible. If it is possible that a patient could be
identified, the authors must obtain written informed consent from the individual(s) concerned and
state that this has been obtained in the article. Publication consent forms should be retained by the
authors and not supplied to the Journal. If the patient is deceased the next of kin should be contacted.
If consent cannot be obtained the authors must explain the circumstances briefly in the article, as
well as in detail in the covering letter. In rare circumstances where relevant clinical details mean that
the patient can be identified, the patient/next of kin must be shown the manuscript before
submission and made aware as part of the informed consent process that the article may appear on
the internet.
Statistical Analysis: The variation of data should be expressed in terms of the standard error of mean
(S.E.M) or the standard deviation (S.D.), along with the number of observations (n). The details of
statistical tests used and the level of significance should be stated. If more than one test is used it is
important to indicate which groups and parameters have been subjected to which test.
6- Results: The results should be stated concisely without comments. Efforts should be made to
avoid jargon, to spell out all non-standard abbreviations the first time they are mentioned and to
present the contents of the study as clearly and concisely as possible.
Results should be presented in logical sequence in the text with appropriate reference to tables
and/or figures. The data given in tables or figures should not be repeated in the text. The same data
should not be presented in both tabular and graphic forms. Simple data may be given in the text itself
instead of figures or tables. Avoid discussions and conclusions in the results section.
7- Discussion (may be combined with the Results section). This section should deal with the
interpretation, rather than recapitulation of results. It is important to discuss the new and significant
observations in the light of previous work.
Discuss also the weaknesses or pitfalls in the study. New hypotheses or recommendations can be put
forth. Avoid unqualified statements and conclusions not completely supported by the data.
Repetition of information given under Introduction and Results should be avoided.
Conclusions: It must not reiterate any discussion or introductory comments, they must be genuine
conclusions drawn from the results of the study.
Conclusions must be drawn considering the strengths and weaknesses of the study. Make sure
conclusions drawn should tally with the objectives stated under Introduction.

Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research volume 2, issue 1, 2014

Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research volume 2, issue 1, 2014

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