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iimura b
- 2. 背景 ・DNA分子の形態変化を利用し、並行並列・自己組織化等の情報処理の実現を目指している ・化学実験の失敗による時間・コスト削減や、化学反応モデル設計の際の仮定の 正しさ検証するためにハイブリダイゼーションのシミュレーションがつくられている。 ・DNAを構成する４つの塩基のうちGとC、AとTが結合する反応 ・DNA computingにおいて重要な反応 G C C AT G GC A T G CC AT G GC A T DNA computing ハイブリダイゼーション反応 複数種のDNA の競合状態 個々の一本鎖DNAが 二次構造をとっている シミュレーション このような状況を反映した シミュレータがない DNA computingにおける 化学実験の反応溶液中
- 4. •二次構造の安定性の尺度 → 塩基配列の並びに依存する自由エネルギー（ΔG） T A C C AC G C A G A T G C G T G G T G GG G G G G A A A C C C T TT T 低 ΔG 高 安定 構造 不安定 一本鎖DNAの二次構造安定性[Tinco,1971] ΔGが最も小さいものが、最も安定した二次構造（形態）と予測される。 二次構造予測シミュレータ Mfold [Zuker,1996] • 一本鎖DNAのΔGとDNA間のハイブリダイゼーションにどのような関係があるか。 • 一本鎖DNAの二次構造がDNA間のハイブリダイゼーションにどのように影響するか。 を検証する。 一本鎖DNAの二次構造と安定性 本研究では
- 5. 検証手段 • 一本鎖DNA同士がハイブリダイズし、二本鎖DNAを形成する。 • ハイブリダイゼーションによる結合は融解するので、ハイブリダイズした様子や痕 跡が残っていることが望ましい G C C AT G GC A T G CC AT G GC A T 16mer16mer 状態分子 遷移分子 酵素伸長ハイブリダイズ 94℃ 10sec 66℃ 60sec 冷却 16mer16mer 加熱 48mer 修飾し伸長しない 相補 ST PCR [Hashimoto et al,2003] 付可逆反応 検証手段に必要な要素 •一本鎖DNA同士がハイブリダイズし、二本鎖DNAを形成するアプリケーション •不可逆な酵素伸長を利用して、ハイブリダイゼーションを配列の長さの違いと して観測できる
- 6. 実験方法 反応率 ＝ 初期の32merの状態分子のうち、反応によって 48merに伸長された分子の割合 48mer 32mer 温度サイクル 0 1 2 レーン 反応率 •ΔGが異なる配列６本 •３’末端のダングリングエンドの長さが異なる配列６本 使用する配列 G G C C A A T T G C C A A T T C T G C A ダングリングエンド 3’5’ •変性ゲル（長さによってDNAを •分離できる）による電気泳動 (200V,60min) •SYBR GOLDで染色 （25min) •ゲル写真の画像解析に よって反応率を求める 状態分子 遷移分子 各々の状態分子に対して ST PCR（２サイクル） 二次構造やその安定性 が配列によって異なる 二次構造が異なる
- 7. （実験１）一本鎖DNAの構造安定性とハイブリダイゼーションの関係についての実験 ST PCRを２サイクルまで試行。全4回の実験の平均。 仮定：ΔGが低いものほど構造が安定し、他のDNAとのハイブリダイゼーションが進行 しにくくなるのでは？ ST PCRサイクルと反応率の変化 0サイクルと1サイクルの反応率の差とΔGの関係 反 応 率 反 応 率 の 差 PCR cycle 1.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 1 2 1.2 ｄG 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 相関係数 0.635 ΔGが低いものほど、ハイブリダイゼーションが起こりにくい傾向がみられる
- 8. （実験２－１）二次構造とハイブリダイゼーションの関係 • ST PCRサイクルを２サイクル行う。 • 全３回の実験の平均。 PCR cycle 反 応 率 ダングリングエンドの長さと反応率の変化 ３‘末端側のダングリングエンドの長さの違いに注目し、二次構造と 他分子とのハイブリダイゼーションとの関係を調べる G G C C A A T T G C C A A T T C T G C A ヘアピン ダングリングエンド 3’5’ 0 1 2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 8mer 2mer 12mer 1mer 6mer 6mer 二次構造によって反応率に違いが見られたが、 ダングリングエンドの長さと分子間のハイブリ ダイゼーションの相関は弱い。 状態分子のみによるST PCR 相関係数 -0.569
- 9. （実験２－２）二次構造と自己伸長の関係 GCCCAAGTGCA TTTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA TTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA CGGGTTCACGT GCC TTT A T C ミスマッチを削除 自分自身を鋳型に伸長 酵素による自己伸長 全てのダングリングエンドが削除され、自己伸長が起こったと仮定し、 そのときに生成される配列の長さを求め、電気泳動結果と比較する。 検証方法 配列 A B C D E F G H I J K L 最も安定な構造 1 1 1 2 6 6 6 6 7 8 11 12 2番目に安定な構造 10 8 21 9 1 1 10 1 ３番目に安定な構造 10 10 10 6 1 Mfoldによるダングリングエンドの予測
- 10. GCCCAAGTGCA TTTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA TTCACGT GCC TTT A T C GCCCAAGTGCA CGGGTTCACGT GCC TTT A T C ミスマッチを削除 自分自身を鋳型に伸長 酵素による自己伸長 全てのダングリングエンドが削除され、自己伸長が起こったと仮定し、 そのときに生成される配列の長さを求め、電気泳動結果と比較する。 Mfoldによるダングリングエンドの予測 配列 A B C D E F G H I J K L 最も安定な構造 1 1 1 2 6 6 6 6 7 8 11 12 2番目に安定な構造 10 8 21 9 1 1 10 1 ３番目に安定な構造 10 10 10 6 1 ダングリングエンドの塩基数が少ないものほど、自己伸長が起こりやすい 競合状態における分子間のハイブリダイゼーションに間接的に 影響を与える可能性がある。 検証方法 （実験２－２）二次構造と自己伸長の関係
- 11. • まとめ – 一本鎖DNAの構造が安定してるほどハイブリダイゼーションが起こりに くい傾向がみられた。 – 一本鎖DNAの二次構造の違いがハイブリダイゼーションに与える相関 は弱かった。 – ダングリングエンドの少ないものほど、自己伸長が起こりやすく、分子 内ハイブリダイゼーションが間接的に分子間ハイブリダイゼーションに 影響を及ぼしている可能性がある。 – 分子間のハイブリダイゼーションを考える際には分子内ハイブリダイ ゼーションによる影響を考慮しなければならない。 • 今後に向けて • 今回用いた配列と異なる配列集合を利用し、本研究の検証。 • 配列の長さとハイブリダイゼーションにどのような関係があるのか 検証。 • モデル構築。 • シミュレーターの構築