Virüs nedir? Nerelerde bulunur? Gıdalarda en yaygın bulunan virüsler nelerdir? Virüslerden korunma yöntemleri nelerdir? Virüslerin tespit yöntemleri nelerdir?

1. İçindekiler
Giriş
Gıda kaynaklı virüsler
Virüslerin kontrolü
Gıda kaynaklı virüslerin tespiti
Kulllanılan yöntemler
Sonuç
1

2. Giriş
Zorunlu hücre içi
parazit
Hızlı çoğalma
Konak hücre
metabolik
mekanizma
DNA/RNA
Bakteriyofaj,
mikofaj, virofaj
200-300 nm Antibiyotik/Aşı 1031 virüs
%1 insanlar için
patojenik
4000'den fazla
virüs
DNA virüsü
305.000 nükleotit
Su ekosistemi
Gıdalarda/suda
çoğalmaz
Bozulma/duyusal
değişiklik
[1-3]

3. Nükleik asit
ss-DNA ds-DNA ss-RNA ds-RNA
[4,5]

4. [5]

5. Tutunma
Giriş
Replikasyon
Birleştirme
Çıkış
[6]

6. [6]

7. [7]

8. Gıda virüsleri
– Son yıllarda, dünya çapında gıda kaynaklı hastalıkların insidansında bir artış
olmuştur ve virüsler artık bu hastalıkların ana nedeni olarak kabul edilmektedir.
Gıda kaynaklı hastalıklarda rol oynayan en yaygın virüsler, insan gastrointestinal
sisteminde bulunan, insan dışkısıyla atılan ve fekal-oral yolla bulaşan enterik
virüslerdir.
– Beş enterik virüs [İnsan Norovirüsü (HuNoVs), Hepatit A virüsü (HAV), İnsan
Rotavirüsleri (HRV'ler), İnsan Astrovirüsleri (HAstV'ler) ve İnsan sapovirüsü]
ABD'de başlıca gıda kaynaklı patojenler olarak tanımlanan 31 patojen arasında
yer almaktadır [2].
Bozulma/duyusal
değişiklik
Gıdada/suda çoğalma

9. Gıda virüsleri
Pratikte rapor
edilen viral gıda
kaynaklı
hastalıkların çoğu
sırasıyla insan
NoV ve HAV'nin
neden olduğu
gastroenterit ve
hepatittir.
Bununla birlikte,
enterovirüsler,
sapovirüsler,
rotavirüsler,
astrovirüsler,
adenovirüsler ve
Hepatit E virüsü
(HEV) gibi diğer
viral ajanlar, gıda
ve/veya su
kaynaklı hastalık
bulaşmasında rol
oynamaktadır.
En ciddi
vakalardan
genellikle
bakteriyel
gastroenterit
ajanları
sorumluyken,
NoV gibi virüsler
en fazla vakadan
sorumludur
Norovirüs (NoV)
dünya çapında
akut
gastroenteritin
önde gelen
ajanıdır. Gelişmiş
ülkelerde her 5
kişiden 1’ini
enfekte
etmektedir
NoV'nin dünya
çapında
onaylanmış tüm
gıda kaynaklı
salgınların
%50'sinden
fazlasına neden
olduğu tahmin
edilmektedir
Gıda kaynaklı
hastalıklar da
yüksek bir
ekonomik yük
taşımaktadır ve
ABD ekonomisine
yılda 55,5 ila 93,2
milyar ABD Doları
arasında mal
olacağı tahmin
edilmektedir
[3, 8]

10. Nasıl yayılırlar?
Kontamine gıda
Fekal-oral
Temas
Kirli çamur ve /
veya sulama
suyu
İnsan/hayvan
pisliği
Enfekte gıda
işleyicileri
Tuvaletlerin
sulama suyu
kaynaklarına
yakınlığı
Canlı hayvan ile
temas veya et
ürünleri (HEV;
et, yumurta,süt)
Tarım
kimyasallarını
ve gübreleri
seyreltmek
Kabuklu
yumuşakçaların
üreme alanları
(lağım suyu)
> 60 gün
boyunca canlı
Enfekte kişi dışkı
veya kusmuğu
Asemptomatik
taşıyıcılar
[3, 9]

11. Nörovirüs (NoV)
Çoğu ülkede
en yaygın
patojen
Gıda kaynaklı
rahatsızlıkların
%50’si
(İntestinal)
Her 15
Amerikalı’dan
biri
15 eyalette
56000-71000
vaka
570-800 ölüm
Yeşil yapraklı
sebzeler, taze
meyve,
kabuklular
1. İnsandan
insana
2. Gıda
(uluslararası)
Restoranlar
ve büyük
yemekli
etkinlikler
Sulama suyu
(sebze/meyve)
yetiştirme
suyu (istiridye)
Yolcu gemileri
(diyarel
hastalıklar
%90)
Aside dayanıklı
(meyve)
Gıda kaynaklı hastalıklarda 1. Gıda kaynaklı ölümlerde 4. Gıda kaynaklı DALY 5.
[10,11]

12. Nörovirüs vakaları
– Danimarka'da, 260 vakalı on bir salgının tümü, 2010 yılında Fransa'dan ithal
edilen marulla bağlantılıydı [12].
– Almanya'da özellikle büyük bir yemek şirketi aracılığıyla dağıtılan donmuş Çin
çilekleri ile ilişkili bir NoV salgını, başta okul/anaokulu çocukları olmak üzere
10.950 kişinin enfekte olduğu ve 38'inin hastaneye kaldırıldığı bir salgındı [13].
– 2012 yılında Avrupa'da, rapor edilen gıda kaynaklı salgınların %14'ü, ağırlıklı
olarak NoV olmak üzere virüslere atfedilmiştir; karışık yiyecekler ve açık büfe
yemekler ana bulaşma yolları olarak tespit edilmiştir [14].

14. [15]

15. Hepatit A virüsü (HAV)
– Küresel olarak, yılda tahmini 1,4 milyon HAV vakası ve 200 milyon asemptomatik taşıyıcı vardır.
– HAV kişiden kişiye veya kontamine su ve yiyecekler, özellikle meyve veya virüsü etkisiz hale
getirmek için yeterince ısıtılmamış yemeye hazır yiyecekler yoluyla bulaşabilir.
– Kuluçka süresi iki ila yedi haftadır (ortalama dört hafta)
– Klor, peroksiasetik asit ve hidrojen peroksit gibi dezenfektanların eklenmesi, taze ürünlerde
virüslerin yalnızca marjinal bir azalmasını sağlasa da, yıkama suyu ile taze ürün arasındaki
çapraz bulaşma olasılığını azaltmak için faydalıdır.
[2]

16. Hepatit A virüsü (HAV)
– ABD'deki en yaygın HAV salgını, 2003'ün sonlarında Pennsylvania'nın Monaca
kentinde bir restoranda salsada servis edilen yeşil soğanlardan kaynaklanmıştır.
Dört ölümle sonuçlanmış, en az 640 kişiyi etkilemiştir [16].
– 2010 yılında, Fransa'da 59 hastalık vakasının çoğu, üç farklı sandviç dükkanı
zincirinden birinden yarı kurutulmuş domates tüketen vakalarla bağlantılıydı
Türkiye'den ithal dondurulmuş yarı kurutulmuş domates kaynaklı olduğu tespit
edilmiştir [17].

18. Hepatitis E Virusu (HEV)
– Dünya Sağlık Örgütü, Doğu ve Güney Asya'da en yüksek prevalansa sahip,
çoğunlukla kontamine su ile ilişkili 56.600 ölümle birlikte yılda 20 milyondan
fazla HEV enfeksiyonu bildirmektedir.
– Hepatit E özellikle hamile bayanlarda ve immun yetmezliği olan insanlarda %20
ye varan ölümlere neden olmaktadır.
– Genellikle çiğ veya az pişmiş et tüketiminden kaynaklanan gıda kaynaklı HEV
salgınları bildirilmiştir.
[18]

19. Hepatitis E Virusu (HEV)
– Semptomların başlamasından 6-7 hafta önce az pişmiş geyik eti tüketimi ile ilişkili
Japonya'da bir HEV salgını rapor edilmiştir. Kalan etteki HEV nükleotid dizileri, ayrı
bir çalışmada hastalardan ve ayrıca yaban domuzu etinden alınanlarla eşleşmiştir. Eti
yemeyen veya çok az yiyen aile üyeleri enfekte olmamıştır [19].
– Fransa'nın Korsika kentinde, domuz karaciğeri ile yapılan ve yaygın olarak çiğ yenen
geleneksel bir sosis olan çiğ figatellu yiyen 13 kişiden yedisinde akut veya yeni HEV
enfeksiyonu tespit edilmiştir. Güneydoğu Fransa'daki süpermarketlerden satın alınan
yedi sosisten genotip 3 HEV dizileri elde edilmiş ve çiğ figatellu yiyen hastalarla
genetik olarak ilişkilendirilmiştir [20].

21. Rotavirus (HRV)
– HRV, dünya çapında, özellikle Rotavirüs A grubu çocuklarda, ishal ve
dehidrasyonun önde gelen nedenleri arasındadır.
– Yetişkin ishal rotavirüsü olarak da bilinen Grup B rota virüsü, Çin Halk
Cumhuriyeti'nde her yaştan binlerce kişiyi etkileyen ciddi ishal salgınlarına
neden olmuştur. Grup C rotavirüs, birçok ülkede çocuklarda diyare vakaları ile
ilişkilendirilmiştir.
[21]

22. Rotavirus (HRV)
– HRV, çocukların asemptomatik olabileceği çocuk bakım merkezlerinde hızla
yayılabilir. Rotavirüsler, bir dakikadan daha kısa yarı ömürleri ile 37°C'de pH 2'de
hızla inaktive edilir. Bu yüzden 3 yaş altı çocuklarda daha sık görülür.
– ABD'de yılda 3 milyon HRV hastalığı vakası olup, tahminen 15.433 vaka gıda kaynaklı
olarak tanımlanmıştır [22].
– Washington DC üniversite kampüsünde, kampüs yemekhanesinden ton balıklı veya
tavuklu salatalı sandviç yemekle ilişkili 108 vaka ile bir HRV salgını meydana geldi.
Araştırma, salgın döneminde 40/44 vaka hastasının ve 27/40 kontrolün
yemekhaneden en az bir şarküteri sandviçi tükettiğini bildirdi [23].

24. Astrovirus (HAstV)
– NoV'ye benzer şekilde, kirli sularda yetişen çift kabuklu yumuşakçalar veya
marul, yeşil soğan, ahududu ve kirli suyla sulanan çilekler gibi taze ürünlerde
görüldüğü üzere, hasat öncesi aşamada gıdalar HAstV ile kontamine olabilir.
– Servis ve doğrama kapları veya diğer gıda ile temas eden yüzeyler HAstV
enfeksiyonlarının yayılmasında önemli bir rol oynar, çünkü bu virüsler
yüzeylerde çok sayıda kalabilmektedir. HAstV, içme suyu, tatlı yüzey suyu ve
deniz suyunda stabildir ve bu da başka bir bulaşma yolunu gösterir.
[21]

25. Sapovirus (SaV)
– SaV, küresel olarak insanlarda, özellikle bebeklerde ve küçük çocuklarda
akut gastroenterite neden olan önemli bir patojendir; SaV salgınları son
zamanlarda, özellikle Japonya'da daha sık hale gelmiştir.
– Norovirüs gibi, Sapovirüs de yıl boyunca gastroenterite neden olur.
Epidemiyolojik çalışmalar, virüsü taşıyan gıda hazırlayan işçileri ve
istiridye gibi çift kabukluların yenmesini, virüsün bulaşma yolunun bir
parçası olarak güçlü bir şekilde tanımlamıştır.
[10]

26. Aichi viruses (AiV)
– Aichi virüsleri (AiV), kontamine yiyecek veya su yoluyla fekal-oral yollarla
potansiyel olarak bulaşan insan gastroenteritine neden olan ajanlar olarak
önerilmiştir.
– Birkaç AiV çalışması, yetişkinlerde yüksek bir AiV antikor prevalansı (%80-99)
göstermiştir, bu da AiV'ye yaygın maruziyeti, ancak sporadik veya epidemik
gastroenteriti olan hastalarda AiV enfeksiyonu insidansının düşük olduğunu
gösterir. AiV sıklıkla atık su ve nehir suyunda bulunur.
[10]

27. Middle East respiratory
syndrome coronavirus
– Ortadoğu ve Afrika'daki tek hörgüçlü develerin artık MERS-CoV'nin yarasalardan
insanlara bulaşması için ara konaklar olduğu düşünülmektedir çünkü MERS-
CoV'ye özgü antikorlar ve RNA fragmanları Suudi Arabistan, Mısır, Tunus, Nijerya
ve Kenya'dan gelen develerde yaygın olarak bulunmaktadır.
– 17 Ekim 2013 tarihinde 14 deveden örnekler alındı. Üç bağımsız RT-PCR ve
dizileme ile üç deveden alınan burun sürüntülerinde MERS-CoV tespit edildi.
[24]

28. Middle East respiratory
syndrome coronavirus
– Şiddetli akut solunum sendromu (SARS), bir solunum yolu hastalığı olduğu kadar
enterik bir hastalıktır. SARS-CoV, insan popülasyonuna, enfeksiyonu bir yarasa
rezervuarından bulaşan, özellikle misk kedileri olmak üzere hayvansal kaynaklı
yiyeceklerin hazırlanması ve tüketilmesi yoluyla girmiştir.
– Malezya, Endonezya ve Çin Halk Cumhuriyeti'ndeki bazıları yarasa eti yemeyi
astım, böbrek rahatsızlıkları ve genel halsizlik için bir tedavi olarak görüyor ve
hatta geleneksel Çin tıbbında yarasa dışkısı kullanılıyor. Bu nedenle,
koronavirüsler potansiyel gıda kaynaklı hastalık ajanlarından kabul edilebilir.
[25]

29. Diğer virüsler
– Adenovirüsler genellikle kapalı topluluklarda şiddetli gastroenterit ile ilişkilidir,
ancak gıda kaynaklı bir kaynağa bağlantılar nadirdir. 2007'de Kansas'ta 64 vaka
bir restoranda yenilen sosisten kaynaklandığı düşünülmüştür; HAdV ve NoV
izole edilmiş olmasına rağmen, hiçbir gıda aracı doğrulanmamıştır [26]
– Bulaşıcı H5N1 kuş gribi virüsü, ördek etinden kültürlenmiştir ve ördek kanı
tüketimi ve kümes hayvanları ile doğrudan temas, insanlarda enfeksiyona neden
olmuştur. H5N1 ile bağırsak enfeksiyonu olanlar, ishalin hastalığın ilk belirtisi
olduğunu belirtmişler ve kümes hayvanlarına olası tek maruziyetlerinin çiğ
ördek kanı tüketimi olduğunu bildirmişlerdir [27].

30. Diğer virüsler
– Nipah virus (NiV), meyve yarasalarının tükürüğü ile kontamine olmuş meyvelerin tüketilmesi
yoluyla bulaşabilir. NiV enfeksiyonu ilk olarak 1998-1999 yıllarında Malezya ve Singapur
yarımadasında bildirilen 276 vakalık büyük bir salgında tanınmıştır. Çoğu hastanın hasta
domuzlarla teması tespit edilmiştir. Hastalar öncelikle ensefalit (beyin iltihabı) ile
başvurmuştur ve %39'u hayatını kaybetmiştir [28].
– Malezya'da yoğun bir şekilde yönetilen ticari domuz çiftliklerinin ve çiftlikte meyve ağaçlarının
büyümesi, yarasaların NiV yüklü yarasa tükürüğü ile kirlenmiş kısmen yenen meyveleri domuz
ahırlarına bırakabileceği bir ortam oluşturmuştur. Domuzlar meyveleri yiyebilir, NiV ile enfekte
olabilir ve çiftliklerdeki yoğun domuz popülasyonu ve virüsün enfekte domuzlar arasında sık sık
solunum yoluyla saçılması nedeniyle virüsü diğer domuzlara hızlı bir şekilde iletilebilmiştir [29].

31. Virüslerin kontrolü
Ortak çevresel
yüzeylerin temizliği
ve dezenfeksiyonu
Düzgün el yıkama
Semptomlarla
çalışmanın
bırakılması
Mutfakta
denetimler
Yemek/tuvalet
işaretler
Geri izleme/geri
çağırma
viral aşılar, antiviral
ilaçlar ve
dezenfektanlar
Etkili bir hücre
kültürü sistemi
sağlam bir hayvan
modeli ve hızlı ve
hassas viral tespit
yöntemleri
NoV genotiplerinin
dizi analizi
[3]

32. Gıda Kaynaklı Virüslerin Tespiti
– Hepatit A virüsü (HAV) ve norovirüs, gıda kaynaklı insan viral hastalığının önemli
ajanlarıdır.
– Norovirüs kültürü için rutin yöntemler mevcut değildir ve HAV kültür yöntemleri
gıda matrislerine rutin uygulama için uygun değildir. Bu nedenle saptama, ters
transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanan moleküler
yöntemlere bağlıdır.
[3]

33. Gıda Kaynaklı Virüslerin Tespiti
– Virüslerin gıdalardan saptanmasında hücre kültürü, ELISA, immunoelektron
mikroskobi ve PCR gibi kültürel, serolojik veya moleküler yöntemler virüsün
özelliği dikkate alınarak kullanılır [30].
– Birçok gıda matrisi, RT-PCR'yi inhibe eden maddeler içerdiğinden, amaca uygun,
oldukça temiz RNA preparatları üreten bir ekstraksiyon yönteminin kullanılması
gereklidir.

34. Virüs ekstraksiyonu
Gıda
virüsleri
Virüs
ekstraksiyonu
Elüsyon-
konsantrasyon
Doğrudan RNA
ekstraksiyonu
Proteinaz-K ile
muamele
RNA partikülü
saflaştırılması
Trizol
Kit
Moleküler
saptama

35. Virüs ekstraksiyonu
– Gıdalarda virüslerin ekstraksiyonunda kompozisyona bağlı değişik metotlar ön
plana çıkmaktadır. Baert ve ark. gıdaları 3 ana kategoriye ayırarak bu
kategorilerde farklı ekstraksiyon metotlarının daha etkin olduğunu belirtmiştir
[38].
– Bu üç kategori; karbonhidrat ve su açısından zengin gıdalar (sebze ve meyveler
vs.), yağ ve proteince zengin gıdalar (sandviç, salam-sosis, peynir vs.) ve kabuklu
deniz canlılarıdır. Bu sınıflardaki gıdaların ekstraksiyonunda farklı ekstraksiyon
metotlarının etkinliği tespit edilmiştir.

36. Virüs ekstraksiyonu; Elüsyon -
konsantrasyon
– 3 prosedür;
– PEG-NaCl presipitasyonu,
– ultrasantrifüjleme ve
– ultrafiltrasyondur.
– İlk iki uygulamada elüsyon aşamasında fosfat tampon çözeltisi (PBS, pH 7.2) ve
Vertrel XF kullanılırken, ultrasantrifüjlemede pH>9.5 glisin tampon kullanılmıştır.

37. Virüs ekstraksiyonu; Elüsyon -
konsantrasyon
PEG-NaCl prepitasyonu
5 g gıda örneği alınarak 4 mL PBS bulunan 50 mL’lik santrifüj tüpüne alınacak, 5 dk vortekslenecek.
Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant 50 mL’lik temiz bir tüpe alınacak ve PBS ile tekrar yıkanacaktır.
Supernatant üzerine 5 mL VertrelXF (1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-decafluorpentane) eklenecektir. 5 dk vorteksleme işlemi
yapılacaktır.
Supernatant 50 mL’lik temiz bir tüpe alındıktan sonra %10 PEG-0.3 M NaCl ile hacmi 50 mL’ye tamamlanacak.
Bu karışım 4 °C’de 2 saat karıştırılarak inkübe edilecek ve 9500 × g’ de, 4 °C’de 30 dk santrifüj işlemi
gerçekleştirilecektir.
Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, pellet RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak yapılacak RNA ekstraksiyonu için 100
µL’lik PBS’de çözdürülecek veya TRIzol kullanılarak yapılacak RNA ekstraksiyonu için 1 mL TRIzol içine ilave edilecektir.
[31]

38. Virüs ekstraksiyonu; Elüsyon -
konsantrasyon
Ultrafiltrasyon
5 g gıda örneği alınarak 4 mL PBS bulunan 50 mL’lik santrifüj tüpüne alınacak, 5 dk vortekslenecek.
Santrifüj yapıldıktan sonra supernatant 50 mL’lik temiz bir tüpe alınacak PBS ile tekrar yıkanacaktır.
Supernatant üzerine 5 mL VertrelXF eklendikten sonra 30 dk oda koşullarında karıştırılarak inkübe
edilecektir.
Örnek daha sonra 13.000 × g, 4 °C’de 20 dk boyunca santrifüj edilecek ve supernatant ultrasantrifüj
tüpüne alınarak 120.000 × g’ de 2 saat boyunca santrifüjlenecektir.
Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, pellet RNeasy Mini Kit (Qiagen) kullanılarak yapılacak RNA
ekstraksiyonu için 100 µL’lik PBS’de çözdürülecek veya TRIzol kullanılarak yapılacak RNA ekstraksiyonu için
1 mL TRIzol içine ilave edilecektir.
[31]

39. Virüs ekstraksiyonu; Elüsyon -
konsantrasyon
Elüsyon-konsantrasyon
Virüsler Centricon Plus-20 filtreler (100.000 nominal molecular weight limit; Biomax-100, Amicon, Millipore,
Etten-Leur, The Netherlands) kulllanılarak da konsantre edilecektir.
Bu amaçla, 5 g gıda örneği 50 mL tüp içindeki 10 mL glisin tampon (glisin-NaCl, pH 9.5) üzerine ilave
edilecek ve 15 dk oda koşullarında çalkalanacaktır.
Karışım 10.000 × g’de 10 dk boyunca santrifüjlenecektir
Karışım mikrokonsantratöre aktarılacak (Centricon Plus-20, Amicon) ve maksimum santrifüj hızında
(4,000 g), 4 °C’de örneğin viskozitesine bağlı olarak 10-40 dk arası santrifüj edilerek hacmi 100-200
µL’ye kadar düşürülecektir.
Bu konsantre virus viral RNA’nın TRIzol veya RNeasy Mini Kit ile ekstraksiyonuna kadar 4 °C’de muhafaza
edilecektir.
[31]

40. Virüs ekstraksiyonu; Doğrudan
RNA ekstraksiyonu
– Doğrudan viral RNA ekstraksiyon teknikleri, gıda ürününün bir guanidinium
izotiyosiyanat (GITC)/fenol bazlı reaktif ile muamele edilmesini ve ardından
ekstrakte edilen RNA'nın saflaştırılmasını içerir.
– Çeşitli 10 g yemeye hazır gıdalarda, 106 NoV GI/GII genomik kopyasının tespiti
sürekli olarak mümkün olurken, 104 NoV GI/GII genomik kopyası sadece ara sıra
tespit edilebilmiştir [32].
– Bu yaklaşım aynı zamanda gıda kaynaklı bir NoV salgınına karışan istiridyelerde
NoV varlığını göstermek için de kullanılmıştır [33].

41. Virüs ekstraksiyonu; Proteinaz-
K ile muamele
– Proteinaz K ve ısıl işlemi birleştiren yeni bir yöntem en yaygın enteropatojenik
virüslerin ekstraksiyonu için bir çalışma grubu tarafından seçilmiştir [41] .
– Bu enzimatik/termal işlem viral kapside zarar vererek nükleik asitleri serbest
bırakır. Bu yaklaşım, kabuklu deniz ürünleriyle ilgili çeşitli NoV gıda kaynaklı
olaylar sırasında güvenilirliğini kanıtlamıştır [31].

42. RNA saflaştırılması
TRIzol RNA Ekstraksiyonu
Viral RNA ekstraksiyonu için virüs
pelleti, 1 mL TRIzol (Invitrogen, Live
Technologies, Auckland, Yeni Zelanda)
hacimce maksimum %10 olacak şekilde
çözündürülecek ve 5 dk oda
koşullarında muhafaza edilecektir.
Daha sonra, 1 mL TRIzol için 200 µL
kloroform olacak şekilde kloroform
ilave edilecek ve vortekslenecek,
akabinde 16.100 × g, 4 °C’de 20 dk
santrifüj yapılacaktır.
Üstteki sıvı faz temiz bir Eppendorf
tüpüne aktarılacak ve üzerine 10 µL
silika ilave edilecektir. Vortekslendikten
sonra 30 dk boyunca oda koşullarında
karıştırılarak inkübe edilecektir.
Daha sonra 16.100 × g‘de, 30 s santrifüj
edildikten sonra supernatant
uzaklaştırılacaktır. Silika pelleti, 3 kez
%70’lik etanol ve 1 kez de 400 µL’lik
aseton ile yıkanacaktır. Supernatantın
uzaklaştırılması sonrası, pellet 56 °C’de
5 dk kurutulacaktır.
RNase içermeyen 35 µL su, bu
kurutulmuş pellet üzerine ilave edilecek
ve silika tanecikleri vortekslenecek. Üst
fazın uzaklaştırılmasından sonra 56
°C’de 30 dk inkübe edilecektir.
Bu örnek 16.100 × g’de 1 dk santrifüj
edildikten sonra supernatant temiz bir
Eppendorf tüpüne aktarılacaktır. Viral
RNA’lar test aşamasına kadar -70 °C’de
muhafaza edilecektir.
[31]

43. RNA saflaştırılması
RNeasy Mini Kit RNA ekstraksiyonu
– Bu yöntem ile ekstraksiyon işlemi, RNeasy mini kit üreticisi tarafından belirtilen
prosedürler ile gerçekleştirilecektir. Elde edilecek viral RNA, RNase içermeyen
35 µL su içerisinde süspanse edilecek ve testlere kadar -70 °C’de muhafaza
edilecektir.
– Kit RNA’yı bağlayan fakat diğer molekülleri bağlamayan bir kolon içermektedir.
Daha sonra bu bağlayan RNA serbest bırakılır.

44. Gıda Kaynaklı Virüslerin Tespiti
– Hassas ve spesifik,
– Bütün insan genotiplerini tanımlayabilen,
– Hızlı, anlık sonuçlar veren,
– Düşük saptama değerine sahip,
– Kulanımı kolay,
– Taşınabilen ve özel ekipman gerektirmeyen,
– Farklı gıda ve çevre örneklerinde kullanılabilen,
– Bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virüsleri ayırt edebilen (aktif/inaktif).

45. Gıda Kaynaklı Virüslerin Tespiti
– Virüslerin saptanması için en yaygın olarak kullanılan yöntemler üç kategoriye
ayrılabilir:
– viral enfektiviteyi ölçen teknikler
– fiziksel viral partiküllerin doğrudan sayımına dayananlar
– viral nükleik asit ve proteini inceleyenler

46. Plak formasyonunun saptanması
Plak formasyonunda, birleşik bir tek hücre tabakası, farklı konsantrasyonlarda bir litik virüs ile
enfekte edilir.
Enfekte tek tabakalar daha sonra viral yayılmayı önlemek için tutundurucu bir kaplama
ortamı ile kaplanır.
Enfeksiyon ve replikasyon sonucu hücre ölümü bölgeleri (plaklar) gelişmeye başlayacaktır.
Enfekte hücreler, replikasyon lizis-enfeksiyon döngüsünü yayacak ve giderek daha
belirgin ve ayrı plaklara yol açacaktır.
Görünür plak oluşumu, kullanılan virüse ve konakçı hücrelere bağlı olarak 2-14 gün
sürebilir.
Plaklar tipik olarak manuel olarak sayılmak üzere nötr kırmızı veya kristal menekşe ile zıt
boyanır.
Kullanılan seyreltme faktörü ile kombinasyon halinde viral yoğunluk, mililitrede plak oluşturan
birimler (PFU) (PFU/ml) cinsinden hesaplanır.
[35]

47. TCID50
Plak oluşumu, viral titreleri belirlemek için son derece yararlı bir yöntem olmasına rağmen, kültürde plak
oluşturmayan birkaç virüs türü vardır.
TCID50 testleri gibi alternatif prosedürler, kültürdeki hücreler canlı kalırken 5 ila 20 günlük makul bir süre
boyunca doku kültüründe sitopatik etkilere (CPE) neden olabilen bu tür virüs türlerinin enfeksiyon titresini
belirlemek için kullanılmaktadır.
TCID50, hücre tek tabakalarının %50'sini enfekte etmek için gereken virüs dilüsyonu olarak tanımlanan doku
kültürü enfeksiyon dozudur.
TCID50 testi, hücre kültüründe enfeksiyon oluşturmak için gereken süre nedeniyle genellikle 7 güne kadar
sürebilen zaman alıcı olarak kabul edilir.
TCID50'nin görselleştirilmesi ve hesaplanması: CPE, farklı virüs dilüsyonları ile aşılanmış kuyucukları gözlemleyerek
tersine çevrilmiş bir mikroskop (inverted misroscope) altında görüntülenebilir.
[36]

48. Nükleik Asit Amplifikasyon
teknikleri (NAAT'ler)
– NAAT virüs tahlilleri viral genomun belirli bölgelerini saptayıp
çoğalttığından, kan dolaşımında antijenler ve/veya antikorlar
ortaya çıkmadan önce bile viral varlığı doğrularlar.
– Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), virüse özgü primerler ve
termostabil DNA polimeraz kullanarak viral DNA bölgesinin kopya
sayısını yükseltir. Bir floresan prob, amplifiye edilmiş hedefi bağlar
ve saptanabilir bir sinyal yayar. PCR, RNA virüslerini doğrudan
tespit etmek için kullanılamaz ve bu nedenle, amplifikasyon
reaksiyonunu gerçekleştirmeden önce RNA genomunun DNA'ya
bir ters transkripsiyonu (RT-PCR) gereklidir [35].

49. Nükleik Asit Amplifikasyon
teknikleri (NAAT'ler)
– Nicel PCR (qPCR), her amplifikasyon döngüsünden sonra bir
floresan miktarının tespit edilmesi adımı içerir. Standart bir eğri,
hedef virüs DNA'sının veya kopyalanmış RNA'nın mutlak
miktarının belirlenmesine izin verir.
– LAMP (loop aracılı izotermal yöntemi) deneyi, 65ºC'de termostabil
bir amplifikasyon reaksiyonudur. PCR'den farklı olarak, sıcaklık
döngüsüne dayanmaz ve bu nedenle periyodik çalkalama ile bir
mikroplaka okuyucuda gerçek zamanlı olarak ölçülebilir. Bu
yöntem kolorimetrik veya floresan olabilir. PCR ile
karşılaştırıldığında bu yaklaşımın hız ve maliyet avantajları vardır.
Ek olarak, yüksek oranda otomatikleştirilebilir olması, onu hızlı
teşhis için en iyi virüs testlerinden biri haline getirir [37].

50. Nükleik Asit Amplifikasyon
teknikleri (NAAT'ler)
– İlk adımlar sırasında hedefe özgü bir kök döngü DNA yapısının
oluşturulması yoluyla LAMP, bu başlangıç malzemesini yarı
katlanarak verimli bir şekilde yükseltmek için iplikçik yerinden
eden bir DNA polimeraz kullanır ve 1 saatten daha az bir sürede
109 hedef kopyasına neden olur.

51. Nükleik Asit Amplifikasyon
teknikleri (NAAT'ler)
– Yeni Nesil Dizileme (NGS), birinci nesil Sanger
dizilemesinden çok daha hızlı ve daha ucuz bir
yaklaşım sunan farklı modern DNA/RNA dizileme
teknolojilerini tanımlayan genel bir terimdir. Bu
yöntemler, aşıların ve bunlara karşı tedavilerin
üretilmesine yardımcı olacak yeni virüsler
hakkında önemli bilgiler sağlayabileceği
düşünülmektedir. DNA veya RNA'nın doğru
ölçümü ve NGS'yi çalıştırmadan önce saflık
kontrolü prosedürün başarısı için kritik öneme
sahiptir.

52. Western blot
– Western blot, araştırmalarda proteinleri ayırmak ve tanımlamak için sıklıkla kullanılır. Bir
hücre, doku, organ veya vücut sıvısından izole edilen spesifik viral proteinleri tespit eder.
– Bu teknikte bir protein karışımı, jel elektroforezi yoluyla moleküler ağırlığa göre ayrılır. Bu
sonuçlar daha sonra her protein için bir bant üreten bir membrana aktarılır.
– Membran daha sonra ilgili proteine özgü etiketli antikorlarla inkübe edilir. Bağlı olmayan
antikor yıkanarak ayrılarak, yalnızca ilgili proteine bağlı antikor bırakılır. Bağlı antikorlar
daha sonra film geliştirilerek tespit edilir.
– Antikorlar yalnızca ilgilenilen proteine bağlandığından, yalnızca bir bant görünür
olmalıdır. Bandın kalınlığı, mevcut protein miktarına karşılık gelir; böylece bir standart
yapmak, mevcut protein miktarını gösterebilir.
[38]

53. İmmünopresipitasyon yöntemi
– İmmunopresipitasyon (İmmun-çöktürme) yöntemi antijen
saflaştırılmasında ve belirlenmesi için yaygın olarak kullanılan
yöntemlerden biridir.
– Bu yöntemde kompleks antijen içeren solüsyondan ilgili antijenleri
izole etmek için antijene spesifik antikorlar kullanılır ve ardından
yapılan SDS-PAGE uygulamasıyla bir kompleks protein karışımında
bulunan antikor-reaktif antijenin boyutunun belirlenmesi sağlanır.
[39]

54. ELISA
– Enzim Bağlantılı İmmünosorbent testleri (ELISA), serolojik örneklerde
bir enfeksiyon veya viral antijenler tarafından oluşturulan antikorların
varlığını ve/veya konsantrasyonunu ölçer.
– Antikorlar enfeksiyondan yıllar sonra bile kan dolaşımında kaldığından,
pozitif bir test aktif enfeksiyonun bir göstergesi değil, virüse maruz
kalma, yeniden enfeksiyon veya yeniden etkinleştirme durumundan
kaynaklanan hasta bağışıklığını belirler.
– ELISA'lar, zaman içinde farklı popülasyonlarda mevcut ve geçmiş
hastalık prevalansını inceledikleri için, hastalığın epidemiyolojisinin
incelenmesi için çok değerlidir.
[35]

55. Akış sitometresi (FCM)
– Genel olarak, viral partikül tespiti için FCM bazlı testler yüksek hassasiyet
sağlamaz [86, 87]; ancak ticari olarak geliştirilmiş FCM yöntemlerinden
bazıları (örneğin, Virus Counter® 2100), yüksek hassasiyetlerle basit ve
hızlı virüs miktar tayinleri sunar.
– SYBR Green I, çift sarmallı DNA (dsDNA) ve RNA'ya bağlanan, oldukça
hassas siyanin bazlı bir floresan boyadır. Buna karşılık, SYBR Green I
floresan boyalar, aşırı parlaklığı ve düşük arka planı nedeniyle çok tercih
edilir. Bununla FCM, laboratuvar deneylerinden ve doğal numunelerden
virüsleri saymak için başarıyla kullanılmaktadır.
[38]

56. Transmission Electron
Microscopy (TEM)
– Çoğu virüs, doğrudan ışık mikroskobu altında görülemeyecek kadar küçüktür ve bu nedenle
yalnızca TEM (transmisyon elektron mikroskobu) ile görüntülenebilir.
– Özellikle birçok bağırsak virüsü, negatif boyamalı TEM mikroskopisi ile keşfedilmiştir.
– TEM yavaş yavaş PCR gibi daha hassas yöntemlerle değiştirilse de, yine de virüslerin keşfi,
tanımlanması ve titrasyonu dahil olmak üzere virolojinin çeşitli yönleri için hala temel olmaya
devam etmektedir.
– TEM kullanmanın en büyük avantajlarından biri, virüse özgü reaktifler gerektirmemesidir; bu,
etiyolojik ajanın bilinmediği bir salgın ortamında özellikle önemlidir ve bu nedenle doğru tespit
testlerini belirlemek için spesifik reaktifler mevcut olmayabilir.
[38, 40]

57. Hemagglutination Assay (HA)
– Bu analiz, birçok virüsün kırmızı kan hücrelerini (RBC) bağlayabilen ve aglutine edebilen proteinler (örneğin influenza virüsü
hemaglutinin (HA) proteini) içerdiği gerçeğine dayanır.
– İlke, aglütinasyon özelliğine dayalı olarak viral partiküllerin sayısını ölçmektir.
– Bu tahlilin prensibi basittir; ancak numune hazırlama zahmetli olarak kabul edilir ve bazı dezavantajlar sunar. Örneğin,
tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, aglütinasyon özellikleri zamanla azaldığından RBC'nin taze olarak hazırlanması
gerekir.
– Ek olarak, bireysel RBC kaynağı köken olarak farklı olabileceğinden, genellikle referans standardıyla test standardizasyonu
gereklidir.
– Ayrıca HA, diğer virüs miktar tayini yöntemlerinden farklı olarak (plak formasyonu veya TCID50 gibi), bu tahlil için virüs
replikasyonu gerekli olmadığından herhangi bir viral enfektivite tahmini sağlamaz. [38, 41]

58. Hemaglütinasyon İnhibisyon
Testi (HAI)
– HAI testinin temeli, o belirli virüse karşı antikorların virüsün
RBC'ye bağlanmasını önleyeceğidir. Bu nedenle, antikorlar
mevcut olduğunda hemaglütinasyon inhibe edilir.
– HAI Titresi: Hemaglütinasyonu önleyen en yüksek serum
dilüsyonuna (Ab) serumun HAI titresi denir. Serum, kızamık
virüsü ile reaksiyona giren antikorlar içermiyorsa, tüm
kuyucuklarda hemaglütinasyon gözlenecektir. Benzer şekilde,
kızamık virüsüne karşı antikorlar mevcutsa, antikorlar
yeterince seyreltilene kadar hemaglütinasyon
gözlemlenmeyecektir [42].

59. Referans Metod; Norovirus,
Hepatitis A
– 15216-2:2019
– This document specifies a method for detection of hepatitis A virus (HAV) and
norovirus genogroups I (GI) and II (GII), from test samples of foodstuffs [(soft
fruit, leaf, stem and bulb vegetables, bottled water, bivalve molluscan shellfish
(BMS)] or surfaces using real-time RT-PCR.
– This method is not validated for detection of the target viruses in other
foodstuffs (including multi-component foodstuffs), or any other matrices, nor
for the detection of other viruses in foodstuffs, surfaces or other matrices.

60. Sonuç
– Dünya çapında gıda kaynaklı hastalıkların insidansında bir artış olmuştur ve virüsler artık bu hastalıkların ana nedeni olarak kabul edilmektedir. O
yüzden gıdalarda virüslerin tespitine yönelik çalışmalar hız kazanmıştır.
– Viral antijenlerin veya viral gen ekspresyonunun miktarının belirlenmesi genellikle daha hızlı ve tekrarlanabilirken genellikle mutlak parçacık
sayımı için zorluk yaşarlar. Benzer şekilde, qPCR birkaç saat içinde sonuç verebilmesine rağmen zahmetlidir, yetenekli bir operatör gerektirir ve
kontaminasyona karşı hassastır.
– TEM tabanlı niceleme, viral partikülün şeklini ve toplam sayısını belirlemede oldukça doğru olmasına rağmen, genellikle zaman alıcı, son derece
pahalı ve yüksek numune sayıları için pratik olmadığı düşünülür.
– O yüzden spesifik, basit, enfekte edebilen/edemeyen virüsleri ayırt edebilecek yöntemlerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar yapılmaktadır.
– Şu an gıdalarda virüslerin tespiti için ISO’nun önerdiği 2 metot bulunmaktadır.
– ISO 15216-1:2019
– ISO 15216-2:2019

61. Kaynakça
– [1] Virus Characteristics. (2021, March 6). Retrieved June 01, 2021, from https://bio.libretexts.org/@go/page/6605
– [2] Bosch, A., Pintó, R. M., & Guix, S. (2016). Foodborne viruses. Current opinion in food science, 8, 110–119.
https://doi.org/10.1016/j.cofs.2016.04.002
– [3] Bosch, A., Gkogka, E., Le Guyader, F. S., Loisy-Hamon, F., Lee, A., Van Lieshout, L., ... & Phister, T. (2018). Foodborne viruses: Detection, risk
assessment, and control options in food processing. International Journal of Food Microbiology, 285, 110-128.
– [4] Speaking of Science: Bacterial vs viral infection. Retrieved June 01, 2021, from https://elkodaily.com/lifestyles/speaking-of-science-bacterial-
vs-viral-infection----why-there-is-no-medication/article_ede5e6d9-4d2f-5cef-86cb-90719d560a25.html
– [5] WOU ‘’ https://people.wou.edu/~boomers/FullProf06/teachingstuff/331stuff/05vir1PPT.pdf 28.05.2021‘’
– [6] Khan Academy, Intro to viruses ‘’ https://www.khanacademy.org/science/high-school-biology/hs-human-body-systems/hs-the-immune-
system/a/intro-to-viruses 29.05.2021’’
– [7] Steps of Virus Infections. ‘’https://www.texasgateway.org/resource/212-virus-infections-and-hosts 29.05.2021’’
– [8] Hennechart-Collette, C., Dehan, O., Laurentie, M., Fraisse, A., Martin-Latil, S., & Perelle, S. (2021). Detection of norovirus, hepatitis A and
hepatitis E viruses in multicomponent foodstuffs. International Journal of Food Microbiology, 337, 108931.
– [9] FAO, WHO, 2008. Viruses in Food: Scientific Advice to Support Risk Management Activities. Meeting Report. Geneva.
– [10] Todd, E. C., & Grieg, J. D. (2015). Viruses of foodborne origin: a review. Virus Adaptation and Treatment, 7, 25.

62. Kaynakça
– [11] Belliot G, Lopman BA, Ambert-Balay K, Pothier P. The burden of norovirus gastroenteritis: an important foodborne and healthcare- related
infection. Clin Microbiol Infect. 2014;20:724–730.
– [12] Ethelberg S, Lisby M, Böttiger B, et al. Outbreaks of gastroenteritis linked to lettuce, Denmark, January 2010. Euro Surveill. 2010;15:pii 19484.
– [13] Bernard H, Faber M, Wilking H, et al. Large multistate outbreak of norovirus gastroenteritis associated with frozen strawberries, Germany,
2012. Euro Surveill. 2014;19:20–19.
– [14] European Food Safety Authority. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne
outbreaks in 2012. EFSA J. 2014;12:1–312.
– [15] Norovirus Infographic. https://www.megapixl.com/norovirus-infographic-illustration-88809813 29.05.2021’’
– [16] Wheeler C, Vogt TM, Armstrong GL, et al. An outbreak of hepatitis A associated with green onions. N Engl J Med. 2005;353:890–897.
– [17] Gallot C, Grout L, Roque-Afonso AM, et al. Hepatitis A associated with semidried tomatoes, France, 2010. Emerg Infect Dis. 2011;17: 566–
567.
– [18] Goyal, S. M., & Cannon, J. L. (Eds.). (2006). Viruses in foods (Vol. 10, pp. 0-387). New York:: Springer.
– [19] Takahashi K, Kitajima N, Abe N, Mishiro S. Complete or near-complete nucleotide sequences of hepatitis E virus genome recovered from a
wild boar, a deer, and four patients who ate the deer. Virology. 2004;330: 501–505.
– [20] Colson P, Borentain P, Queyriaux B, et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. J Infect Dis. 2010;202:
825–834.

63. Kaynakça
– [21] Aboubakr, H., & Goyal, S. (2019). Involvement of egyptian foods in foodborne viral illnesses: The burden on public health and related environmental risk factors: An
overview. Food and environmental virology, 11(4), 315-339.
– [22] Centers for Disease Control and Prevention. Rotavirus. Available from: http://www.cdc.gov/rotavirus/clinical.html. Accessed January 16, 2015.
– [23] Fletcher M, Levy ME. Foodborne outbreak of Group A rotavirus gastroenteritis among college students – District of Columbia, March–April 2000. MMWR Morb Mortal Wkly
Rep. 2000;49:1131–1133.
– [24] Xia S, Liu Q, Wang Q, et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) entry inhibitors targeting spike protein. Virus Res. 2014;194:200–210.
– [25] Lau SK, Woo PC, Li KS, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:14040–14045.
– [26] Centers for Disease Control and Prevention. NORS Foodborne Outbreak Online Database (FOOD). Available from: http://wwwn.cdc.gov/foodborneoutbreaks/Default.aspx.
Accessed January 13, 2015.
– [27] Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, et al. Atypical avian influenza (H5N1). Emerg Infect Dis. 2004;10:1321–1324.
– [28] Choffnes ER, Relman DA, Olsen LA, Hutton R, Mack A, Improving Food Safety through a One Health Approach: Forum on Microbial Threats Board on Global Health.
Washington DC, USA: Institute of Medicine; 2012.
– [29] Todd ECD. Food safety assurance systems: personal hygiene and employee health. In: Motarjemi Y, Moy GG, Todd ECD, editors. Encyclopedia of Food Safety. Waltham, MA,
USA: Academic Press; 2014.
– [30] Hennechart-Collette, C., Dehan, O., Laurentie, M., Fraisse, A., Martin-Latil, S., & Perelle, S. (2021). Detection of norovirus, hepatitis A and hepatitis E viruses in
multicomponent foodstuffs. International Journal of Food Microbiology, 337, 108931.
– [31] Stals, A., Baert, L., Van Coillie, E., & Uyttendaele, M. (2012). Extraction of food-borne viruses from food samples: a review. International journal of food microbiology, 153(1-
2), 1-9.

64. Kaynakça
– [32] Stals, A., Baert, L., De Keuckelaere, A., Van Coillie, E., Uyttendaele, M., 2011b. Evaluation of a norovirus detection methodology for ready-to-eat foods. International Journal
of Food Microbiology 145, 420–425.
– [33] de Roda Husman, A.M., Lodder-Verschoor, F., van den Berg, H.H.J.L., Le Guyader, F.S., Van Pelt, H., van der Poel, W.H.M., Rutjes, S.A., 2007. Rapid virus detection procedure
for molecular tracing of shellfish associated with disease outbreaks. Journal of Food Protection 70, 967–974.
– [34] Lees, D., 2010. International standardisation of a method for detection of human pathogenic viruses in molluscan shellfish. Food and Environmental Virology 2, 146–155.
– [35] Krumm, A. (2020). Virus assays. Retrieved June 01, 2021, from https://www.bmglabtech.com/virus-assays/.
– [36] Biacchesi S, Skiadopoulos M, Yang L, Murphy B, Collins P, Buchholz U. Rapid human metapneumovirus microneutralization assay based on green fluorescent protein
expression. J Virol Methods. 2005;128:192-7
– [37] Crone MA et al. (2020) A new role for Biofoundries in rapid prototyping, development, and validation of automated clinical diagnostic tests for SARS
CoV. doi.org/10.1101/2020.05.02.20088344
– [38] Pankaj, K. (2021). Virus Identification and Quantification. Retrieved June 01, 2021, from https://www.labome.com/method/Virus-Identification-and-
Quantification.html#ref48
– [39] Maxwell K, Frappier L. Viral proteomics. Microbiol Mol Biol Rev. 2007;71:398-411
– [40] Kapikian A, Wyatt R, Dolin R, Thornhill T, Kalica A, Chanock R. Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute infectious nonbacterial
gastroenteritis. J Virol. 1972;10:1075-81
– [41] hompson C, Petiot E, Lennaertz A, Henry O, Kamen A. Analytical technologies for influenza virus-like particle candidate vaccines: challenges and emerging approaches. Virol J.
2013;10:141
– [42]Noah DL et al. (2009) Qualification of the Hemagglutination Inhibition Assay in Support of Pandemic Influenza Vaccine Licensure. Clin Vaccine Immunol, 2009 Apr;16(4):558-
66. doi: 10.1128/CVI.00368-08. Epub 2009 Feb 18.