Troubleshooting in Gascromatografia. Soluzione ai problemi di mancata risoluzione, picchi codati, linea di base instabile, ed altro ancora.

1. Gascromatografia,
……….TROUBLESHOOTING
dott. Davide Facciabene
GC & GC-MS Product Specialist at Thermo Fisher Scientific

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TROUBLESHOOTING in GASCROMATOGRAFIA
La gascromatografia, come ogni tecnica analitica, presenta diverse
problematiche che possono influire sulla qualità dei risultati. Alcuni dei problemi
più comuni includono la presenza di contaminanti, l'invecchiamento della
colonna, problemi di iniezione del campione, variazioni nella temperatura della
colonna, problemi di flusso del gas, sensibilità dello strumento, e così via. Ogni
problema richiede un'analisi attenta e una diagnosi accurata per determinare la
causa e trovare una soluzione.
Il troubleshooting in gascromatografia può essere una sfida, ma con
l'esperienza e la conoscenza delle tecniche analitiche, è possibile risolvere
efficacemente la maggior parte dei problemi e ottenere risultati affidabili e
riproducibili.

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TROUBLESHOOTING in GASCROMATOGRAFO
- fronting peaks
- tailing peaks
- low/no resolution (scarsa risoluzione)
- split peaks (picchi doppi)
- broad peaks (picchi larghi)
- column bleed (alto spurgo di colonna)
- RT Shift (RT instabile)
- baseline noise & drift (linea di base instabile)
- ghost peaks (picchi fantasma)
- spikes (segnali spuri)
- no peaks (assenza di picchi e/o di segnale)
fenomeni spiegati:
solvent trap, flashback effect e flooding effect

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FRONTING PEAKS
front-tail, coda frontale

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overload della colonna
iniettare meno campione,
aumentare il rapporto di splittaggio in caso di iniezione split
iniettare in modalità pulsed in caso di iniezione splitless
cambio colonna aumentando il diametro interno e/o il tickness
FRONTING PEAKS – CAUSE E RIMEDI
fase stazionaria non adeguata
tentare con una programmata del forno che parte da una temperatura
iniziale maggiore del punto di eb. del solvente utilizzato, almeno di 10°C
cambiare colonna

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TAILING PEAKS – CAUSE E RIMEDI
Normal Tail Shark fin
Shark fin peak, è la forma finale cui tende la codatura all’aumentare della
quantità di principio attivo, ma non è un overload, che invece è un problema di
altra natura che da un picco con front taill.

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TAILING PEAKS – CAUSE E RIMEDI
sostituzione del liner e/o taglio della colonna, minimo 10 cm, possibile anche 30 o
50 cm dipende dall'applicazione analitica
adsorbimento del principio attivo nel liner e/o nella colonna
leak a livello di iniettore, pneumatica o gas carrier in genere
controllare integrità del setto, montaggio della colonna, eventuali leak a monte
dell’iniettore

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SCARSA RISOLUZIONE
scarsa risoluzione completa risoluzione

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programma termico del forno non adeguato
eseguire un programma termico progressivo al fine di verificare la capacità
risolutiva della colonna.
La temperatura iniziale deve essere più bassa del punto di ebollizione del
solvente iniettato, almeno di 10°C.
La progressione termica indicativamente di 10°C/min.
SCARSA RISOLUZIONE – CAUSE E RIMEDI

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SCARSA RISOLUZIONE – CAUSE E RIMEDI
taglio della colonna all’iniettore non corretto
tagliare la colonna incidendola col segmento ceramico, non bisogna
seghettare ma eseguire un solo movimento di taglio, una volta incisa
la colonna, va piegato il mancante nel verso dell'incisione, quindi
lontano da voi, e poi spezzare l'estremità piegandola nel verso
opposto dell'incisione, verso di voi.. Il taglio deve essere netto ed
ortogonale alla colonna, senza schegge o becco di clarino

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SPLIT PEAKS / picchi doppi – CAUSE E RIMEDI
split peaks
trattasi della stessa sostanza, che mostra una separazione
cromatografica, o un accenno di essa che non dovrebbe
esserci.
A volte, questo problema viene erroneamente interpretato
come la mancata separazione di due picchi differenti, quindi
come un problema di mancata risoluzione, non è questo il
caso, piuttosto è l’esatto contrario, ossia una mancata
focalizzazione del picco.

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SPLIT PEAKS / picchi doppi – CAUSE E RIMEDI
si può manifestare in diverse forme cromatografiche, su tutti i picchi del
cromatogramma o solo su una parte di essi, solitamente quelli che
escono per primi

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SPLIT PEAKS / picchi doppi – CAUSE E RIMEDI
iniezione manuale senza air gap,
campione che rimane nell'ago durante l'iniezione
AIR GAP nell’ago campione nella siringa
NO AIR GAP, campione nell’ago
OK
KO
l’autocampionatore di default carica il campione in siringa con air gap nell’ago

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SPLIT PEAKS / picchi doppi – CAUSE E RIMEDI
uso di liner inadeguato, in particolare con iniettore PTV a freddo
parte del campione liquido finisce direttamente in colonna
durante l’iniezione e prima della vaporizzazione
utilizzare liner con lana di vetro o non lineari, quindi con bolle o
restrizioni oppure in caso di liner lineari, sufficientemente stretti
(ID di 2 mm o minore)

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SPLIT PEAKS / picchi doppi – CAUSE E RIMEDI
errato montaggio della colonna
controllare posizione della colonna
in uscita dal nut dell’iniettore
rispettare le misure indicate dal
fornitore

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normalmente, in media, un picco acquisito con una colonna da 30 m per 0.25 mm,
flussato con He a 1.2 ml/min, presenta una larghezza alla base di 6 – 8 secondi
BROAD PEAKS / picchi larghi /– CAUSE E RIMEDI

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solvent trap non efficacie
abbassare la temperatura iniziale del forno di 5-10°C o più rispetto al p.e.
del solvente iniettato
BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI

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SOLVENT TRAP
rapida condensazione del
solvente iniettato nella prima
parte della colonna
grazie ad una temperatura del
forno sensibilmente più bassa
del p.e. del solvente utilizzato
questo fenomeno produce picchi
cromatografici più stretti
BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI
bassa temp. forno
alta temp. forno

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BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI

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BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI
solvent trap controproducente ( flooding effect )
aumentare la temperatura iniziale del forno di almeno 10°C sopra il p.e. del
solvente iniettato
FLOODING EFFECT
si verifica quando il principio attivo in esame presenta scarsa affinità con la fase
stazionaria della colonna. Forzare la sua condensazione sfruttando il solvent trap,
ne provoca si una condensazione, ma il picco letteralmente «scivolerà» sulla
superficie della fase stazionaria, generando un picco molto largo a volte più largo
che alto

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BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI
flusso di colonna troppo basso
aumentare il flusso in colonna, in base alla geometria della stessa
e al tipo di gas carrier utilizzato

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BROAD PEAKS / picchi larghi – CAUSE E RIMEDI
colonna 30 m per 0.25 mm
He 20-30 cm/sec massima
efficienza
massima velocita 35 cm/sec
He 1.0 ml/min
sono valori teorici,
differiscono leggermente dalla realtà

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COLUMN BLEEDING / alto spurgo – CAUSE E RIMEDI
elevato innalzamento della linea di base del cromatogramma, spesso in
concomitanza dell’aumento di temperatura del forno o solo al superamento di
una certa temperatura del forno

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inadeguato condizionamento della colonna
ricondizionare la colonna
COLUMN BLEEDING / alto spurgo – CAUSE E RIMEDI
contaminazione della colonna
ricondizionare la colonna e/o tagliare da 10 ai 50 cm
ingresso di aria a livello di iniettore e/o detector
controllare setto e montaggio colonna

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RT Shift / RT instabile – CAUSE E RIMEDI
ingresso d’aria a livello di iniettore
sostituire setto e controllare montaggio della colonna
temperatura del forno instabile
chiamare assistenza tecnica
flusso colonna instabile
chiamare assistenza tecnica

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LINEA DI BASE INSTABILE / NOISE & DRIFT – CAUSE E RIMEDI
noise
linea di base instabile che presenta un’elevata variabilità nell’unità di tempo

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LINEA DI BASE INSTABILE / NOISE & DRIFT – CAUSE E RIMEDI
drift
linea di base che va in deriva, anche con forno a temperatura costante

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LINEA DI BASE INSTABILE / NOISE & DRIFT – CAUSE E RIMEDI
noise & drift
i due problemi sono spesso presenti contemporaneamente, per cause comuni

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LINEA DI BASE INSTABILE / NOISE & DRIFT – CAUSE E RIMEDI
ingresso d’aria a livello di iniettore e/o detector
sostituire setto e controllare montaggio della colonna lato iniettore e detector
flusso dei gas di colonna e/o detector instabile o grado di purezza non adeguate
controllare livello di pressione dei gas e grado di purezza
problema elettronico
chiamare assistenza tecnica

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GHOST PEAKS – CAUSE E RIMEDI
Picchi inaspettati, che compaiono con tempi ritenzione costanti o variabili

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contaminazione di siringa, soluzioni di lavaggio, iniettore e/o colonna
incrementare cicli e volumi di lavaggio della siringa,
sostituire il solvente di lavaggio con uno piu idoneo
(isoottano:acetone 80:20)
lavare la siringa su più vial, una di pre ed una di post iniezione
GHOST PEAKS – CAUSE E RIMEDI
carry over da GC run-time, durata della corsa troppo breve, p.a. permangono
in colonna
aumentare durata della isoterma finale di pulizia e/o aumentare la
temperatura
usura del setto e/o della colonna
sostituzione o nel caso della colonna, ricondizionamento

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GHOST PEAKS – CAUSE E RIMEDI
usura del setto e/o della colonna
sostituzione o nel caso della colonna, ricondizionamento

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flashback, volume vaporizzato di campione che eccede il volume
del liner
Uso di un liner di volume maggiore
Uso di solventi con minor coeff. di espansione
Uso di un iniettore PTV
Iniettare meno
GHOST PEAKS – CAUSE E RIMEDI

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FLASHBACK EFFECT PROBLEM
Cause:
Volume del solvente vaporizzato è maggiore del volume fisico del liner
Dove:
Si manifesta in modalità splitless ed in particolare con iniettori di tipo SSL
Soluzioni:
Uso di un liner di volume maggiore
Uso di solventi con minor coeff. di espansione
Uso di un iniettore PTV
Iniettare meno

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FLASHBACK EFFECT PROBLEM

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FLASHBACK EFFECT PROBLEM

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flashback, volume di campione che eccede il volume del liner
Uso di un liner di volume maggiore
Uso di solventi con minor coeff. di espansione
Uso di un iniettore PTV
Iniettare meno
GHOST PEAKS – CAUSE E RIMEDI

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SPIKES – CAUSE E RIMEDI
Non sono picchi cromatografici, ma linee di segnale della durata di decimi o
centesimi di secondo che attraversano il cromatogramma verticalmente, a volte
anche sotto la linea di base, tipico dei detector analogici (FID, ECD, NPD, FPD…)

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SPIKES – CAUSE E RIMEDI
estremità della colonna nel detector compromessa, cessione di parti (FID)
tagliare qualche centimetro di colonna, eventualmente pulire il detector
problema elettronico, specie se si presenta con spike negativi, sotto la linea di base
chiamare assistenza tecnica

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NO PEAKS – CAUSE E RIMEDI
NO PEAKS !!

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NO PEAKS – CAUSE E RIMEDI
siringa otturata (linea di base presente)
verificare che la siringa non sia otturata
problema detector (linea di base non presente)
chiamare assistenza tecnica

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Grazie per l’attenzione