(마더리스크라운드) Determination of Isotretinoin & Acitretin in Pregnancy

Determination of Isotretinoin
and Acitretin in Pregnancy
Acitretin (trade names Soriatane and Neotigason) is a
second-generation retinoid. It is taken orally, and is
typically used for psoriasis.. Acitretin is an oral retinoid
used in the treatment of severe resistant psoriasis.
Because of the potential for problems and severe side
effects it is generally used in only very severe cases of
psoriasis that have been unresponsive to other treatments.
Acitretin
LC-MS/MS
Retinoic
acid
Acitretin
LC-MS/MS
Liquid chromatography
Mass spectrometry
The goal of this study was to develop a method for the
simultaneous measurement of biologically active
endogenous retinoids in human serum. Due to the
challenges in separating the isomers of RA as well as the
metabolites, chromatographic separation was optimized
for UPLC. The method was validated with spiked
charcoal-treated blank human serum and used to
determine retinoid concentrations in serum from healthy
men.
Retinoic acid
Retinoic acid is a metabolite of vitamin A (retinol) that
mediates the functions of vitamin A required for growth
and development. The key role of retinoic acid in
embryonic development mediates the high teratogenicity
of retinoid pharmaceuticals, such as isotretinoin used for
treatment of cancer and acne

종류 관용명 화학물질명 약칭
Acitretin류 Acitretin 9-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)-3,7-
dimethylnona-2,4,6,8-tetraenoic acid
Etretinate Ethyl all-trans-9-(4-methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)-
3,7-dimethyl-2,4,6,8-nonatetraenoate
Retinoic acid
(RA) 류
Tretinoin all- trans retinoic acid atRA
alitretinoin 9- cis –retinoic acid 9-cis RA
Isotretinoin 13- cis -retinoic acid 13-cis RA
4oxo- all-trans -retinoic acid 4oxo- at RA
4oxo-13- cis –retinoic acid 4oxo-13- cis RA
4oxo-9- cis –retinoic acid 4oxo-9- cis RA
 주의 :
Vitamin A 계열 물질로, 빛에 의해 광분해가 일어날수 있으므로
최대한 차광하여 보관하고 시약기구는 Amber류를 사용
Abbreviation Retinoids and Pregnancy
Determination of Isotretinoin and Acitretin in Pregnany

Retinoids and Pregnancy

Vitamin A (Retinoids)
NADP+
NADPH
Retinol
Dehydrogenase
Irreversible
Oxidation
NAD+,
FAD
Cis-Isomer !!

 Treatment
Isotretinoin
Isotretinoin (13-cis retinoic acid)
• 1970s : Discovered
• early 1980s : Introduced into clinical as “Accutane”
British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society. British
National Formulary. London: BMA/RPS; September 2010. p. 716.
Reduce sebum secretion
 nodulo-cystic and conglobate acne
 severe acne
 scarring acne

Isotretinoin
BIT Druginfo ; http://www.druginfo.co.kr/

Isotretinoin
 Material characteristic
Rapidly absorbed following oral administration
 highly bound to plasma protein
 metabolised to 4-oxo-isotretinoin
Elimination half-life
 isotretinoin in plasma is 6–36 hours
 up to 50 hours for its longest-lived metabolite
 safe levels of the drug : within 2 weeks of the last dose
 However, Nulman et al. Study
: 16 young adults (11 women and five men) and found a
prolonged elimination half-life in one female patient of
167.4 hours
→ 35-day period would be required until safe levels
National Teratology Information Service. Use of
Isotretinoin in Pregnancy.2008 [www.toxbase.org].
Isotretinoin half life
6–36 hours

Isotretinoin
 Dose and Clearance
Dose
 Dependent on their weight and severity of the condition
 Usually prescribed as 0.5–1.0 mg/kg/day in one or two
divided doses
 Total treatment course : from 4 to 6 months (with a total
cumulative dose of 120–150 mg/kg)
Clearance
 no significant correlation between dose and steady
state concentration
 due to large variability in clearance
British Medical Association and Royal Pharmaceutical Society. British
National Formulary. London: BMA/RPS; September 2010. p. 716.

Isotretinoin
 Epidemiology
Use
 most usually occurs in adolescents
 In 1988, to 60 000 female patients of childbearing age,
per year, in the USA were treated with isotretinoin
 Tertiary centre in Leeds demonstrated
: Leeds has an approximate population of 160 438 females of
childbearing age (15–44 years). Therefore, in a year it would
be expected that approximately 1 in every 500 of the
childbearing population will be exposed to isotretinoin.
 In 2004, British Association of Dermatologists reported
16 pregnancies over a 6-month period
 Canadian study of 8609 women treated with
isotretinoin found that 90 became pregnant (1%)
Goodfield MJD, Cox NH, Bowser A, McMillan JC, Millard LG, Simpson NB, Ormerod AD. Advice on the safe
introduction and continued use of isotretinoin in acne in the UK 2010. Br J Dermatol 2010;162:1172–9.

Isotretinoin
 Birth defect during pregnancy
Dolan SM. Isotretinoin and pregnancy a continuing risk for birth defects.
Medscape Ob/Gyn 2004;9(2).

Isotretinoin
Dolan SM. Isotretinoin and pregnancy a continuing risk for birth defects.
Medscape Ob/Gyn 2004;9(2).
Craniofacial defects
 ear defects
 eye defects
 cleft palate
 micrognathia (small jaw)
 depressed nasal bridge
 Dysmorphism
 ocular hypertelorism (widely spaced eyes)
Central nervous system defects
 microencephaly
 facial nerve palsy
 hydrocephalus
 cortical and cerebellar defects
Cardiovascular defects
 Fallot’s tetralogy
 septal defects
 transposition of the great vessels and
aortic arch hypoplasia
Thymic abnormalities
 hypoplasia
 aplasia and ectopia

Isotretinoin
 Over all 3) : National Teratology Information Service. Use of Isotretinoin in Pregnancy.2008 [www.toxbase.org].
Reference malformations spontaneous miscarriage
Over all 3) 20-30% 20-40%
Berard et al 9) 11% 3%
Lammer et al 18) 14%
 Berard et al 9) : Berard A, Azoulay L, Koren G, Blais L, Perreault S, Oraichi D. Isotretinoin, pregnancies, abortions and birth
defects: a population-based perspective. Br J Clin Pharmacol 2007;63:196–205.
 Lammer et al 18) : Lammer EJ, Chen DT, Hoar RM, Agnish ND, Benke PJ, Braun JT, et al. Retinoic acid embryopathy. N Engl J
Med 1985;313:837–41.
Suggest “should be avoided in pregnancy”

Determination of Isotretinoin and Acitretin in Pregnant

Retinoic acid and Acitretin
 임상 피부학에서 사용되는 Retinoid
1세대 : nonaromatic retinoids
• all-trans-retinoic acid
• tretinoin
• 13-cis-retinoic acid
2세대 : monoaromatic retinoids
• Etretinate
• acitretin
3세대 : polyaromatic retinoid derivatives
• Adapalene
• tazarotenic acid

Acitretin
9-(4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl)-3,7-dimethylnona-2,4,6,8-
tetraenoic acid
• 1970년대 피부암에서의 효과를 평가하기 위해 처음 약으로 제작1,2
• 피부과영역에서는 많은 증식성 질환인 건선, 어린선, 여드름 등에서 널리 사용1,2
• 특히 건선에서는 각질화, 세포증식, 염증 및 면역조절에 효과1,2
• 1972년에 합성된 monoaromatic retinoid인 etretinate는 항증식작용과 세포분화에 효과로
1984년 유럽에서 1986년에 미국에서 처음으로 건선의 전신치료로 승인 1,3
• 하지만 etretinate는 높은 지방친화성으로 지방조직에 저장되어 반감기가 2개월로 길며,
치료 중단후에도 완전히 제거되기까지 2년 정도 소요되는 단점 4
• etretinate은 비슷한 효능과 짧은 반감기를 가진 활성 대사물질인 acitretin으로 대체 되었
으며 1997년 FDA의 건선치료제로 승인 1,4
• acitretin도 알코올을 섭취하면 체내에서 재에스테르화되어 다시 etretinate로 변환 가
능1,4,5
신봉석·김동진. 건선의 치료에서 Acitretin. 대한건선학회지 제 12 권, 제 1 호
Journal of the Korean Society for Psoriasis Vol. 12, No. 1, 7-12, 2015

Retinoic acid and Acitretin Retinoids and Pregnancy
Metabolism
13cis-Acitretin
Etretinate
13-cis Acitretin
Trans-Acitretin
2. Acitretin1. Retinoic acid
Cis-Isomer !!
Acohol
Esterification!
4OH RA
4oxo RA
11-cis RA
4oxo 13-
cis RA
4oxo 9-
cis RA
Metabolite

Metabolism
13cis-Acitretin
Etretinate
13-cis Acitretin
Trans-Acitretin
2. Acitretin1. Retinoic acid
Cis-Isomer !!
Acohol
Esterification!
4OH RA
4oxo RA
11-cis RA
4oxo 13-
cis RA
4oxo 9-
cis RA
Metabolite
Esterification
The classic synthesis is the Fischer esterification, which involves treating a carboxylic acid with an alcoho
l in the presence of a dehydrating agent:
RCO2H + R′OH ⇌ RCO2R′ + H2O
F. Grønhøj Larsen. Acitretin is converted to etretinate only during concomitant alcohol intake defects.
British Journal of Dermatology 2000; 143: 1164±1169.
+
Acitretin
Etretinate
H2O
Ethanol

임신중 건선 치료제 (레티노이드 제제) 복용 ?

임신중 건선 치료제 (레티노이드 제제) 복용 ?
....'혈액관리법 시행규칙'을 일부 개정해 최
근 시행에 들어갔다....

US FDA Pregnant category
Title 21, Part 201.57 (9)(i) of the Code of Federal Regulations
Category Description
A
No risk in controlled human studies
사람을 대상으로 한 연구에서 태아에 대한 위험이 없는 것으로 알려진 가장 안전한
약물들이며 일반적인 종합비타민이나 산모용 비타민이 여기에 해당된다
B
No risk in other studies
동물을 대상으로 한 연구에서 위험성이 없는 것으로 판단되나 인간을 대상으로 한
연구가 결여된 경우로 동물이나 인간에게 유의한 위험이 없는 약물들, 예로 페니실
린이나 인슐린, 타이레놀 등이 여기에 해당된다.
C
Risk not ruled out
동물이나 사람에게서 적절한 연구가 되어 있지 않거나, 혹은 동물실험에서 태아에
해로운 영향을 다소 끼치기는 하지만 사람에게서 적절한 자료를 얻을 수 없는 약물
들이 여기에 포함되며 대다수의 약물이 여기에 포함된다.
D
Positive evidence of risk
태아에 대한 위험의 증거가 있으나 약물을 사용하여 얻을 수 있는 이득이 태아에 대
한 위험보다 크다고 판단되는 약물들이다. 항암제와 간질환자에게 사용하는 항경련
제 등이 여기에 해당된다.
X
Contraindicated in pregnancy
명백한 기형의 위험성이 증명되었고, 그 위험성이 이득보다 현저한 약물들로 임신
중에 절대 사용하지 말아야 하는 약물들이다. 여드름치료제인 이소트레티노인
(isotretinoin)이라는 약물은 임신 중 중추신경계, 안면, 심혈관계의 기형을 만드는 대
표적인 X 등급의 약물이다.
Clinical use
- Acne(여드름)
Pharmacokinetic data
- Half life: 10-20 hours
- Metabolism: hepatic
Pregnancy Category: X
Clinical use
- psoriasis(건선)
Pharmacokinetic data
- Half life: 49 hours
- Metabolism: hepatic
Pregnancy Category: X
(Women must avoid becoming pregnant for
at least 3 years after discontinuing acitretin)
Acitretin
Isotretinoin
임신 중 약물의 위험도
약물에 노출된 시기가 매우 중요하지만 또한 약물마다 태아에게 미치는 영향도 제
각각일 것이다. 미국 식약청 (FDA)에서는 약물을 임신 중에 사용할 경우 그 득과
실을 비교하여 A, B, C, D, X 의 5등급으로 분류하고 있다.

Category Description
1등급
(금기)
태아에 대한 위험성이 명확하여, 의학적으로 불가피한 경우 이외에는 반드시 임부에게 투여를 피해
야 하는 의약품
2등급
(주의)
태아에 위험성이 높을 것으로 예상되지만 임부에 대한 치료적 유익성이 위험성보다 더 높을 경
우 신중하게 투여 가능한 의약품
임부금기 의약품
임신 또는 임신하고 있을 가능성이 있는 환자에게 투여함으로써 태아에 대한 위험성이 높은 의약품
AcitretinIsotretinoin
임부에 대한 의약품 적정사용 정보집

• 미국 X 등급 : 임부에게 투여 금기임
• 호주 X 등급 : 이 약물은 태아에게 영구적 손상을 일으킬 위험이 매우 높으므로,
임부 또는 임신 가능성이 있는 여성에게는 투여하면 안된다.
• 일본 5 점 : 역학 조사 결과 기형을 일으키는 것이 명확하다. 또는 동물생식 독성
실험 결과, 사람에서도 기형을 일으킬 가능성이 매우 높다.

“선천성 이상 위험은 없으나 태아와 신생아에게 가역적 독성을 나타내는 경우가
있는데, 이러한 약물도 임신에 위험한 약물로 분류된다. 임신기간 중 투여된 위험
약물이 일으키는 선천성 이상 및 태아 독성 등 부작용 유발”
BG Katzung. Basic & Clinical Pharmacology, 11h Ed.
(Chapter 59. Special Aspects of Perinatal & Pediatric Pharmacology) 2009.
The McGraw-Hill Companies, Inc.

Chemical info
Marker 특징 비고
Etretinate
 피부과 영역에서 증식성 질환인 건선, 어린선, 여드름 치료6)
 특히 각질화, 세포증식 염증 및 면역조절에 효과6)
 임신 기간중 섭취시 선천적 결함을 유발7)
반감기 2개월
체내 완전 제거 2년
Acitretin
 Etretinate와 비슷한 효과로 Etretinate의 대사체 물질6)
 알콜섭취시 체내에서 재에스테르화 되어 Etretinate로 변환6)
 임신 기간중 섭취시 선천적 결함을 유발7)
반감기 2~4일
지방친화도가 적어
빠르게 제거
ATRA
Tretinoin /
All trans retinoic acid
 급성전골수성 백혈병 [acute promyelocytic leukemia] 치료
9-cisRA
alitretinoin
 카포시 육종 (kaposi’s sarcoma) 만성 손 습진(Chronic Hand
Eczema) 치료1-8)
 포도당 자극에 의한 인슐린 분비 (glucose-stimulated insulin
secretion) 조절1-3,6,9)
13-cisRA
Isotretinoin
 피부과 영역에서 증식성 질환인 건선 치료1-7)
 소아에서의 신경아세포종 [neuroblastoma] 치료1-7)
 임신 기간중 섭취 시 선천적 결함을 유발7)
Acitretin보다 체내
에서 빠르게 제거
체내 완전제거 2개
월

Summary
• Acitretin 및 Isotretinoin은 건선 및 여드름 치료제로 특히 청소년기 여성 및 가임기 여성에게
많이 처방되는 약제이다.
• Acitretin 및 Isotretinoin 임산부에게는 투여하지 말아야 하는 약물이며, 투여시 태아결손 및
기형 장애등 출산과 관련된 부작용이 있다.
• Acitretin 및 Isotretinoin의 반감기는 각각 49시간 및 6~36시간 정도이고 완전히 제거되기 위
해서는 2개월 정도 소요된다. 그러나 반감기 및 완전히 제거되는 시간은 사람마다 조금씩 다
를수 있으며 더 오래 남아있을수 있다는 보고가 있다.
• 또한, Acitretin의 경우 알콜을 섭취 할 경우 Etretinate로 Esterification 될 수 있으며 Etretinate
의 경우 훨씬 긴 반감기를 가진다.
• Retinoid제제를 사용한 임산부의 경우 위와 같은 이유로 출산에 대한 불안감이 커지며 복용
시기 및 복용 양만으로는 체내 농도를 정확히 예측하기 어렵다.
• 이에 체내 농도 분석 Data를 통해 정확한 수치를 활용하여 약물 상담에 활용한다.

A selective and sensitive detection of
multiple retinoids and acitretin in human serum with LC-MS/MS
Chemical info
Marker CAS No. Formula Mw (g/mol) T1/2 Purchase 용량/Price
Protein
binding
Etretinate 54350-48-0 C23H30O3 354.48 120 days USP 20mg/1,280,000 >99%
Acitretin 55079-83-9 C21H26O3 326.43 49 h
Sigma-Aldrich
/ USP
200mg/966,000 >99.9%
ATRA
Tretinoin /
302-79-4 C20H28O2 300.44 0.5-2 h
Sigma-Aldrich
/ USP
5x30mg/431,000 >95%
9-cisRA
alitretinoin
5300-03-8 C20H28O2 300.44 2-10 h Sigma 1mg/111,000
Highly bound,
no exact figure
available
13-cisRA
Isotretinoin
4759-48-2 C20H28O2 300.44 10-20 h
Sigma-Aldrich
/ USP
200mg/410,000 >99%
+
Internal
Standard

Instrument
Marker 장비 참고 논문 목표
Etretinate
LC-UV
Evaluation of the transfusion safety of blood products and
determination of plasma concentrations of acitretin and
etretinate in patients receiving transfusions (2008)
LC-MS/MS
통합분석
A fully validated HPLC method for the simultaneous
determination of acitretin and etretinate in plasma and its
application to a pharmacokinetic study in healthy Korean subjects
(2009)
Acitretin
Pregnancy outcome of women transfused during pregnancy with
blood products inadvertently obtained from donors treated with
acitretin (2009)
Acitretin-contaminated blood products and pregnancy (2009)
ATRA
Tretinoin /
LC-
MS/MS
A sensitive and specifi c method for measurement of
multiple retinoids in human serum with UHPLC-MS/MS (2012)
Validation of a Liquid Chromatography-Electrospray
Ionization-Tandem Mass Spectrometry Method for
Determination of All-Trans Retinoic Acid in Human Plasma
and Its Application to a Bioequivalence Study (2014)9-cisRA
alitretinoin High Throughput LC-MS/MS Method for Simultaneous Estimation
of 9-Cis-Retinoic Acid and its Metabolite 4-Oxo-9-Cis-Retinoic Acid
in Human Plasma and its Application to a Bioequivalence Study
(2015)
13-cisRA
Isotretinoin
DETERMINATION AND OCCURRENCE OF RETINOIC ACIDS AND
THEIR 4-OXO METABOLITES IN LIAODONG BAY, CHINA, AND ITS
ADJACENT RIVERS (2010)

Instrument
LC System Agilent 1290 UHPLC ACQUITY UPLC H-Class system
Column ACQUITY BEH C18 1.7㎛ (2.1X50mm) 검토
Mobile Phase
(Isocratic/Gradient)
40:60 A/B
분석법 개발
Mobile Phase A 5mM Ammonium Acetate
Mobile Phase B 0.1% Formic acid in DW
Injection Volume 10㎕
Column Temperature 40℃
Weak Needle Wash 50:50 methanol/water (600 μL)
Strong Needle Wash 50:50 methanol/water (600 μL)
Seal Wash 10:90 acetonitrile/water
Flow Rate 0.2 ml/min
 LC condition : Liquid chromatography 조건
MS System TQD 현 장비 사용
Ionization Mode Positive Electrospray 검토
Source Temperature 150 °C
분석법 개발
Desolvation Temperature 350 °C
Desolvation Gas Flow: 800 L/Hr
Cone Gas Flow 30 L/Hr
Collision Gas Flow 0.20 mL/Min
Data Management MassLynx™ v4.1
 MS/MS condition : Mass spectrometry 조건
Compound MRM Cone (V) CID (eV)
Etretinate 353.5>???.? 분석법 개발 분석법 개발
Acitretin 325.2>266.2 분석법 개발 분석법 개발
13-cisRA 299.2>118.9 분석법 개발 분석법 개발
 MRM Transition and LC/MS/MS parameter : Multiple Reaction Monitoring (MRM) 조건

Method
 Sample Preparation 개발
1) 추출용매 및 용량 (추출 Rack 및 Tube)
2) IS 분주 방법 및 용량
3) 추출 및 Incubator 조건 (00min, 0000rpm)
4) 건조 조건 및 방법 (00℃, 00min)
5) 재용해 용매 조건 설정 (Mobile phase 등)
6) 그 외 Filter 및 SPE (Solid Phase Extraction)
사용 조건
 분석법 검증
PPTProtein Precipitation
LLELiquid/Liquid Extraction
Plasma 200ul + MeOH 200ul+ Acetic acid 20ul
(Include IS)
Chloroform 500ul
Centrifuge for 1min
Upper solution transfer (400ul)
Dty for 15min
Reconstitution (MeOH 100ul)
MS analysis
VortexVortex
Vortex

Option
Chemical
Etretinate
Acitretin
ATRA
Tretinoin /
9-cisRA
alitretinoin
13-cisRA
Isotretinoin
+α
oxo대사체류
Chemical
Etretinate
Acitretin
ATRA
Tretinoin /
9-cisRA
alitretinoin
13-cisRA
Isotretinoin
Chemical
Etretinate
Acitretin
13-cisRA
Isotretinoin
Chemical
Acitretin
13-cisRA
Isotretinoin
분석법 절차 분석 시간 분석 비용

Summary
1. 분석법 검토 – 현재 장비로 분석 가능성 검토
• 분석논문 검토
• 추출법 및 장비 설정 검토
2. 분석 물질 선정
• 분석물질 선정
• Internal standard 선정
3. 분석법 개발
• 추출법 검토 및 개발
• 분석 장비 조건 검토 및 개발
4. 분석법 검증
• 선택성 (selectivity)
• 생체시료 효과 (Matrix effect)
• 캐리오버 (CarryOver)
• 최저 정량한계 (lower limit of quantification, LLOQ)
• 검량선(calibration curve)
• 정확성(accuracy)
• 정밀성(precision)
• 회수율(recovery)
5. 연구 활용

Determination of Isotretinoin
and Acitretin in Pregnancy

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