BiPday 2014 -- Tulipano Angelica
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This document summarizes an ncRNA analysis pipeline called nc-aReNA. It describes how nc-aReNA can be used to classify and analyze small non-coding RNAs from deep RNA sequencing data. The pipeline performs tasks such as adapter removal, quality control checks, mapping reads to reference databases to identify known ncRNA classes, filtering of rRNA sequences, quantification of ncRNA expression, differential expression analysis, and identification of isomiRs. Two test cases demonstrating ncRNA classification and differential expression analysis using nc-aReNA on mouse datasets are also described.
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- 1. CNR – Istituto di Tecnologie Biomediche di Bari nc-aReNA: an integrated resource for small non-coding RNA functional annotation Angelica Tulipano
- 2. Small non-coding RNAs (sncRNAs) serve as regulatory molecules in a number of different organisms MicroRNA (miRNA): post-transcriptional regulatory genes PIWI-interacting RNA (piRNA): germline transposon silencing Small interfering RNA (siRNA): active molecules in RNA interference Small nuclear RNA (snRNA): includes spliceosomal RNAs. Small nucleolar RNA (snoRNA): involved in rRNA modification Long non-coding RNA (lncRNA): little is known about them, involved in mRNA regulation The RNA World BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 3. To address these questions, new systematic gene-discovery approaches need to be developed that are specifically aiming at the ncRNA discovery High-Throughput Sequencing technologies enable such a research The new spectrum of NGS applications together with the massive amount of data requires focused investments and development of bioinformatics tools managing and analysing such complex and large datasets to infer biological meaning. Why non-coding RNA? • How many ncRNA genes are there? • How important are they? • Which functions does a cell delegate to RNA instead of protein and why? BiP-Day, 19 Dicembre 2014 The RNA World
- 4. Identification and classification of reads in known functional ncRNA classes and dataset export Identification and filtering of reads mapping to ribosomal RNAs and mtDNA transcripts Quantification of ncRNA expression and differential expression analysis Graphical visualization of sample expression profiles in different conditions and at different time courses Creation of a collection of unclassified reads, useful for the prediction of novel ncRNAs A bioinformatics pipeline to classify and analyze small non-coding RNAs (sncRNAs) in deep RNA sequencing BiP-Day, 19 Dicembre 2014 The ITB nc-aReNA Platform
- 5. Differential expression Bioinformatics workflow for ncRNA analyses BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Raw Sequencing Data Adapter & Barcode identification and removal Size filtering & General Statistics Cleaned Sequence Data (fastq, fasta) Reads Mapping data-warehouse Quality control check isomiR identification
- 6. Sequence Processing: Adapter & Barcode identification and removal detect barcode sequence and separate multiplexed experiments trim barcode and 3’-adapter fragment 3’ adapter ~20 bases barcode (if multiplexed) 4-6 bases small RNA 18-30 bases 5’ adapter BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 7. Sequence Processing BiP-Day, 19 Dicembre 2014 QC check and general statistics FastQC: A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projec ts/fastqc/ by S. Andrews
- 8. Reads Mapping: BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Bowtie Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol 10:R25. Mapping on ncRNADB reference Mapping on reference genome unmapped mapped annotated not annotated unmappedmapped classified ncRNA classified ncRNA Export cleaned sequences data-warehouse miRNA precursors isomiR identification
- 9. Ribosomal RNAs ncRNAs Reference database redundancy identification & removal GENCODE Data Sources The ncRNA Reference Database BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 10. Reference database contains several classes of ncRNAs Some reads map to more than one reference sequence in different classes Software dealing with multiple mapping: RSEM BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Li and Dewey, RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome BMC Bioinformatics 2011, 12:323 Multiple mapping: Multireads Example of multimapping: processed_transcript | miRNA_primary_transcript lincRNA | miRNA_primary_transcript antisense | miRNA_primary_transcript lncRNA | miRNA_primary_transcript rRNA | piRNA rRNA | lincRNA lincRNA | snoRNA snoRNA | piRNA
- 11. IsomiRs IsomiRs are defined as variations (isoforms) of a mature microRNA These variants were originally dismissed as experimental artifacts IsomiRs have demonstrated to be actively associated with the RISC and the mRNA translation machinery IsomiRs are real physiological miRNA variants BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 12. IsomiR Variants “Incorrect” or alternative Dicer cleavage: length variations RNA editing: nucleotide additions, sequence variants BiP-Day, 19 Dicembre 2014 AGCGACAGCUGGCUACUGGGU AGCUACAUCUGGCUACUGGGU GCGACAUCUGGCUACUGGGU AAGCGACAUCUGGCUACUGGGU GCAGCGACAUCUGGCUACUGGGU AGCGACAUCUGGCUACUGGG AGCGACAUCUGGCUACUGGGUU AGCGACAUCUGGCUACUGGGUCU AGCGACAUCUGGCUACUGGGU Polymorphic IsomiRs AAUCAGCAGCGACAUCUGGCUACUGGGUCUCUGAU 3’ IsomiRs 5’ IsomiRs Canonical miRNA Pre-miR sequence Mature miRNA-sequence
- 13. IsomiR identification: isomiRID de Oliveira LF, Christoff AP, Margis R. isomiRID: a framework to identify microRNA isoforms, Bioinformatics. 2013 Oct 15;29(20):2521-3 BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 14. Differential expression analysis Comparison of ncRNA counts in different experimental conditions: - sample vs. control - time course samples Statistical test: - Fisher test (no biological replicates) - T-test or Wilcoxon test (with biological replicates) BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 15. nc-aReNA pipeline design BiP-Day, 19 Dicembre 2014
- 16. Test Case 1: ncRNA classification BiP-Day, 19 Dicembre 2014 rRNA 47.1% miRNA_primary_transcript 46.2% piRNA 2.9% tRNA 2.3% snoRNA 0.7% lncRNA 0.2% lincRNA 0.2% ncRNA counts categories
- 17. Test Case 2: DE analysis BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Characterization of miRNA expression profiles in Mus musculus time course dataset
- 18. Test Case 2 BiP-Day, 19 Dicembre 2014 data-warehouse Gene Ontology ncRNA expression profile BioinformaticsAnalyses small RNA-Seq TarBase Characterization of miRNAs expression profiles in Mus musculus time course dataset Metadata •Mus musculus •Muscle & Skin •T0: Mock •T1: 3 hrs •T2: 24 hrs
- 19. ncRNA research activities BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Immune response in mouse Plant – Viroid interactions in peach tree, grapevine and tobacco Multidrug resistence in dog cell lines miRNA driven methylation profile in Arabidopsis miRNAs expression profile in Amyotrophic Lateral Sclerosis and interaction with biomarkers of clinical feature Collaborations CNR – IVV, Bari • Francesco Di Serio • Beatriz Navarro • Livia Stavolone • Fabrizio Cillo University of Bari Dept. of Pharmacy • Nicola Colabufo • Antonio Carrieri CSIC – UPV, Valencia, Spain • Ricardo Flores Work in progress: Web portal Statistical analysis of isomiR variants Prediction of novel miRNA
- 20. The Team BiP-Day, 19 Dicembre 2014 Consiglio Arianna De Caro Giorgio D’Elia Domenica Gisel Andreas Grillo Giorgio Licciulli Flavio Liuni Sabino Losito Nicola Tulipano Angelica
- 21. Thanks for your attention! BiP-Day, 19 Dicembre 2014
Editor's Notes
- Abbiamo sviluppato nc-arena, una piattaforma integrata per l’analisi e l’annotazione funzionale di small-ncRNA provenienti da dati di sequenziamento NGS
- E’ ormai noto come la complessità biologica sia correlata con la percentuale di genoma che non è protein-coding: nel caso dei mammiferi solo il 2% del genoma codifica per RNA messaggero, la maggior parte è trascritta come long e short non coding RNA, molecole funzionali che risultano regolatori chiave in numerosi processi cellulari. I ncRNA sono classificati in molte differenti categorie a seconda della loro attività funzionale, ad esempio silenziamento genico trascrizionale e post-trascrizionale, disgenesi degli ibridi, inattivazione del cromosoma X.
- Tuttavia sono molte le questioni ancora aperte sul mondo ncRNA: Quanti tipi di ncRNA ci sono? Che importanza hanno? Quali funzioni vengono delegate a loro da una cellula, anzichè ad una proteina? Per dare delle risposte adeguate a queste domande è necessario sviluppare approcci di gene discovery finalizzati alla scoperta e allo studio del ncRNA. Le tecnologie NGS rendono possibile una tale ricerca. L’ampio spettro di applicazioni che esse hanno, insieme all’enorme quantità di dati che producono, rendono necessari sforzi e investimenti per lo sviluppo di tools bionformatici per la gestione e l’analisi di tali dataset per ottenerne nuova conoscenza biologica. (In the figure: X-chromosome inactivation (XCI) in mammals relies on XIST, a long noncoding transcript that coats and silences the X chromosome in cis)
- ncaReNA è una piattaforma bioinformatica che include una serie di pipeline e strumenti per la: Identificazione e classificazione di reads in classi funzionali di ncRNA, con la possibilità di esportare i dati L’individuazione di reads che mappano su RNA ribosomiale e trascritti di DNA mitocondriale La quantificazione dell’espressione del ncRNA e l’analisi di espressione differenziale La visualizzazione grafica dei profili di espressioni dei vari campioni in differenti condizioni o a differenti tempi La creazione del set di reads nn classificate che possono essere utilizzate per la predizione di nuovi ncRNA
- Questo è lo schema generale del workflow di ncaReNA: i dati grezzi di sequenziamento passano attraverso un primo step di processing delle sequenze, un secondo step di mappaggio e annotazione funzionale delle sequenze e poi altre funzionalità come l’analisi di espressione differenziale e l’identificazione di isomir. Tutti i dataset risultanti da tali passi sono raccolti in un datawarehouse locale da cui possono essere esportati dall’utente
- La prima fase di reads processing prevede la ricerca e la rimozione del frammento di adattatore 3’ nelle reads; in caso di sequenziamento di esperimenti multipli, essi si differenziano per il frammento di barcode nella read: in tal caso si cercano i diversi barcode per separare gli esperimenti e viene fatto il trimming del frammento
- Le reads così processate vengono analizzate da un tool per il controllo di qualità, FASTQC. Con esso l’utente ottiene grafici relativi alla qualità delle sequenze (come la distribuzione dl quality score per base) e a utili statistiche, come la distribuzione delle lunghezze delle reads
- La seconda fase di mapping consiste nel mapping tramite l’algoritmo bowtie. Dapprima le reads sono mappate su un reference database di ncRNA. Le sequenze che mappano danno quindi la classificazione nelle diverse categorie di ncRNA. Tra queste vengono selezionate in particolare I precursori di miRNA per l’identificazione di isomer. Le reads che non mappano sulla reference nc vengono mappate sul genoma di riferimento dell’organism.. Le reads che mappano sul genoma sono divise in reads annotate, che quindi vanno ad aggiungersi ai ncRNA individuate nella prima fase,, e in reads non annotate. Queste possono rappresentare potenziali nuovi ncRNA da ricercare mediante algoritmi di predizione come mirdeep. Le reads che non mappano neanche sul genoma possono rappresentare artefatti o contaminazioni e con un assembly potrebbero dare infomazioni in merito. Tutti I risultati del mapping sono raccolti nel dw e possono essere esportati dlal’utente per ulteriori analisi. Al momento sono inclusi genomi di uomo, mouse e arabidopsis., mentre nel reference non coding db vi sono anche altre specie, dato che I due processi di mapping sono indipendenti
- Il database di riferimento dei ncRNA creato appositamente per la piattaforma raccoglie tutte le informazioni dai maggiori database per il mappaggio e l’annotazione dei ncRNA, assicurando così una completezza di informazioni. La ridondanza dei dati relativi alla stessa classe provenienti da differenti sorgenti è eliminata utilizzando cross-link e identità di sequenza
- Il database di riferimento nncoding contine diverse classi di ncRNA e si osserva che frequentemente una stessa reads può mappare su diverse classi e quindi essere classificata in maniera nn univoca. Il problema del multimapping in letteratura viene spesso non considerato, scartando a priori tali reads. Noi abbiamo implementato nella piattaforma RSEM, un software adatto a trattare il multiple mapping: utilizzando l’output del mapping corregge il conteggio degli allineamenti con un metodo probabilistico probabilistico, usando metodi bayesiani
- Sulla piattaforma ncarena è stata aggiunta inoltre la possibilità per l’utente di individuare e annotare gli isomir. Queste sono variazioni (isoforme) di un maturo miRNA.
- Vi sono due tipi principali di varianti isomir, dovute a un errato o alternativo taglio da parte del Dicer o d RNA editing. La classificazione degli isomir si basa su tre principali categorie: 5′, 3′ e polymorphic isomiRs
- Il software che abbiamo implementato nella piattaforma per la ricerca delle isoforme è isomiRID. Esso prende come input le reads annotate come precursori di miRNA e ne fornisce gli eventuali isomir trovati con le relative frequenze.
- Se l’utente ha differenti dataset la piattaforma dà la possibilità di effettuare l’analisi di espressione differenziale confrontando i conteggi dei ncRNA nelle differenti condizioni sperimentali: campione vs controllo, differenti tempi. l’utente può scegliere tra due tipi di test statistici, a seconda che vi siano o meno repliche biologiche.
- Questo è il design del processing della pipeline. Il processo è stato disegnato e implementato utilizzando pentaho data integration tool (pdi), che ha la caratteristica di essere modulare e quindi facilemente modificabile.
- Abbiamo testato la pattaforma su dataset disponibili su banche dati pubbliche. Questo ad esempio è il risultato della classificazione dei ncrna nelle diverse categorie con relativi grafici.
- Abbiamo anche testato la piattaforma su dei dati di Mus Musculus da piattaforma Illumina per la caratterizzazione dei profile di espressione di miRNA a 3 differenti tempi. Questa è la visualizzaizone grafica dei risultati dell’analisi di espressione differenziale. Attraverso questa interfaccia grafica l’utente può navigare attraverso risultati e l’annotazione degli smallRNA.
- L’annotazione funzionale dei risultati di espressione differenziale è stata ottenuta attraverso l’integrazione nel datawerhouse di GO, Sequence Ontology e Pathway database e microRna target interaction databases
- Stiamo lavorando allo siluppo del portale web per rendere accessibile pubblicamente il sistema. http://ncarena.ba.itb.cnr.it Inoltre stiamo implementando anche la possibilità di effettuare l’analisi statistica degli isomir e vogliamo implementare mirdeep come algoritmo per la predizione dei novel miRNA. Con la piattaforma abbiamo già analizzato dati di sequenziamento nell’ambito di alcune collaborazioni, su umano, topo e anche piante, ottimizzandone in questa maniera funzionalità e caratteristiche.
- La realizzazione della piattaforma è frutto del lavoro di tutto il gruppo di biornformatica dell’itb.