2. 10
českoslovENSKÁ s0CIALISTICKÁ REPUBLIKA
PATENTNÍ SPIS č. 100521
Právo k využití vynálezu přísluší státu podle 3 odst. 6 zák. . 34/1957 Sb.
JINDŘICH CHROMÍK, DOLNÍ MĚCHOLUPY u Prahy a inŽ. IRENA
NEUWIRTHOVÁ, PRAHA .
Způsob výroby krystalických proteolytických enzymů chymotrypsinogenu,
chymotrypsinu a trypsinu
Přihlášeno 21. prosince 1959 (PV 7441-59) Platnost patentu od 21. prosince 1959
Vynález se týká zdokonalení způsobu výroby krystalických proteolytických enzymů
chymotrypsinogenu, chymotrysinu a trypsinu z pankreatu kyselou extrakcí a vysolováním souhrnu
zymogenů.
Těchto enzymů, buď jednotlivě, nebo ve směsi, se používá v lékařství, např. ve formě
zásypu při léčení nekrotických a hnísavých pro- cesů nebo ve formě olejové suspense při
akutních zánětlivých procesech všeho druhu.
Při dosavadních způsobech výroby proteolytických enzymů v amorfní nebo krystalické formě se
extrahovala rozmělněná tkáň pankreatu zředěnými roztoky kyselin, např. sírové, fosforečné nebo solné
za snížené teploty, nejčastěji kolem C, nejvýše však do 15° C.
Z různých dílčích operací prováděných za uvedených teplotních podmínek zejména filtrace trvá
velmi dlouho, jelikož balastní látky jsou obtížně a nedokonale filtrovatelné. Při dlouhém průběhu filtrace
hrozí nebezpečí předčasné aktivace zymogenů, čímž je ohrožen zdárný vý
sledek výroby, neboť potom nelze enzymy v krystalické formě získat
vůbec nebo jen ve velmi nízkém výtěžku. Při zdlouhavé a nedokonalé filtraci zůstává ve
sraženině balastů zadrženo značné množství enzymů, tím se zvyšují ztráty, výtěžky jsou
kolísavé, ovlivněné jemností sraženiny balastů, jež zadržuje někdy více, někdy méně roztoku. V
odstředivkách běžných typů není možno roztok od sraženiny oddělit. · -

4. ·
2 100521
Při dosavadním výrobním postupu je nutné rozsáhlé a nákladné
. chladicí zařízení, které vyžaduje odbornou obsluhu a údržbu.
Všeobecně je základním předpokladem vysokých výtěžků a dobré kvality při výrobě
krystalických proteolytických enzymů co nejúplnější extrakce proenzymů, tj.
chymotrypsinogenu a trypsinogenu, bez jejich předčasné aktivace a pokud možno s
minimálním obsahem balastů.
Dosavadními výrobními postupy nebylo možno tyto předpoklady splnit. Podařilo se to však
způsobem výroby krystalických proteolytických enzymů chymotrypsinogenu, . chymotrypsinu a
trypsinu kyselou extrakcí pankreatu zředěnými kyselinami, zejména kyselinou sírovou, a
vysolováním souhrnu zymogenů rozpustnými anorganickými solemi, zejména síranem
amonným, podle vynálezu. Podstata tohoto způsobu spočívá v tom, že se kyselá extrakce
pankreatu provádí při teplotě 1535° C, načež se extrakt zalkalisuje na pH ,5,0 a potom ihned
okyselí na pH 2,5,0, čímž se vyloučí balasty. Ty se potom oddělí a z filtrátu se známým
způsobem přídavkem rozpustných anorganických solí vyloučí souhrn zymogenů, ze kterého se
dalším rozpouštěním a srážením získá chymotrypsinogen a z filtrátu po jeho izolaci trypsin.
Způsobem, který popsali R. W. Bates a A. Koch (J. Biol. Chem. 111, 197, 1935), se získává
trypsinogen z pankreatu suspendovaného ve vodě nejdříve při pH 1,8 a při teplotě 37° C a
potom při pH , ovšem podle novějších poznatků jde o panreatin a nelze takto vyrábět krystalické
enzymy v průmyšlovém měřítku. Střídavou úpravu pH z kyselé oblasti do alkalické a zpět do
kyselé popisuje J. H. Northrop se sp.
(Crystalline Enzymes, 1948, str. 99) při čištění chymotrypsinu (pH 5)
a trypsinu (pH ,0,5.
Největší výhodou způsobu výroby podle vynálezu je práce za teploty 1535° C, která nevyžaduje
chladicí zařízení, potom úprava kyselé reakce extraktu do alkalické a potom ihned opět do kyselé,
přičemž se balastní látky stávají lépe filtrovatelnými, filtrace se tím zrychlí a sníží se nebezpečí nežádoucí
předčasné aktivace zymogenů. Možností rychlejšího a dokonalejšího odfiltrování balastů se také snižuje
obsah enzymů, dříve v nich zadržovaný, což se projevuje zvýšením a konstantností výtěžků a dále
usnadněním krystalizace. -
Příklad 1: 100 kg konservovaného mrazeného pankreatu se roze
mele, suspenduje ve 200 1 ,25 n kyseliny sírové a extrahuje za míchání 1218 hodin při teplotě
nepřevyšující 35° C, 1 hodinu před ukončením extrakce se přidá pevný síran amonný (na 1 l
kyseliny až do nasyčení ,25 m) nebo jiná a extrahuje se za míchání další 1 hodinu.
Pankreatická se odstraní a znovu extrahuje 100 l zředěné kyseliny sírové. Spojené extrakty se
zalkalisují amoniakem na pH ,5,0 a ihned
okyselí . (nejlépe opět kyselinou sírovou) na pH 2,5,0. Vyloučené
balasty se odstraní (filtrací, odstředěním, čirý filtrát se vysolí síranem amonným do
nasyçení ,75 m a získaná sraženina zymogenů, dobře zbavená matečných louhů, se

5. rozpustí ve vodě (v poměru 170 ml vody na 100 g sraženiny), přidá se nasycený roztok
síranu amonného. [57,5 ml na 100 g sraženiny) nebo jiné spli, které bylo použitę při
extrakci, a zfiltruje se. filtrát se, vysolí přídavkem síranu amonného (240 g/l). Sraženina
se odsaje, rozpustí ve vodě, přidá se nasycený roztok soli použité v předešlých
operacích v takovém množství, až se objeví
první zákal, pH se upravína 5 a vše se nechá stát při teplotě místnosti
(1525° C) 2 dny. Vyloučený krystalický chymotrypsinogen se odsaje,
Filtrát po první krystalizaci chymotrypsinogenu se po úpravě.
pH
překrystaluje do požadované čistoty a zpracuje odděleně na chymotrypsin. . . . . . .: : · ·
- -

7. 100
3 100521
na 3,0 vysolí pevným síranem amonným v poměru 30,4 g na 100 ml roztoku. Vyloučená
sraženina se po odsátí, rozpustí ve vodě, přidá se
malé množství trypsinu a roztok glukonátu vápenatého a pH se upraví
na ,0. Roztok se nechá aktivovat v lednici při teplotě C, nejvýhodněji 5 dnů. Pak se pH upraví na
,0,5 a přídavkem síranu amonného se vysolí sraženina, která se po odsátí a rozpuštění ve vodě
znovu vysráží nasyceným roztokem síranu amonného. Sraženina se po výměně amonných
iontů za hořečnaté rozpustí v borátovém ústoji v poměru 11 za chladu. Po rozpuštění se přidá
stejný objem hořečnatého
, ústroje, zaočkuje se trypsinem a nechá se vykrystalovat trypsin. ·
Příklad 2: Sraženina zymogenů, získaná podle příkladu 1, se rozpustí ve vodě (100 g ve 170 ml),
přidá se 57,5 ml nasyceného roztoku soli použité při srážení a po filtraci se filtrát vysolí přídavkem
pevného síranu amonného (240 g/l). Sraženina se rozpustí ve vodě, přidá se malé množství trypsinu,
roztok glukonátu vápenatého a po úpravě pH na ,0 se nechá aktivovat v lednici 5 dnů při teplotě C.
Roztok po aktivaci, úpravě pH na hodnotu ,0,5 a filtraci se vysolí síranem amonným (450 g/l, zfiltruje se a
sraženina se po rozpuštění ve vodě znovu vyloučí přídavkem nasyceného roztoku síranu amonného,
odfiltruje se a vysuší. Získá se směs amorfní formy chymotrypsinu a trypsinu, s vysokou aktivitou, která
se lyofilisací převede do konečnéformy.
Předmět patentu
Způsob výroby krystalických proteolytických enzymů chymotrypsinogenu, chymotrypsinu a
trypsinu z pankreatu kyselou extrakcí, zejména kyselinou sírovou, a vysolováním souhrnu
zymogenů, z filtrátu, zbývajícího po oddělení balastů, vyznačující se tím, že kyselá extrakce
pankreatu se provádí při teplotě 1535° C a získaný extrakt se zalkalizuje na pH ,1,0, načež se
ihned provede vyloučení balastů okyselením extraktu na pH 2,5,0.