Pine bark extract experiment on breast cancer in Turkish

1. ÜNÜ
2209
ÜNİVERSİTE ÖĞRENCİLERİ YURT İÇİ / YURT DIŞI ARAŞTIRMA
PROJELERİ DESTEKLEME PROGRAMI
SONUÇ RAPORU
PROJE BAŞLIĞI: Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus
brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen Etkisinin
İncelenmesi
PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI: Mehmet KİRAZLAR
DANIŞMANININ ADI: Prof. Dr. Sevinç İNAN

2. GENEL BİLGİLER
PROJENİN KONUSU
Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus
brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen
Etkisinin İncelenmesi
PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI
Mehmet Kirazlar
DANIŞMANIN ADI
Prof. Dr. Sevinç İNAN
PROJE BAŞLANGIÇ VE BİTİŞ
TARİHLERİ
Eylül 2013 – Eylül 2014
Sonuç Raporu Formatı:
1. Giriş
Proje konusu hakkında kısa bilgi
2. Rapor dönemlerinde yapılan çalışmalar
I. Dönem...
II. Dönem...
3. Sonuç:
4. Çıktılar [Yayınlar, sunumlar v.b.]
PROJE
YÜRÜTÜCÜSÜNÜN
ADI – SOYADI - İMZA
DANIŞMANIN
ADI – SOYADI - İMZA
Tarih
Mehmet KİRAZLAR Prof. Dr. Sevinç İNAN

3. 1.GİRİŞ
Meme kanseri tüm kadınlarda, özellikle endüstriyel ülkelerdeki kadınlarda çok
sık görülen kanser türüdür (Charles et al., 1995). Heterojen ve karmaşık yapıda bir
kanser türü olup genetik, diyet ve çevresel faktörlerin etkisi altında kalabilmektedir
(Russo and Russo 2000). Kadınlarda görülme olasılığı en yüksek kanser
sıralamasındadır. Histolojik olarak meme karsinomlar in situ ve invaziv karsinomlar
olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. İn situ karsinomda malign epitelyal hücreler
bazal membranla çevrili duktus ve asinuslar içinde sınırlı iken, invaziv karsinomda
neoplastik hücreler bazal membranı aşarak stromaya invazyon göstermektedir. Bu
nedenle invaziv karsinomlar, lenfatik ve kan damarlarını invaze ederek bölgesel lenf
düğümlerine ve uzak organlara metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir (İlhan ve
ark., 2006). Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) östrojen reseptör negatif olması
nedeni ile MDA-MB 231 ile karşılaştırıldığında dana az malign olan bir hücre dizinidir.
Bu iki dizin hücre meme kanseri araştırmalarının büyük çoğunluğunda kullanılan dizin
hücre hatlarıdır (Lacroix et al., 2006). MDA-MB 231 invaziv bir adenokarsinom olup
meme kanseri olup östrojen negatif bir hücre hattıdır (Brinkley et al., 1980).
Pinus familyasının genel farmakolojik özelliklerinin antiinflamatuar (Rohdewald
P. 2002), antioksidan (Guri et al., 2006), antineoplastik (Vuorela S. 2005) ve immuno-
modulatör (Li et al., 2007) olduğu bilinmektedir. Bu özellikleri Pinus familyasının
siklooksijenaz aktivitesi, prostoglandin E2 (PGE2) üretimi (Karonen et al., 2004),
nitrik oksit sentaz (NOS) aktivitesi (Virgili F. 1998) ve kanser (Li et al., 2007) ile
ilişkilerini değerlendirme çalışmalarına önem kazandırmıştır. Pinus cinsinin
Türkiye’deki en önemli türlerinden olan kızılçam (Pinus brutia Ten, Syn.: Pinus
pityusa Stev.) Sylvestris alt seksiyonuna ait diploxylon çam türüdür. Bu çam türü
Doğu Akdeniz bölgesinin bir türü olup dünyada Türkiye’de akdeniz iklimi hakim olan
bölgelerde geniş yayılım göstermektedir (Kasaplıgil B 1999). Kızılçam bitkisinin
uçucu ekstraksiyonlarının gaz kromatografisi ve kütle spektometresi ile analizinde
422 ayrı etken içerdiği anlaşılmıştır (Mateus et al., 2010). Kızılçam 15-20 metre
boylarında kalın dallı bir ağaçtır. Genç sürgünleri kalın ve kızıl renktedir. Hızlı
büyüme siklusu ile ürün eldesi açısından verimli bir türdür. Kuraklığa dayanıklı olup
ılık hava yaşam şartları ortamı genel aurasıdır. Genellikle sahil kesimlerinde yayılış
yapmasına rağmen 1200 m yükseltilere değin çıkabilmektedir. Kızılçam Türkiye
orman envanterlerine göre 5,4 milyon hektar alanı ile ülkemizde en geniş yayılış

4. alanına sahip türlerin başında gelmektedir. Toplam ormanlık alanın %15 kızılçam
ormanları ile kaplıdır (Sarıbaş ve Ekici 2004). Kızılçam Türkiye’de ağaçlandırmalarda
en yaygın olarak kullanılan türdür. Türkiye’de yapılan ağaçlandırmalarda kızılçamın
payı %40 a yaklaşmaktadır. Kızılçamın ağaçlandırma potansiyelinin yüksek olması
genetik ıslah çalışmalarının daha düşük maliyetle gerçekleştirilmesi açısından önemli
bir özelliktir (Usta 1991).
Kızılçam kabuğu ekstraktının, insan sağlığı açısından çok değerli polifenol
maddeleri içermektedir. Bu maddelerin başında oligomerik proantosiyanidin (OPC)
denilen çok değerli bir polifenol gelmektedir. OPC veya fenoller, ilk olarak üzüm
tohumundan ya da çam kabuğundan izole edilmiş ve ayrıca yeşil çay, üzüm, soğan,
bezelye ve maydanozda da bulunur. OPC, farmakolojik olarak tanen denen
flavonoid’lere yakın karmaşık polifenol bileşikleri olarak sınıflandırılmıştır. OPC
şimdiye kadar kılcal damar stabilitesi ve lenfatik drenajı pekiştirmek için kullanılmıştır.
OPC, güçlü antioksidandırlar ve damar koruyucu etkilidir (Çetin ve ark 2013). OPC,
lipooksigenaz ve siklooksigenazı inhibe eder (Cretu et al., 2013) ve bu da kanserin
engellenmesinde faydalı olması muhtemeldir. Yapılan bir çalışmada, OPC'nin prostat
kanserinde kemoterapi etkisi ile önemli bir ajan olduğu bildirilmiştir (Neuwirt et al.,
2008). Kızılçam kabuk ekstratından polifenollerin yanında tanen ve lignin eldesi de
mümkündür. Lignin hücre membran yapısında dayanıklılığı artırdığı gösterilmiştir
(Lebo et al., 2001). Kabuğun en önemli bileşenlerinden biri tanenlerdir. Tanenler çok
eski zamanlardan beri bilinen ve dericilikte sepi maddesi olarak kullanılan
makromolekül bileşiklerdir. Hayvan derisindeki proteinler ile etkileşime sokulan
tanenler derideki proteini çöktürerek derinin bozulmayan, esnek ve bakteri etkilerine
karşı stabil hale getirilmesini sağlamaktadır. Ayrıca geleneksel olarak yerel halkın
ihtiyaçları için bitkisel ilaçlarda; antiviral, antimikrobiyal ve antikansorejen etkileri
nedeni ile tıpta ve farmakolojide doğal hammadde olarak bitki tanenleri
kullanılmaktadır (Kwak et al., 2006, Scalbert 1991).
Son yıllarda doğal koruyucu maddeler arasında çevreye zararlı etkileri
bulunmayan bitkisel ekstraktlar içinde tanenler önemli yer tutmaktadır. Çalışmamızda
kızılçam kabuk ekstratı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve 0.001 mg/ml dilüsyonlarında toksik
etkisi MDA-MB231 meme kanseri dizin hücrelerinde sitotoksisite ve hücre ölümü
(apoptozis) açısından değerlendirildi.

5. 2. RAPOR DÖNEMLERİNDE YAPILAN ÇALIŞMALAR
I. DÖNEM:
Proje kabul edildikten sonra deneyde kullanılacak olan malzemelerin temini ve
laboratuar ortamı sağlandı.
Bitkisel materyal:
Bu çalışmada Balıkesir Kale Naturel Ltd Şti.’nden temin edilen Pinus brutia kabuk
ekstratı kullanıldı.
Hücre kültürü:
Çalışmamızda Celal Bayar Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim
dalı öğretim üyesi Prof.Dr. M.İbrahim Tuğlu’dan temin edilen MDA-MB 231 hücre
dizini kullanıldı. Hücrelerin çoğalması ve konfluent olmasını sağlamak için %1
penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10 fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI-
1640 ile kültür ortamına bırakılarak 370
C sıcaklıkta, yaklaşık % 60–80 nem orana
sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür mediumları değiştirildi.
Çoğaltılan hücrelerin bir kısmı çalışmada kullanılmak üzere %10 dimetil sülfoksit
(DMSO) içeren kültür mediumunda -800
C’ de dondurularak saklandı.
MDA-MB 231 hücrelerinin inverted
ikroskop görüntüsü. X100.
MDA-MB 231 hücrelerinin inverted
mikroskop görüntüsü. X400.

6. II. DÖNEM
Dondurularak saklanan hücreler dondurucudan çıkarılarak uygun koşullarda
yaşatıldı. Kızılçam kabuk ekstraktı farklı dozlarda hazırlanarak MDA-MB 231 meme
kanseri hücrelerine uygulandı ve ekstraktın sitotoksik etkisi MTT ve TUNEL
yöntemleri ile değerlendirildi.
Hücrelerin çoğaltılması:
Hücreler dondurucudan çıkarılarak %1 penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10
fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI-1640 ile kültür ortamında, 370
C sıcaklıkta,
yaklaşık % 60–80 nem orana sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür
mediumları değiştirildi.
Sitotoksisite testi:
Hücreler çoğaltıkdıktan sonra MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide) sitotoksisite testi yapıldı. Bunun için hücreler 96
kuyucuklu kültür kabına ekilerek hücrelerin yapışması için 24 saat inkübe edildi.
Ertesi gün kızılçam (Pinus brutia) kabuk ekstraktı DMSO ile dilue edilerek 0.1 mg/ml,
0.01 mg/ml ve 0.001 mg/ml doz uygulaması 24 saat süreyle yapıldı. Her dilusyon
üçer kez tekrarlandı. 24 saat sonra ekstrakt içeren kültür mediumu çekilip atıldı. 100
μL yeni medium konularak üzerine 10 μL MTT (M-6494, İnvitrogen) solusyonu
eklendi ve 370
C’de 4 saat süre ile inkübe edildi. Süre sonunda medium ve MTT
solusyonu atılarak her bir kuyucuğa 50 μL DMSO konularak 10 dakika sonra
spektrofotometrede okutuldu.

7. Hücrelere olan toksik etkinin anlaşılması için yapılan MTT testinde artan dilüsyonlarda
toksik etkinin çoğalmayı durdurduğunu ancak hücre ölümünü fazlaca etkilemediğine işaret
etti (Resim 1 ve Tablo 1).
Kızılçam kabuk ekstraktı uygulanan meme
kanseri hücrelerinde hücre ölümü ve
boşluklu alanlar. X400.
Resim 1. Kültür ortamında Kızılçam kabuk ekstraktına maruz kalmış MDA-MB 231
hücrelerinin davranışları.
Tablo 1. Kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücresine toksik etkisinin MTT
analizi ve kültür ortamında MTT formazon reaksiyonunun fotoğrafı.

8. Apoptotik hücre varlığı:
TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre varlığına bakıldı. Bunun için ApopTag® Plus
Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore) kullanıldı.
Hücreler 24 kuyucuklu hücre kültür kaplarına ekildi ve hücrelerin yapışması için bir
gece inkübe edildi. Ertesi gün kızılçam kabuk ekstraktı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve
0.001 mg/ml olacak şekilde uygulandı ve 24 saat bekletildi. Süre sonunda medium
atılarak hücreler % 4’lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra fosfat tamponu
(PBS) ile yıkandı. Yıkandıktan sonra 20-µg/ml Proteinaz-K 370
C’de 15 dak. süre ile
uygulandı. 5’şer dakika 3 kez PBS ile yıkamayı takiben 5 dak. % 3’lük hidrojen
peroksit ile muamele edildikten sonra yeniden 5’şer dakika 3 kez PBS ile oda
ısısında yıkandı. Örnekler 5 dak. Equilibration buffer ile oda ısısında tutulduktan
sonra TdT-enzimi ile nemli atmosferik ortamda 370
C de 60 dak. plastik slipler kesitleri
kapatacak şekilde bekletildi. Sürenin ardından Stop Wash Buffer ile 10 dak.
bekletildikten sonra Antidioksigenin Peroksidaz Konjugatı ile 30 dak. muamele edilen
örnekler 5’şer dakika 3 kez PBS ile yıkandı. Ardından DAB (Diaminobenzidin) ile
boyama yapıldı, birkaç kez distile su ile yıkandı. Hücre çekirdek boyaması Mayer’s
Hematoksileni ile yapıldı. Kör yöntemle TUNEL pozitif hücreler saptandı ve
ortalamalar istatiksel olarak değerlendirildi.
İstatistiksel Analiz: Tüm MTT analizine ait absorbans sonuçları ve apoptotik hücre
sayıları graphpad yazılım programında ortalama ± Standart hata olarak hesaplandı.
MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam
kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış
kontrol boyamalarında negatif boyanma.
X200
MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam
kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı
TUNEL pozitif boyanma. X200

9. MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam
kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış
kontrol boyamalarında negatif boyanma.
X400
MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam
kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı
TUNEL pozitif boyanma. X400
Resim 2. kızılçam kabuk ekstratının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin
TUNEL immunohistokimyasında az miktarda hücrenin pozitif boyandığı bulundu.
Tablo 2. Kızılçam kabuk ekstraktının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin
TUNEL immunohistokimyasında skorlama yapılarak gerçekleştirilen morfometrik
analizinde gruplar arasında anlamlı fark olmadığı izlendi.

10. 3. SONUÇLAR
Hazır halde gelen ekstraktlar katlı dilüsyonlar olarak MDA-MB 231 hücrelerinin
semikonfluent aşamasında üzerine konuldu. Hücreler kontrol olarak kullanılan
sadece besiyeri (BY) ve DMSO çözücüler içinde normal davranışlarını göstererek sıkı
şekilde birbirine yapışarak üremeye devam ettiler. Her kuyucuğa 10000 hücre
yerleştirilerek başlatılan kültürlerde yaklaşık 3 gün içerisinde konfluent olan
hücrelerde kullanılan ekstraktın dilüsyonlarına bağlı olarak bozulmalar ve kayıplar
gözlendi (Resim 1). Ekstraktlar hücrelerin ölüm mekanizması olarak kullandıkları
apoptoz için boyandıklarında (TUNEL) bazı hücrelerin pozitif boyandıkları gözlendi
(Resim 2). TUNEL pozitif görülen hücrelerin skorlama ile yapılam morfometrik
değerlendirmesinde çok fazla hücrenin boyanmadığı ve gruplar arasında farkın fazla
olmadığı görüldü (Tablo 2).
Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik
etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik.
Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını
saptadık.
Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik
etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik.
Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını
saptadık.
Kızılçam kabuğu ekstraktı içerisinde özel bir etken olarak oligomerik
proantosiyanidin (OPC) başta olmak üzere fenolik bileşikler ve flavanoidlerin
bulunduğu birçok çalışma ile gösterilmiştir (Apak ve ark., 2004).
Kızılçam ağacı ekstrelerin MTT analizinde çoğalan hücreyi durdurdukları ve
antiproliferatif etki gösterdikleri önceki çalışmalarda saptanmış olup bir çalışmada
pinusun bir başka türünde de bu etkinin var olduğu ayrıca apoptozuda arttırdığı
görülmüştür (Zhang et al., 2012).
Uzun yıllardır Çin tıbbında etkin olarak kullanıldığı bilinmekte olup in vivo
olarak servikal kanser tanısı konmuş hastalara 158 ve 250 mg/kg dozunda
verildiğinde tümör hacmini azalttığı görülmüş ve bu antitümör etkisi, çoğalma
belirteçlerini ile birlikte oksidatif stres belirteçlerini (süperoksit dismutaz,
malondialdehit) ve apoptoz belirteçlerini (p53, Bcl-2) azaltması ile ilişkilendirilmiştir (Li
et al., 2007).

11. Yapılan bir çalışmada faklı pinus türüne (Pinus massonian) ait kabuk ekstraktı
farklı çözücülerde hazırlanmış ve antitümörojenik etkisi, meme (MDA-MB-231),
servikal (Hela), akciğer(A549) ve karaciğer (BEL-7402) kanser dizinlerinde
araştırılmıştır. Etil asetat fraksiyonu ile elde edilen ekstraktın servikal ve karaciğer
kanser hücreleri üzerine zayıf etki gösterirken suda hazırlanan ekstrakt servikal
kanserde zayıf etkiye sahip olduğu diğer kanser hücrelerine etki etmediği
saptanmıştır (Shen et al., 2010).
Benzer şekilde Eggenschwiler ve arkadaşları, farklı cinslerdeki ağaçlara ait
ekstraktların farklı meme kanseri dizinleri (Kpl-1, MCF-7, Mfm-223) üzerine sitotoksik
etkisini çalışmışlar ve meşe ve elma ağacı ekstraktlarının çam ve göknar
ekstratlarına oranla daha etkili olduğu, kanser hücrelerini öldürdüğü ve immun ve
stress yanıtına ait mRNA seviyelerinin daha iyi olduğu belirlenmiştir (Eggenschwiler
et al., 2006).
Çalışmamızın sonucunda kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan denemelerde
MDA-MB-231 dizin hücrelerinde çoğalmaya ve hücre ölümüne etkisi belirgin olmadığı
ve kanser tedavi edici yönünde etkisinin bulunmadığı saptandı.
Kızılçam kabuk ekstraktının etkisinin diğer hücre dizinleri ile karşılaştırılması
ve önceki çalışmalarda görülen farklı hücre dizinlerinde farklı etki göstermesi
incelenmelidir. Kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan çalışmalarda gösterildiği üzere
oksidatif stres ile ilişkisi ortaya konmalıdır. Hem farklı kanser hücrelerinde hem de
farklı mekanizmalarda olan etkisi İleri tekniklerle araştırılması gerekir.
TÜBİTAK 2209-A Üniversite Öğrencileri Yurt İçi Araştırma Projeleri
Programı’na desteğinden dolayı teşekür ederiz.

12. KAYNAKLAR
Apak R, Güçlü K, Ozyürek M, Karademir SE. Novel total antioxidant capacity index
for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing
capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. J Agric Food Chem.
2004; 52(26):7970-81.
Brinkley BR, Beall PT, Wible LJ, Mace ML, Turner DS, Cailleau RM. Variations in cell
form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Res. 1980,
40(9):3118-29.
Cetin EO, Yesil-Celiktas O, Cavusoglu T, Demirel-Sezer E, Akdemir O, Uyanikgil Y.
Incision wound healing activity of pine bark extract containing topical formulations: a
study with histopathological and biochemical analyses in albino rats. 2013.
Pharmazie Jan; 68 (1) :75-80.
Charles,M.H. Susan, ML. Breast cancer, In "Cancer Treatment", Eds. Charles M
Haskell and Jcmathen S. Berek W. B. Saunders Company, 4th edition, Philadelphia,
1995, p. 323.
Cretu E, Miron SD, Miron A. Bioactivity screening of Pinus brutia bark extracts:
superoxide dismutase-like and nitric oxide scavenging effects. Rev Med Chir Soc
Med Nat Iasi. 2013, 117(2):551-7.
Eggenschwiler J, Patrignani A, Wagner U, Rehrauer H, Schlapbach R, Rist L, Ramos
MH, Viviani A. Gene expression profiles of different breast cancer cells compared
with their responsiveness to fermented mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador
from oak (Quercus), pine (Pinus), white fir (Abies) and apple tree (Malus) in vitro.
Arzneimittelforschung. 2006; 56(6A):483-96.
Guri A, Kefalas P, Roussis V. Antioxidant potential of six pine species. Phytother
Res. 2006, 20(4):263-6.

13. Ilhan G, Karakus S, Andic N. Risk factors and primary prevention of acute leukemia.
Asian Pac J Cancer Prev. 2006, 7(4):515-7.
Karonen M, Hämäläinen M, Nieminen R, Klika KD, Loponen J, Ovcharenko VV,
Moilanen E, Pihlaja K. Phenolic extractives from the bark of Pinus sylvestris L. and
their effects on inflammatory mediators nitric oxide and prostaglandin E2. J Agric
Food Chem. 2004; 52(25):7532-40.
Kasaplıgil, B.1999.Türkiye’nin Geçmişteki ve Bugünkü Çam Türleri. O.G.M. Yayını
No: 674, 99s., Ankara.
Kwak CS, Moon SC, Lee MS. Antioxidant, antimutagenic, and antitumor effects of
pine needles (Pinus densiflora). 2006; 56(2):162-71.
Lacroix, M, Toillon RA, Leclercq G. (2006). "p53 and breast cancer, an
update". Endocrine-Related Cancer 13 (2): 293–325.
Lebo, Stuart E. Jr.; Gargulak, Jerry D. and McNally, Timothy J. (2001). "Lignin". Kirk
Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Inc Erişim tarihi:
2007-10-14.
Li K, Li Q, Li J, Zhang T, Han Z, Gao D, Zheng F. Antitumor activity of the
procyanidins from Pinus koraiensis bark on mice bearing U14 cervical cancer.
Yakugaku Zasshi. 2007 Jul;127(7):1145-51.
Mateus E, Barata RC, Zrostlíková J, Gomes da Silva MD, Paiva MR.
Characterization of the volatile fraction emitted by Pinus spp. by one- andtwo-
dimensional chromatographic techniques with mass spectrometric detection. J
Chromatogr A. 2010, 1217(11):1845-55. doi: 10.1016/j.chroma.2010.01.045.
Neuwirt H, Arias MC, Puhr M, Hobisch A, Culig Z. Oligomeric proanthocyanidin
complexes (OPC) exert anti-proliferative and pro-apoptotic effects on prostate cancer
cells. Prostate. 2008 Nov 1;68(15):1647-54. doi: 10.1002/pros.20829.

14. Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a
herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int J Clin Pharmacol Ther.
2002;40(4):158-68.
Russo J, Russo IH. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary
gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2000,(2):187-200.
Sarıbaş M, Ekici B, 2004. Kızılçam (Pinus brutia Ten.)’in Batı Karadeniz Bölgesindeki
Doğal Yayılışına Katkı. Bartın Orman Fakültesi Dergisi Sayı 1- 2, s. 127- 135, Bartın.
Scalbert A. Antimicrobial properties of tannin. Phytochem. 1991 30:3875-3883
Shen X, Wang Y, Wang F. Characterisation and biological activities of
proanthocyanidins from the barks of Pinus massonian and Acacia mearnsii. Nat Prod
Res. 2010; 24(6):590-8. doi: 10.1080/14786410903194472.
Usta HZ, 1991. Kızılçam (Pinııs brııtia Ten.) Ağaçlandırma alarında hasılat
Araştırmaları, Ormancılık Araştırma Enstitüsü Yayınları, Teknik Bülten Serisi N o.219,
s. 1-36, Ankara.
Virgili F, Kobuchi H, Packer L. Procyanidins extracted from Pinus maritima
(Pycnogenol): scavengers of free radical species and modulators of nitrogen
monoxide metabolism in activated murine RAW 264.7 macrophages. Free Radic Biol
Med. 1998, 24(7-8):1120-9.
Vuorela S, Kreander K, Karonen M, Nieminen R, Hämäläinen M, Galkin A, Laitinen L,
Salminen JP, Moilanen E, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P, Heinonen M. Preclinical
evaluation of rapeseed, raspberry, and pine bark phenolics for health related effects.
J Agric Food Chem. 2005 J;53(15):5922-31.
Zhang JH, Feng DR, Ma HL, Liu B, Wang HB, Xie H, Li RD, Wang JF. Antitumor
effects of Pinus massoniana bark extract in murine sarcoma S180 both in vitro and in
vivo. Am J Chin Med. 2012;40(4):861-75. doi: 10.1142/S0192415X12500644.